用于肝癌的无创诊断的特异性生物标志物组的制作方法
【专利说明】
[0001] 版权声明/许可
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技术领域
[0003] 本发明描述了一种用于检测和定量一组特异性的和新的肝细胞癌（HCC)肿瘤生 物标志物的方法，所述方法通过测量肝癌患者血清中的对应自身抗体来完成。该组生物标 志物包括 Bmil、VCCl、SUMO-4、RhoA、TXN、ET-I、UBE2C、HDGF2、FGF21、LECT2、SODl、STMN4、 中期因子、IL-17A和IL26。更具体地，本发明进一步描述了一种容易获得的高通量和灵敏 的测试试剂盒的设计，以采取患者的外周血清样品来在早期以无创的方式检测肝癌，所述 检测通过测量针对选自所述生物标志物组的至少一种生物标志物的自身抗体进行。本发 明进一步允许鉴定用于分期的特征生物标志物谱，以及检测化疗治疗后的监测期期间的复 发。本发明将支持自动数据分析。
【背景技术】
[0004] 肝细胞癌（HCC)是中国第二普遍的癌症，占总人口的5. 7% [1]。大多数HCC患者 发生快速的肿瘤进展，导致高死亡率。为了提高总生存率，对该疾病的早期诊断变得至关重 要。目前，检测HCC的最普遍方式是血液检查，血液检查测量HCC肿瘤标志物诸如甲胎蛋白 (AFP)的水平。AFP是在胎儿的发育过程中由卵黄囊和肝产生的血浆蛋白，作为血清白蛋白 的一种形式。在正常条件下，AFP水平在出生后逐渐下降并且在成年人中保持低水平。肿 瘤标志物的水平增加指示可能有肝癌。然而，AFP检查的主要问题是过多的假阳性。这是 因为HCC不是导致AFP水平升高的唯一原因，酒精性肝炎、慢性肝炎或肝硬化也与AFP的升 尚相关。
[0005] 尽管AFP检查普遍被推荐用于肝癌的诊断，但其结果并不是结论性的。疑似患者 将需要经历超声成像、CT扫描或对比MRI扫描以进一步确认。取肝活检以区分肿瘤是良性 还是恶性的。然而，对HCC的常规检测具有一些限制性：(a)约20%的肝癌不产生升高水平 的常用HCC肿瘤标志物[2]。（b)病毒性肝硬化会对血液检查产生假阳性结果[3]。（c)超 声不能检测到小的肿瘤[4]。（d) CT扫描需要高的辐射剂量并且对小于Icm的肿瘤不灵敏
[5] 。（e)MRI扫描很昂贵，并且操作很耗时。由于这些限制，需要开发新的具有较高灵敏度 和特异性的生物标志物筛选，目的是早期诊断HCC和/或确定HCC的预后，从而对常规方法 进行补充。
[0006] 与紧靠肿瘤的正常肝上皮细胞相比，HCC肿瘤细胞往往会产生独特的一组蛋白。评 价经验证的HCC肿瘤生物标志物具有有利于HCC诊断的巨大潜力。然而，不是所有生物标 志物本身可以在血清或尿中找到以进行方便的诊断。可选地，特异性针对生物标志物的自 身抗体提供了评价生物标志物的表达的机会。在许多癌症中已经证明肿瘤生物标志物的存 在与针对这些肿瘤抗原的自身抗体的产生有关[6-8]。检测患者血清中的自身抗体将允许 我们更有效地检查生物标志物的存在。理想地，从外周血中检查自身抗体将是在早期以无 创的方式检测肝癌的证据。妨碍生物标志物的临床应用的一个常见障碍是它们在被发现后 并未被验证。但一旦经过验证，这些检查将具有成本效益并且是准确的。原型的设计也支 持高通量筛选。这可以减少常规肝癌诊断所需的成本。
[0007] 下面列举的参考文献偶尔在说明书中引用。这些参考文献的每一篇公开内容都全 部地通过引用合并于本文中。
[0008] [1]Chen JG,Zhang Sff. Liver cancer epidemic in China:past, present and future(中国的肝癌流行病学：过去、现在和未来）.Semin Cancer Biol. 2011; 21(1):59-69
[0009] [2] Okuda K，Peters RL. Human alpha-lfetoprotein (人 α -1 胎蛋 白）· Hepatocellular Carcinoma. 1976:353-67
[0010] [3]Lok AS,Lai CL. Alpha-fetoprotein monitoring in Chinese patients with chronic hepatitis E virus infection:role in the early detection of hepatocellular carcinoma (在患有慢性戊型肝炎病毒感染的中国患者中的甲胎蛋白监 测：在肝细胞癌早期检测中的作用）· ifepatolog. y 1989 ;9:110-115
[0011] [4] Colombo M, de Franchis R, Del Ninno E, Sangiovanni A, De Fazio C, Tommasini M, Donato MF, Piva A, Di Carlo V, Dioguardi N. Hepatocellular carcinoma in Italian patients with cirrhosis(患有肝硬化的意大利患者中的肝细胞癌）· N Engl J Med. 1991 ;325:675-80
[0012] [5] Sahani DV, Kalva SP. Imaging the Liver (对肝脏成像）· The Oncologist. 2004 ；9(4):385-397
[0013] [6]Masutomi K, Kaneko S, Yasukawa M, Arai K, Murakami S, Kobayashi K.Identification of serum anti-human telomerase reverse transcriptase(hTERT) auto-antibodies during progression to hepatocellular carcinoma(对进展至月干细 胞癌期间血清抗人端粒酶反转录酶（hTERT)自身抗体的鉴定）.Oncogene. 2002Aug29 ; 21(38) :5946-50.
[0014] [7] Karanikas V, Khali I S, Kerenidi T, Gourgoul ianis ΚΙ, Germenis ΑΕ. Anti-survivin antibody responses in lung cancer (肺癌中的抗存活素反 应）.Cancer Lett. 2009S印 18 ;282(2) :159-66.
[0015] [8]ffang YQ1Zhang HH1Liu CL1Xia Q, Wu H, Yu XH1Kong ff. Correlation between auto-antibodies to survivin and MUClvariable number tandem repeats in colorectal cancer (在结直肠癌中针对存活素的自身抗体和MUCl可变数目串联重复序列 之间的相关性）· Asian Pac J Cancer Prev. 2012 ;13(11) :5557-62.
【发明内容】
[0016] 在本发明中，提供了一种测量针对一组特异性肿瘤生物标志物的自身抗体以对癌 症进行诊断和分期的检测和定量方法。与正常肝上皮细胞比较，HCC肿瘤细胞往往产生一 组独特的蛋白。对该组独特的蛋白（生物标志物）的评价将对常规诊断方法进行补充并有 利于癌症的早期诊断。
[0017] 通过使用基于二维/质谱法的方法，在本发明中从患者的配对活检（肿瘤活检相 对于毗邻的正常组织）中鉴定了一组肝癌生物标志物，包括Bmi I、VCCl、SUMO-4、RhoA、TXN、 ET-1、UBE2C、HDGF2、FGF21、LECT2、S0D1、STMN4、中期因子、IL-17A 和 IL26。
[0018] 然后验证了此组肝癌生物标志物的特异性和准确性，并一起用于诊断肝癌。在本 发明中，列举的生物标志物的蛋白表达自cDNA克隆，其被纯化并偶联至具有不同发射波长 的荧光微球珠。存在于患者血清中的针对所述蛋白的自身抗体免疫结合于蛋白-珠缀合 物。自身抗体随后与藻红蛋白（PE)-缀合的二抗相互作用。微球珠的特异性荧光信号充当 缀合的生物标志物的标识物。通过测量在复合物处由PE-缀合的二抗产生的荧光强度，能 够检测和定量自身抗体。由于自身抗体是在患者血清中产生的，与HCC肿瘤细胞处的生物 标志物的丰度成正比，因此由较高浓度的自身抗体所产生的较高荧光强度指示对应生物标 志物的较高表达。针对总血清自身抗体的每种生物标志物的最低检测限为约〇. 15ng/mL。
[0019] 与来自健康受试者的血清相比，针对目标生物标志物的自身抗体的水平在癌症患 者中处于较高的浓度。而且，比较来自处于不同时期的肝癌患者的不同血清，可以生成用于 分期的特征谱。因此，本发明允许无创地评价被靶向的肝癌生物标志物。这使得能够检测 处于早期阶段的HCC以及鉴定用于分期的特征生物标志物谱，以及检测化疗治疗后的监测 期期间的复发。
【附图说明】
[0020] 下文参照附图更详细地描述本发明的实施方案，在附图中：
[0021] 图1示出通过二维质谱法发现的肿瘤活检和毗邻的正常组织之间蛋白表达谱的 差异，该法鉴别出在肝癌中上调的15种特异性生物标志物；箭头指示在质谱分析仪的2-D 凝胶上鉴定出的点的位置。
[0022] 图2显示了在本发明中靶向和测量的一组15种经验证的肝癌生物标志物以及它 们的对应分子量。
[0023] 图3显示了从cDNA克隆表达生物标志物的工作流程。
[0024] 图4显示了纯化表达自大肠杆菌的生物标志物的工作流程。
[0025] 图5显示了通过BioPlex系统测量自身抗体的工作流程。
[0026] 图6显示了生物标志物蛋白与BioPlex珠的缀合。
[0027] 图7显示了生物标志物-BioPlex珠缀合物与一抗和PE-缀合的二抗免疫反应的 复合物的图示。
[0028] 图8显示了从被限制性内切酶HindIII和BamHl切割的质粒释放的DNA插入物的 凝胶电泳。
[0029] 图9显示了考马斯蓝染色的SDS-PAGE，证明了异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)对（a)Bmil、（b