肝癌生物标记物及其用途
【专利摘要】本发明涉及一种有利于肝癌诊断的生物标记物miR-182-5p，miR-363-3p，miR-378a-3p，以及其用途可制备用于筛查肝癌或辅助肝癌病理鉴定和临床诊断的试剂盒。试剂盒包括反转录系统和引物系统；反转录系统包括反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂；引物系统由miR-182-5p、miR-363-3p、miR-378a-3p的茎环结构反转录引物、扩增引物以及U6 snRNA的扩增引物组成。本发明确定的miRNA与肝癌临床病例指标的密切相关性，能够作为生物标记物对肝癌患者进行筛查和诊断，为临床个体化干预治疗提供有效依据，并具有定量准确、方便临床应用、取材方便，无创伤性，并可连续体外检测等优点。
【专利说明】肝癌生物标记物及其用途
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术和医学领域，涉及一组肝细胞癌的生物标记物-- microRNAs(miR-182-5p，miR-363-3p，miR-378a-3p)，及其在辅助个体肝癌筛查、临床诊断 与预后判断的应用。
【背景技术】
[0002] 在我国，原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，超过85%的原发性肝癌都是由于 乙型或丙型肝炎病毒感染，长期酗酒和黄曲霉毒素 Bl摄入引起的。由于临床缺乏有效的预 防、检测及治疗手段，大多数患者发现时已属癌症中晚期，且预后较差，死亡率高。据最新统 计全球每年新增约75万肝癌患者，而每年也约有70万人死于肝癌，患者死亡率在所有恶性 肿瘤中居第三位。在临床检查中，AFP(Alpha-Fetoprotein)作为常用的肝癌诊断的血清学 标记物，但其敏感性和特异性差强人意，仅70%左右的肝癌患者血清内的AFP有明显增高， 对于直径小于3cm的肿瘤其敏感性仅为25%，而对于直径大于3cm的肿瘤其敏感性也只有 50%。因此，寻找一种新的更可靠的生物学标记物用于肝癌诊断和预后判断，具有广泛的科 研价值和临床应用前景。
[0003] MicroRNA(miRNA)是一类进化高度保守的，由20-23个核苷酸组成的非编码RNA， miRNA的种子区通过靶向结合mRNA的3'-UTR区来调节靶基因的表达。人类约30%的蛋白 表达受到miRNA的调控，许多研究表明miRNA扮演着癌基因或抑癌基因的角色，能够同时调 节多个基因，通过结合靶mRNA参与调控肿瘤生成过程。目前，不断累积的研究成果已充分 证实miRNA在肿瘤发生与发展过程中呈现出不同的表达水平，具有筛查和诊断肝细胞癌并 对治疗方案的选择和预后分析具有潜在的指示作用。
[0004] 生物标记物是指能将机体的生理和病理状态区分开来的生物分子。筛选到可用于 肿瘤早期发现、早期诊断的生物标记物可大大提高肿瘤患者的临床治疗效果。最新数据显 示肿瘤组织普遍具有特征性的miRNA表达谱，即指肿瘤细胞某几种miRNA的表达水平常与 同一组织中的正常细胞存在显著差异，而特征性的miRNA异常表达可望成为用于肿瘤的诊 断、病理分级、临床分期、疗效与预后的生物标记物，显示了良好的临床应用前景。
[0005] 近年来研究人员发现在血浆和血清中也存在独立于细胞之外并且即使在严酷环 境下也能明显保持稳定的miRNA分子，而作为生物检测样本，血清具有取材方便、无创伤 性、并可连续的体外检测的优点，使得基于miRNA定性和定量检测技术寻找癌症特异性的 血清miRNA作为分子标记的方法比传统的蛋白分子标记方法将更加有效，进而可以克服分 子标记在抗体制备和定量分析上发展所遇到的瓶颈。因此，开发一种可辅助肝癌筛查和诊 断的血清miRNA作为生物标记物，具有广泛的科研价值和临床应用前景。
[0006] 聚合酶链式反应（Q-PCR)不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方 法，也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具。实时荧光定量逆转录聚合酶链反应 技术（RT-qPCR)是一种具有革命性意义的定量PCR技术，将之用于肝癌血清样本中miRNAs 的定量研究，具有较高的敏感性和特异性。因此本研究通过使用实时荧光定量逆转录聚合 酶链反应技术对肝癌患者血清与健康人群血清样本中miRNAs进行表达量验证，结果证实 了 miR-182-5p，miR-363-3p，miR-378a-3p这三条miRNAs在肝癌样本与正常样本中存在差 异（P < 0· 01)。miR-182-5p，miR-363-3p，miR-378a-3p均在肝癌血清中明显高表达，提示 其可能参与调控了肿瘤的发生作用。若能筛选与肝癌病理状态有关的特异或异常表达的 miRNA作为疾病检测的生物标记物，并研制相应的检测试剂盒，将会大大提升肝癌的检测水 平。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种肝癌中可用于稳定、高效率检测肿瘤的生物 标记物 miR-182-5p，miR-363-3p，miR-378a-3p 及其用途。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种有利于肝癌诊断的生物标记物 miR-182-5p，miR-363-3p，miR-378a-3p，其特征序列如下：
[0009] miR-182-5p :UUUGGCAAUG GUAGAACUCA CACU ;
[0010] miR-363-3p ：AAUUGCACGG UAUCCAUCUG UA ；
[0011] miR-378a-3p ：ACUGGACUUG GAGUCAGAAG GC〇
[0012] 本发明还同时提供了上述生物标记物的用途：制备用于筛查肝癌或辅助肝脏肿瘤 病理鉴定和临床诊断的试剂盒。
[0013] 作为本发明miR-182-5p，miR-363-3p，miR-378a-3p的用途的改进：试剂盒包括反 转录系统和引物系统；
[0014] 反转录系统包括反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂；
[0015] 引物系统由miR-182-5p，miR-363-3p，miR-378a-3p的茎环结构反转录引物、扩增 引物以及U6snRNA的扩增引物组成；
[0016] 作为本发明的生物标记物miR-182-5p，miR-363-3p，miR-378a-3p的用途的进一 步改进：试剂盒还包括扩增系统；扩增系统包括含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液。
[0017] 检测该标记物的技术为基于茎环的反转录-荧光定量PCR技术。茎环是指反转录 过程中使用的茎环结构反转录引物，由以下核苷酸序列组成：
[0018] miR-182_5p :
[0019] GTCGTATCCA GTGCAGGGTC CGAGGTATTC GCACTGGATA CGACAGTGTG ；
[0020] miR-363_3p :
[0021] GTCGTATCCA GTGCAGGGTC CGAGGTATTC GCACTGGATA CGACTACAGA ；
[0022] miR-378a_3p :
[0023] GTCGTATCCA GTGCAGGGTC CGAGGTATTC GCACTGGATA CGACGCCTTC。
[0024] 荧光定量PCR技术为DNA染料法。
[0025] 基于DNA染料法的荧光定量PCR检测方法，其中所使用的特异性PCR引物由以下 核苷酸序列组成：
[0026] miR-182-5p PCR 正向引物：GGCTTTGGCA ATGGTAGAAC TC ;
[0027] miR-363-3p PCR 正向引物：GCCAATTGCA CGGTATCCAT ;
[0028] miR-378a-3p PCR 正向引物：GACTGGACTT GGAGTCAGAA G ;
[0029] miRNAs PCR 通用反向引物：CAGTGCAGGG TCCGAGGTAT。
[0030] 在荧光定量PCR检测方法中，使用长106bp的保守性snRNA (U6 snRNA)作为内参 照基因，其PCR引物由以下核苷酸序列组成：
[0031] U6 PCR 正向引物：CTCGCTTCGG CAGCACA ;
[0032] U6 PCR 反向引物：AACGCTTCAC GAATTTGCGT ;
[0033] 本发明的生物标记物可单独用于肝癌的筛查，可辅助肝脏肿瘤病理鉴定和临床诊 断。本发明主要是以miRNA为中心，基于实时荧光定量PCR技术检测和分析miRNA的差异 性表达，主要通过以下步骤实现：
[0034] (a)制备血清样本；
[0035] (b)提取血清样本的总RNA ;
[0036] (c)反转录反应合成cDNA ;
[0037] (d)实时荧光定量PCR检测miRNA在不同样本中的表达变化量。
[0038] 本发明是针对现有肝癌的诊断标记物APF敏感性和特异性不能满足临床诊断的 需要，在研究miRNA在肝癌组织中的差异性表达及与临床病理指数的相关性的基础上所获 得的。
[0039] 本发明所述的肿瘤生物标记物为miR-182-5p，miR-363-3p，miR-378a-3p ;其应用 主要表现在：这三条目标miRNAs在肝癌患者血清与健康人血清中均显示出显著高表达，可 选择单独一条miRNA或者多条miRNAs组合的形式来对肝癌患者进行筛查，用于辅助肝癌病 理鉴定及临床诊断。
[0040] 本发明的技术方案是提供一种用于筛查肝癌患者和鉴定肝癌病理特征的试剂盒， 其由反转录系统，扩增系统和引物系统组成，其中，反转录系统由反转录酶，反转录体系缓 冲液和RNA酶抑制剂组成；扩增系统由含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液组成；弓丨 物系统由miR-182-5p，miR-363-3p，miR-378a-3p的茎环结构反转录引物及miR-182-5p， miR-363-3p，miR-378a-3p 和 U6snRNA 的 PCR 扩增引物组成。
[0041] 本发明通过实验得出以下结论，确定了目标miR-182_5p，miR-363_3p, miR-378a-3p均可作为肝细胞癌筛查的生物标记物，其单独或组合形式均可辅助肝脏肿瘤 临床病理鉴定及诊断。
[0042] I. miR-182-5p，miR-363-3p，miR-378a-3p在肝癌患者血清与健康人血清中表达水 平的差异性分析：
[0043] 本发明运用SPSS 17. 0软件中独立样本T检验，分析了目标miRNA在收集到的52 例肝癌患者血清样本和25例健康人血清样本中表达的差异性。如图1所示，结果表明这 三条目标miRNAs在肝癌血清和正常血清中的表达水平具有显著的差异性，相对差异倍数 分别为 3. 98 (P = 0· 002)，6. 78 (P = 0· 001)，9. 03 倍（P = 0· 001)，ROC 曲线分析结果显示 AUC分别为0. 803 (敏感性=84. 6%，特异性=72. 0% )、0. 845 (敏感性=84. 6%，特异性= 68. 0% )、0. 880(敏感性=82. 2%，特异性=84. 0% )。此外，对比正常组，目标miRNAs在 AFP阴性肝癌患者中的表达量显著上调，这三条目标miRNAs的相对差异倍数分别为3. 01 (P =0.001)，10. 19 (P = 0.002)，10. 68 倍（P = 0.001)，ROC 曲线分析结果显示 AUC 分别为 0.865(敏感性=100%，特异性=72% )、0· 930 (敏感性=100%，specificity = 84% )、 0. 970(敏感性=93. 75%，特异性=92% )，具有较高的诊断准确性。结果表明miRNA的表 达水平可反映肝脏的病理特点，miR-182-5p，miR-363-3p，miR-378a-3p用于区分肝癌患者 和正常对照具有较好的诊断准确性，尤其对AFP阴性肝癌患者也有较高的诊断意义，进而 确定了 miRNA可作为肝细胞癌的生物标记物来指示肿瘤的临床病理情况。
[0044] 2.在不同年龄组、性别、AFP水平、HBV DNA拷贝数及谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平 上对miR-182-5p，miR-363-3p，miR-378a-3p的表达相关性的分析结果显示，目标miRNAs 的表达量与年龄、AFP、HBV DNA拷贝数及谷丙转氨酶水平具有一定的相关性，但与谷草转氨 酶水平不具有相关性（P>〇. 05)。miR-182-5p的相对表达量与年龄（P = 0. 029)、AFP水平 (P = 0. 001)、HBV DNA拷贝数（P = 0. 001)存在负相关；miR-363-3p的相对表达量与年龄 (P = 0. 027)、AFP水平（P = 0. 048)具有负相关，而与谷丙转氨酶（P = 0. 023)存在正相 关。相似的是miR-378a-3p的相对表达量也与AFP水平（P = 0. 001)、HBV DNA拷贝数（P =0. 001)具有负相关而与谷丙转氨酶水平（P = 0. 04)存在正相关。以上相关性分析结果 对研究目的miRNAs与肝癌发生的致病机制具有一定的指示意义。
[0045] 3.用Log2 scale法反映血清样本中miRNA的变化
[0046] Log2 scale是目标miRNA相对于内参基因而言产生的变化以对数反映出来的 一种分析方法，用于揭示目标miRNA是否可作为区分患者和正常肝组织的生物标记物。 Log2scale法即Log2 ( Ct miRNA/Ct mean(U6) }，用于反映 miRNA在肝癌血清相对于正常 血清中产生的差异变化。其中Ct miRNA代表荧光定量检测到的目标miRNA在样本中的Ct 值，而Ct mean(U6)代表内参基因 U6 snRNA在样本中的平均Ct值。
[0047] 用 Log2 scale 法分析可得 miR-182-5p，miR-363-3p，miR-378a-3p，在肝癌患者血 清与正常血清中的表达均有显著性差异，且达到了极显著水平（P〈〇. 001)。本发明人经过 广泛而深入的研究，鉴别和分离了与肝癌相关的miRNA，在此基础上完成了本发明；并通过 miRNA实时荧光定量PCR技术在血清样本中对miR-182-5p，miR-363-3p，miR-378a-3p的表 达水平进行检测，所提供的试剂盒专门针对于miRNA的检测优化，结果准确可靠。
[0048] 本发明的优点为：（1)本发明确定的miRNA与肝癌临床病例指标的密切相关性， 能够作为生物标记物对肝癌患者进行筛查和诊断，为临床个体化干预治疗提供有效依据。 (2)通过实时荧光定量PCR技术对肝癌患者血清中的miRNA的检测，定量准确。相对于芯片 技术或者分子杂交，该方法简便快速且经济实用。（3)由于本发明针对的是肿瘤血清中的 miRNA，由于血清具有取材方便，无创伤性，并可连续体外检测的优点，因此从血清中寻找生 物标记物可以将肝脏肿瘤的筛查和诊断提高至一个新的水平，进而提高治愈率和降低死亡 率。（4)可与其他分子指标相结合，为肝脏肿瘤筛查、诊断、治疗与预后提供新的综合性试剂 盒，方便临床应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0049] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0050] 图I :miR-182-5p，miR-363-3p，miR-378a-3p在肝癌血清样本与正常血清样本中 相对表达差异倍数，相对于正常组，这三条miRNAs的相对表达差异倍数分别为3. 98 (P = 0· 002)，6. 78 (P = 0· 001)，9. 03 倍（P = 0· 001)。
[0051] 图2 :A，miR-182-5p区分肝癌患者和健康对照组的受试者工作曲线分析及曲线下 面积，AUC = 0. 803(敏感性=84. 6%，特异性=72. 0% ) ;B，miR-363-3p区分肝癌患者和 健康对照组的受试者工作曲线分析及曲线下面积，AUC = 0. 845(敏感性=84. 6%，特异性 =68. 0% ) ;C，miR-378a-3p区分肝癌患者和健康对照组的受试者工作曲线分析及曲线下 面积，AUC = 0· 880(敏感性=82. 2%，特异性=84. 0% )。
[0052] 图 3 :miR-182-5p，miR-363-3p，miR-378a-3p 在 AFP 阴性肝癌血清样本与正常血 清样本中相对表达差异倍数，相对于正常组，这三条miRNAs的相对差异倍数分别为3. 01 (P =0· 001)，10. 16 (P = 0· 002)，10. 68 (P = 0· 001)。
[0053] 图4 :A，miR-182-5p区分AFP阴性肝癌患者和健康对照组的受试者工作曲线分析 及曲线下面积，AUC = 0. 865(敏感性=100%，特异性=72% ) ;B，miR-363-3p区分AFP 阴性肝癌患者和健康对照组的受试者工作曲线分析及曲线下面积，AUC = 0. 930(敏感性= 100%，specificity = 84% ) ;C，miR-378a-3p区分AFP阴性肝癌患者和健康对照组的受试 者工作曲线分析及曲线下面积，AUC = 0. 8800.970(敏感性=93. 75%，特异性=92% )。
【具体实施方式】
[0054] 本发明所提供的生物标记物miRNA在制备检测肝癌的临床诊断试剂盒中应用的 具体方法如下：
[0055] 一、实验样本
[0056] 本发明所使用的血清样本来自杭州西溪医院，肝癌血清样本来自52例接受治疗 的肝癌患者，健康人血清样本来自25例体检志愿者。收集5ml全血置于血清收集管；温和 颠倒收集管5-8次；常温下静置30min ;然后将收集管置于离心机1800 Xg常温离心IOmin ; 将获得的血清转移至I. 5mL离心管；13000Xg离心2min ;分离到的血清置于-80°C冰箱保 存待用。样本的具体病理信息见表1。
[0057] 表1样本的病理参数信息
【权利要求】
1. 一种检测肝细胞癌的生物标记物，其特征为三条miRNA，其序列特征为：miR-182-5p :UUUGGCAAUG GUAGAACUCA CACU ; miR-363-3p ：AAUUGCACGG UAUCCAUCUG UA ； miR-378a-3p :ACUGGACUUG GAGUCAGAAG GC。
2. 如权利要求1所述的生物标记物的用途，其特征是：制备用于筛查肝脏肿瘤或辅助 肝脏肿瘤病理鉴定和临床诊断的试剂盒。
3. 根据权利要求2所述的生物标记物的用途，其特征是：所述试剂盒包括反转录系统 和引物系统； 所述反转录系统包括反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂； 所述引物系统由miR-182-5p、miR-363-3p、miR-378a-3p的茎环结构反转录引物、扩增 引物以及U6snRNA的扩增引物组成。
4. 根据权利要求2所述的生物标记物的用途，其特征是：所述试剂盒还包括扩增系统； 所述扩增系统包括含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液。
5. 根据权利要求3或4所述的生物标记物的用途，其特征在于：检测该标记物的技术 为基于茎环的反转录-荧光定量PCR技术。
6. 根据权利要求5所述的生物标记物的用途，其特征在于：茎环结构反转录引物，由以 下核苷酸序列组成： miR-182-5p ：GTCGTATCCA GTGCAGGGTC CGAGGTATTC GCACTGGATACGACAGTGTG ； miR-363-3p ：GTCGTATCCA GTGCAGGGTC CGAGGTATTC GCACTGGATACGACTACAGA ； miR-378a-3p :GTCGTATCCA GTGCAGGGTC CGAGGTATTC GCACTGGATACGACGCCTTC。
7. 根据权利要求6所述的生物标记物的用途，其特征在于：所述荧光定量PCR为DNA染 料法。
8. 根据权利要求7所述的生物标记物的用途，其特征在于：特异性PCR引物由以下核 苷酸序列组成： miR-182-5p PCR 正向引物：GGCITTGGCA ATGGTAGAAC TC ; miR-363-3p PCR 正向引物：GCCAATTGCA CGGTATCCAT ; miR-378a-3p PCR 正向引物：GACTGGACTT GGAGTCAGAA G; miRNAs PCR 通用反向引物：CAGTGCAGGG TCCGAGGTAT。
9. 根据权利要求8所述的生物标记物的用途，其特征在于：在荧光定量PCR检测方法 中，使用保守性snRNA的U6snRNA作为内参照基因，其特异性PCR引物由以下核苷酸序列组 成： U6 PCR 正向引物：CTCGCTTCGG CAGCACA ; U6 PCR 反向引物：AACGCTTCAC GAAITTGCGT。
【文档编号】C12N15/11GK104388561SQ201410647901
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】丁先锋, 朱丽敏, 王青, 甘绍举, 沈建宇, 朱聪 申请人:浙江理工大学