拟穴青蟹呼肠孤病毒胶体金免疫层析试剂条及其制备方法、使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测领域，具体涉及一种拟穴青蟹呼肠孤病毒胶体金免疫层析试 剂条及其制备方法和在拟穴青蟹呼肠孤病毒检测上的应用。
【背景技术】
[0002] 拟穴青蟹呼肠孤病毒（Scylla serrata reovirus, SsRV)是拟穴青蟹（以下简称 青蟹）养殖业中造成重大危害的传染病原之一，SsRV引起的青蟹传染性疾病-"清水病"给 青蟹养殖业造成了巨大的经济损失。当前，由于对该流行病本底不清、控制技术研发进展缓 慢，常常在该病的控制上显得无能为力。因此，及早检测SsRV病毒感染，杜绝病毒的传播， 成为当前预防控制"清水病"的首要手段。而最大程度上发现SsRV病毒感染动物，需要提 供简便、有效的检测方法。目前对该疾病诊断一是依靠症状观察进行，等症状出现时疾病已 经发生，而对于该病又没有有效的治疗方法，其经济损失已不可避免。二是将动物组织超薄 切片负染后电子显微镜直接观察组织中的病毒，需要昂贵的仪器和经过严格培训的熟练技 术人员，同时组织观察到病毒时病毒粒子已在组织中大量增殖，动物已经或即将出现症状， 经济损失已不可避免。三是基于核酸扩增的RT-PCR技术，该技术虽灵敏度高，但操作复杂， 需要配套的仪器设备和较为熟练的专业技术人员，不利于该病的现场、农村和基层单位使 用和日常监测。因此，为了准确检测和及时防治青蟹"清水病"，建立一种方便、简单、快速、 准确的检测SsRV方法，对青蟹"清水病"的早期监控具有重要现实意义。
[0003] 胶体金免疫层析技术由于其快速、便捷，不需特殊设备，结果判断直观等优势，越 来越受到人们的重视。迄今为止，还未见有拟穴青蟹呼肠孤病毒免疫胶体金试纸条方法建 立的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的一个技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种通过免疫 胶体金标记技术研制一种操作简单、成本低廉、快捷迅速的检测拟穴青蟹呼肠孤病毒胶体 金免疫层析试剂条。
[0005] 本发明所要解决的另一个技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种制备上 述拟穴青蟹呼肠孤病毒胶体金免疫层析试剂条的方法。
[0006] 本发明所要解决的又一个技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种快速、简 便、准确检测拟穴青蟹呼肠孤病毒免疫层析试剂条的使用方法。
[0007] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该拟穴青蟹呼肠孤病毒胶体金免 疫层析试剂条，其特征在于：该试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维膜、吸收垫、硬质聚氯乙 烯衬板组成，所述结合垫上喷涂有免疫胶体金标记物的抗拟穴青蟹呼肠孤病毒P29蛋白单 克隆抗体，所述硝酸纤维膜包括包被有抗拟穴青蟹呼肠孤病毒P29蛋白多克隆抗体的检测 线和包被有兔抗鼠 IgG抗体的质控线；其中，所述硝酸纤维膜置于硬质聚氯乙烯衬板中间， 所述样品垫设置在所述硬质聚氯乙烯衬板的一侧，而所述样品垫设置在所述硬质聚氯乙烯 衬板的另一侧，所述结合垫平贴于样品垫与硝酸纤维膜之间。
[0008] 本发明提供了一种制备拟穴青蟹呼肠孤病毒胶体金免疫层析试剂条的方法，其特 征在于：该方法包括以下步骤：
[0009] (1)抗原的获得：以SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示序列为引物，用聚合酶链式 反应扩增抗拟穴青蟹呼肠孤病毒P29对应的基因片段，克隆入原核表达载体pET28a (+)，用 IPTG诱导重组大肠杆菌表达，用亲和层析法纯化重组抗原，以获得纯化的大肠杆菌重组表 达的带组氨酸标签的P29基因蛋白His-p29 ;
[0010] (2)制备抗拟穴青蟹呼肠孤病毒SsRV p29蛋白的单克隆抗体：用步骤（1)纯化的 His-p29蛋白免疫Balb/c小鼠，经细胞融合，筛选由保藏号为CGMCC No. 10888的杂交瘤细 胞株1M9产生得到分泌抗拟穴青蟹呼肠孤病毒p29蛋白的单克隆抗体；
[0011] (3)胶体金颗粒的制备：采用柠檬酸三钠作为还原剂制备胶体金溶液，并调整胶 体金溶液的pH至8,备用；
[0012] (4)制备抗拟穴青蟹呼肠孤病毒p29蛋白单克隆抗体的胶体金标记物：将步骤（2) 制得的抗拟穴青蟹呼肠孤病毒P29蛋白的单克隆抗体加入备用的胶体金溶液中，抗拟穴青 蟹呼肠孤病毒P29蛋白的单克隆抗体的质量和胶体金溶液的体积比为1 :100,经纯化和浓 缩后形成胶体金结合标记的抗拟穴青蟹呼肠孤病毒P29蛋白单克隆抗体；
[0013] (5)结合垫的制备：所述结合垫上喷涂的胶体金结合标记的抗拟穴青蟹呼肠孤病 毒P29蛋白单克隆抗体的浓度为I. 5mg/ml，喷涂量为40-50ul/cm ;
[0014] (6)制备抗拟穴青蟹呼肠孤病毒p29蛋白多克隆抗体和兔抗鼠 IgG抗体；
[0015] (7)抗体固相硝酸纤维膜的制备：将抗拟穴青蟹呼肠孤病毒p29蛋白多克隆抗体 包被到硝酸纤维膜上的检测线位置作为检测线捕获抗原，浓度为lmg/ml，喷涂量为2-3ul/ cm ;抗结合抗体的兔抗鼠 IgG二抗喷涂到硝酸纤维膜上的质控线位置作为质控线捕获抗 原，浓度为〇· 75mg/ml，包被参数为l-3ul/cm ;
[0016] (8)将吸收垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维膜、结合垫、样品垫、硬质聚氯乙烯 衬板组装成能检测抗拟穴青蟹呼肠孤病毒P29的胶体金免疫层析检测试纸条。
[0017] 进一步地，所述步骤（3)中胶体金颗粒的制备方法如下：将氯金酸与柠檬酸三钠 按照1 :2的比例混合并加热制成胶体金溶液，制得胶体金的颗粒大小直径为10-20nm。
[0018] 进一步地，所述步骤（4)中抗拟穴青蟹呼肠孤病毒p29蛋白单克隆抗体的胶体金 标记物的制备方法如下：将单克隆抗体加入到步骤（3)中的胶体金溶液中，慢搅混匀，加入 牛血清蛋白，离心后的沉淀用含有1 %牛血清蛋白的磷酸盐缓冲液重悬沉淀，加入重叠氮， 制成胶体金标记的单克隆抗体。
[0019] 进一步地，所述步骤(6)中制备抗拟穴青蟹呼肠孤病毒p29蛋白多克隆抗体的方 法如下：将所述步骤（1)制备的纯化His_p29蛋白作抗原免疫新西兰大白兔：初次免疫取 抗原与等量完全弗氏佐剂充分乳化混匀，在兔子的颈部、背部、后腿内侧多点皮下注射，14 天后用抗原与不完全弗氏佐剂混合，皮下多点注射；7天后再进行1次免疫，免疫剂量和免 疫途径与第2次免疫相同，采集少量血清用做ELISA检测抗体效价；14天后进行第4次免 疫，免疫剂量和免疫途径与第3次免疫相同，14天后进行动物麻醉，通过外科手术方式分离 颈动脉，无菌收集血液，收集到的血液4°C放置2h，然后4°C，3000转/分钟离心15分钟，收 集上清即为制备的抗青蟹呼肠孤病毒多抗血清；多抗血清用辛酸-硫酸铵法初次纯化，和 G-蛋白亲和纯化后，获得高纯度的抗青蟹呼肠孤病毒p29蛋白多克隆抗体。
[0020] 本发明还提供一种使用拟穴青蟹呼肠孤病毒胶体金免疫层析试剂条的方法，其特 征在于：包括如下步骤：
[0021] (1)青蟹样品的预处理：取适量青蟹腮组织样品置于研磨器具中，加入等量的TEN 研磨缓冲液即Tris-EDTA-NaCl，充分研磨匀浆组织制成混悬液，混悬液静置5分钟或离心 后，取上清作为试制条上样液；
[0022] (2)检测：取步骤⑴的上样液100 μ L滴在本发明试纸样品垫上，10分钟后观察 结果，同时分别取适量青蟹呼肠孤病毒液和TEN研磨缓冲液分别作为阳性和阴性对照；
[0023] (3)结果判定：在样品垫上加入检测样品时，在所述检测线呈现红色线时，为青蟹 呼肠孤病毒阳性，即样品中含有青蟹呼肠孤病毒；若检测线不出现红色线时，为青蟹呼肠孤 病毒阴性，即样品中不含有青蟹呼肠孤病毒；若质控线未出现红色线，则试纸无效。
[0024] 本发明拟穴青蟹呼肠孤病毒胶体金免疫层析试剂条的检测原理：
[0025] 将拟穴青蟹呼肠孤病毒快速检测试纸的加样端吸水层插入或在其上滴加 TEN研 磨缓冲液，从青蟹腮组织提取含有病毒粒子的检测样品，根据双抗体夹心免疫层析原理，即 由胶体金结合标记的抗拟穴青蟹呼肠孤病毒P29蛋白单克隆抗体与检测样品液中的抗原 反应，形成由金标单抗-拟穴青蟹呼肠孤病毒复合物，当该复合物层析至硝酸纤维膜上预 先包被在检测线上的抗拟穴青蟹呼肠孤病毒P29蛋白的多克隆抗体处时，此处的抗体会识 别该复合物中抗原，反应的结