用于癌症治疗的预测性生物标记物的制作方法
【专利说明】
[0001] 说明书
技术领域
[0002] 本发明大体上涉及根据癌症患者是否将对特异性治疗有反应而对癌症患者进行 识别。更具体地，本发明涉及一种用于识别对包含免疫活化DNA构建体的治疗的反应者的 方法和DNA构建体，以及待用于治疗癌症患者的DNA构建体，所述患者在采用所述构建体进 行治疗开始之前单独地表征为可能的反应者。
【背景技术】
[0003] 生物标记物是在血液或其他体液、组织中发现的物质，或作为细胞上的反应者，其 预示症状或疾病例如类似癌症的存在与否。生物标记物可以分为预测、预后和药效生物标 记物。
[0004] 预测标记物被用于评估患者会从特定的治疗中反应或收益的可能性。预后标记物 允许对肿瘤进行分类，考虑它们的攻击潜力以指导对其治疗或决定如何积极地治疗。药效 生物标记物检测药物对肿瘤的短期治疗效果，并且可以用于在新的抗癌药物的临床开发阶 段指导剂量选择。
[0005] 靶向治疗是作用于分子水平的阻止癌症生长或扩散的治疗方法。为了避免不必要 的途径，因为这样的治疗通常涉及使用非常有攻击性的药物，需要能够预测患者会不会对 靶向治疗有反应的工具。
[0006] 鉴于这样的事实，即治疗变得越来越具有靶向特异性，生物标记物的地位将会提 升。它们将帮助实现个体化治疗性途径和打开个体化肿瘤学的道路。甚至从非反应者中区 分对特异性治疗的反应者的可能性将帮助避免患者经受不必要的治疗。
[0007] -种广泛已知且完全批准的癌症治疗方法为化疗法。化疗法的主要缺陷是非常具 有攻击性药物的使用引起了严重的副作用。为了将副作用最小化，在将化学治疗剂的剂量 最小化方面进行了许多努力，例如将化学治疗剂与免疫活化剂联合。一种方法是使用免疫 活化DNA。
[0008] 所谓的未甲基化CG序列已经显示对活化免疫系统非常有效（KriegAM，YiAK， MatsonS，WaldschmidtTJ，BishopGA，TeasdaleR，KoretzkyGA，KlinmanDM;CpGmotifs inbacterialDNAtriggerdirectB-cellactivation；Nature1995Apr6 374 :6522 546-9)。那些序列是从细菌中提取的。EP1 196 178公开了一种共价闭合环DNA带有部分 自补序列，得到了具有带有两端包含未甲基化CG基序的单链环的双链茎的DNA构建体。
[0009]EP1 776 124中提出了使用EP1 196 178的哑铃形DNA构建体与化学治疗剂联合 以治疗癌症。被EP1 196 178的DNA构建体治疗的患者随后接受化学治疗剂。结果是通 过所公开的联合化学治疗剂的用量被减少。但是该文件完全没有公开关于识别患者会不会 对使用的联合治疗有反应的工具。
[0010] 本发明的目的是提供一种预测是否癌症患者会对免疫活化DNA的治疗有反应的 方法。本发明的另一目的是免疫活化DNA本身，其可以用于这样的方法，即在治疗开始之前 治疗被识别为反应者的患者。
[0011] 发明概沐
[0012] 本发明提供了一种通过确定活化的自然杀伤T(NKT)细胞的频率来预测或监测患 癌症或自身免疫疾病的患者是否对TLR-9激动剂的治疗有反应的方法。优选确定用于活化 的NKT细胞的免疫分型的分化群集或指定群集（⑶）分子⑶3+/⑶56+/⑶69+。整个NKT细 胞群体的活化的NKT细胞的比率还可以被确定以评估是否患者会对TLR-9激动剂的治疗有 反应的可能性。
[0013] 其意图在于TLR-9激动剂是DNA构建体，其包括至少一个序列基序N￥CGN3N4,其 中N1#和N3N4是A、C、T和G的任意组合，并且C为脱氧胞苷，G是脱氧鸟苷，A是脱氧腺苷 且T是脱氧胸苷。
[0014] 对TLR-9激动剂治疗有反应者具有的活化的NKT细胞频率为活化的NKT细胞在全 部NKT细胞群体中占至少3%。
[0015] 进一步的意图是可进行先前的使用非DNA药物的诱导治疗。这样的治疗包括使用 或不使用血管再生抑制剂的化学治疗或抗体的使用。
[0016] 本公开的另一目的是TLR-9激动剂在癌症治疗方法中的使用，特征在于患者具有 增加水平的活化NKT细胞。
[0017] 意图是使用的TLR-9激动剂包括至少一种DNA构建体，其包括至少一个序列基序 N'NWN4,其中N1#和N3N4是A、C、T和G的任意组合，并且C为脱氧胞苷，G是脱氧鸟苷， A是脱氧腺苷且T是脱氧胸苷。所述激动剂进一步特征在于N1#是选自包含GT、GG、GA、AT 或AA的组的元件，N3N4是选自包含CT或TT的组的元件。
[0018] 所述激动剂可以包括DNA，其为包含单链或双链DNA的线性开链DNA构建体，或是 包含至少一个具有单链环的末端的线性双链DNA构建体。代替使用环来保护线性双链DNA 的末端，至少一个L-DNA核苷酸可被用作DNA双链的一部分。
[0019] 序列基序N￥CGN3N4可以位于所述DNA序列的单链和/或双链区域内。进一步的 意图是DNATLR-9激动剂的至少一个核苷酸被选自以下的官能团修饰，所述官能团选自包 括羧基、胺基、酰胺基、醛亚胺基、缩酮基、缩醛基、酯基、醚基、二硫基、硫醇基和醛基的组。
[0020] 包括DNA构建体的激动剂可以连接到化合物，所述化合物选自包括肽、蛋白质、碳 水化合物、抗体、脂质、胶束、囊泡、合成分子、聚合物、微弹、金属颗粒、纳米颗粒或固相的 组。
[0021] 进一步的意图是包括DNA构建体的激动剂可为药物组合物的一部分，其中所述药 物组合物可以为疫苗。
[0022] 本公开的另一目的为预测或监测患癌症或自身免疫疾病的患者是否对TLR-9激 动剂的治疗有反应的试剂盒，其包括对活化的NKT细胞在全部NKT细胞群体中的频率进行 检测和定量的工具（means)。
[0023] 所述试剂盒的意图在于所述TLR-9激动剂可以包括DNA构建体，所述DNA构建体 包括至少一个序列基序WfCGN3#，其中N1#和N3N4是A、C、T和G的任意组合，并且C为脱 氧胞苷，G是脱氧鸟苷，A是脱氧腺苷且T是脱氧胸苷。
【附图说明】
[0024] 图1 :verum患者的活化NKT细胞的ROC曲线。
[0025] 图2 :活化NKT细胞对敏感度和特异度。
[0026] 图3:a:对verum和安慰剂的生物标记物阳性患者的Kaplan-Meier图；b:在 verum和安慰剂组的生物标记物阴性患者的Kaplan-Meier曲线。
[0027] 图4:a:verum组的生物标记物阳性患者对生物标记物阴性患者的Kaplan-Meier 图；b:安慰剂组的生物标记物阳性患者对生物标记物阴性患者的Kaplan-Meier图。
[0028] 发明详沐
[0029] 本发明公开的含义中MGN1703表示共价闭合的部分自互补的DNA链的DNA构建 体，所述DNA链具有双链茎和带有未甲基化的CG基序的单链端部环。
[0030] 根据本公开的"茎"应当理解为DNA双链，其通过同一DNA分子内（其然后部分自 我互补）或不同DNA分子内（其部分或完全互补）的碱基配对形成。分子内碱基配对指的 是在同一分子内的碱基配对，而不同DNA分子之间的碱基配对称作分子间碱基配对。
[0031] 在本公开的含义中，"环"应当理解为在茎结构内部或其末端的未配对的、单链的 区域。"发夹"是茎和环的不同组合，其在同一DNA分子的两个自我互补的区域杂交形成具 有未配对的茎时出现。
[0032] "哑铃状"描述在茎区域侧翼两端都具有发夹的线性DNA构建体。因此，本公开上 下文中的"线性DNA构建体"描述在双链DNA茎两端包含单链环的线性哑铃状DNA构建体。
[0033] 本公开的免疫调节指的是免疫活化和免疫抑制。免疫活化优选地指的是活化免疫 系统的效应细胞以便其增殖、迀移、分化或以任何其它方式变得有活性。例如无共