用于微量降解生物样本miniSTR分析的ZNA引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于法医DNA检验分析领域，具体涉及用于微量降解生物样本miniSTR分 析的ZNA引物。
【背景技术】
[0002] 短串联重复序列（shorttandemrepeat，STR)又被称为微卫星 DNA(microsatelliteDNA),是人类基因组中分布较为广泛的一类遗传标记，其核心序列 一般由2~6个碱基组成，核心序列的重复单位数目不同导致同一基因座中存在不同的等 位基因。由于其重复单位较为简单，也被称为简单重复序列（simplesequencerepeats， SSRs)。由于核心单位数目的变化，使STR的长度在人群中变异较大，构成了STR的遗传多态 性，进而成为STR分析技术的生物学基础。STR序列绝大多数分布于基因组非编码区，核心 重复序列呈串联排列，扩增片段一般在400bp以下，目前在法医个人识别及亲子鉴定中得 到了广泛应用。然而在实际应用中，由于物理、化学以及天气等环境因素的影响，检材中DNA 分子易发生降解、断裂，经常得不到完整的DNA分型甚至分型失败，这就给法医学分析带来 了很大的困难。为了解决上述降解生物样本的分型问题，产生了一种新的STR分型技术：在 设计引物时，使其结合在更靠近核心重复序列的侧翼序列，PCR扩增的产物就会比STR基因 座更短一些，即miniSTR技术。
[0003] 虽然miniSTR分型技术在对降解生物样本的分析中获得了很大的成功，但其应用 仍然存在一定的局限性。例如，由于受限于STR核心重复序列的长度，miniSTR的扩增片段 长度不可能无限的减小，这就令不同基因座的miniSTR扩增片段分布更为集中，各个基因 座的等位基因片段长度范围相互重叠的机率比普通STR要高得多。因此基于miniSTR原理 设计的荧光标记复合扩增试剂盒不可能同时容纳很多基因座，一次检验所提供的信息量较 少，必须增加复合扩增的次数。此外，当DNA模板数量很少或者样本扩增产量很低的时候， miniSTR的使用就会受到限制。另外，PCR扩增产物的长度小于150bp的时候，剩余在引物 上的染料分子会对电泳图谱产生影响。而在实际的法医学检案工作中，由于环境因素等影 响，使用的生物样本通常既是降解样本，同时往往也是低拷贝数（(Lowcopynumber，LCN) 样本，S卩DNA含量少于100pg，相当于15个双倍体或30个单倍体细胞的生物样本。
[0004] 为提高LCN生物样本的法医学STR分型的灵敏度和成功率，通常采用两种策略。一 种是增加PCR反应的循环次数，提高STR基因座扩增成功率和产物量，而后进行DNA分析。 虽然增加PCR循环数能够提高LCN样本的STR成功检出率，但存在以下风险：实验室环境 和操作污染对样本STR分型的干扰作用变得更加明显；非特异产物大量积累，分型精确性 大幅下降；分型结果中易出现等位基因扩增不均衡、甚至丢失的现象。另一种策略是首先进 行LCN样本的全基因组扩增，获取足量的DNA模板，而后进行STR分型。这种策略也存在一 些实际应用的缺陷：发生等位基因丢失；针对特定类型检材的全基因组扩增技术尚不明确 等。
[0005] 法庭科学STR基因组的选取需要考虑众多因素，其中首要因素是STR基因座的个 体识别力（Powerofdiscrimination，^))。美国联邦调查局（FBI)在1997年选定了 13个 核心STR基因座用于建立DNA联合索引系统（CODIS) :CSF1P0、D3S12358、D5S818、D7S820、 D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21Sll、FGA、HUMTH01、TP0X、Vwa。为进一步增强区分 度，FBI随后又在C0DIS数据库中加入了基因座D2S1338和D19S433。目前常用的商品化 STR复合扩增试剂盒，如ABI公司的IdentifilerTM以及Promega公司的PowerPlex丨6? 等，均包括上述13个核心STR基因座。然而STR基因座的多态性在不同种族和人群中存在 明显的差异，上述STR基因座的选取主要是基于西方人群所选定的，在实际应用中并不一 定适用于中国人群。
[0006] 未解决上述问题，中国专利公告CN1327005C公开了一种荧光标记STR基因座的复 合扩增检验系统，该系统包括14个适合中国人群的STR基因座。该系统使用的DNA引物 能够将相应基因座扩增产物控制在400个碱基（bp)的范围内，灵敏度达到0.125ng。该系 统虽然提供了适合中国人群的STR基因座，但是由于其检测灵敏度的限制，难以实现对LCN 样本的检测。
[0007]ZNA(ZipNucleicAcids)是一种新型的寡核苷酸衍生物，是通过在DNA分子的核 苷酸上偶联阳离子环形结构的精胺衍生物（Z-unit)而获得，ZNA分子的结构示意图如图1 所示。Z-unit的偶联部位既可以在DNA分子5'或者3'末端的核苷酸上，也可以位于中间 部位的核苷酸上。与DNA分子一样，ZNA分子也具有相同的严格配对选择性（A-T或G-C); 此外，ZNA分子还具有相交于DNA分子更高的Tm值以及快速动力学的特征。虽然ZNA分子 与DNA分子具有相似的配对选择性，但目前未有将ZNA引物设计用于miniSTR分型技术的 研究报道。
[0008] 综上所述，虽然STR分型技术在法医DNA检验分析领域中有重要意义，然而目前建 立起的商品化扩增系统或试剂盒多数是针对西方人群，在实际使用中并不适合中国人群； 少数适合中国人群的检测系统，无法同时满足对微量（或低拷贝数）以及高度降解生物样 本的STR分型；虽然ZNA分子与DNA分子具有相似的特性，但目前所有的STR分型系统均采 用常规DNA引物。
【发明内容】
[0009] 除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的 普通技术人员通常理解的相同意义。
[0010] 本发明中的A+、T+、G+和C+分别代表偶联了Z-unit的腺嘌呤核糖核苷酸、胸腺嘧 啶核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸和胞嘧啶核糖核苷酸。
[0011] 本发明要解决的一个问题是提供一组适用于中国人群个体识别的STR基因座，为 了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0012] 一组适用于中国人群个体识别的STR基因座，包括：D10S1248、D2S441、D1S1677、 D6S474、D2S1776、D1S1627、D3S4529、D9S2157、D9S1122、D10S1435、D12ATA63 和D20S1082 共12个非C0DIS系统STR基因座。
[0013] 使用东北、西北、西南、中南和华东汉族人群以及藏族、蒙古族、土家族、撒拉族、哈 萨克、白族、维族、俄罗斯族等少数民族群体样本对上述12个STR基因座进行多态性验证。 并按照法医学DNA检验对STR基因座的要求，对上述基因座的个体识别力（DP)、非父排除率 (EPP)、多态性信息含量（PIC)、预期杂合度（HE)、观察杂合度（HO)等法医学参数进行统计 分析，结果见下表：
[0014]表1 12个STR基因座的法医学参数
[0017] 验证结果显示：上述12个STR基因座的等位基因频率均符合Hardy-Weinberg平 衡，在中国主要人群中且具有较高的多态信息和个体识别率，更加适合中国人群的群体遗 传学特征。
[0018] 本发明要解决的另一个问题是提供用于上述12个STR基因座的miniSTR分型技 术的DNA引物，使得12个STR基因座扩增产物长度在71~161bp之间，为了解决上述技术 问题，本发明采用的技术方案如下：
[0019] 所述的DNA引物的核苷酸序列与扩增产物信息如下：
[0020] D10S1248基因座的DNA引物为：
[0021] 正向引物 5' -TTAATGAATTGAACAAATGAGTGAG-3'（SEQIDNO:1);
[0022] 反向引物 5' -GCAACTCTGGTTGTATTGTCTTCAT-3'（SEQIDNO:2);
[0023] 扩增产物长度为79~123bp。
[0024]D2S441基因座的DNA引物为：
[0025]正向引物 5' -CTGTGGCTCATCTATGAAAACTT-3'（SEQIDNO:3);
[0026]反向引物 5' -GAAGTGGCTGTGGTGTTATGAT-3'（SEQIDNO:4);
[0027] 扩增产物长度为78~110bp。
[0028] D1S1677基因座的DNA引物为：
[0029] 正向引物 5' -TTCTGTTGGTATAGAGCAGTGTTT-3'（SEQIDNO:5);
[0030]反向引物 5' -GTGACAGGAAGGACGGAATG-3'（SEQIDNO:6);
[0031] 扩增产物长度为78~llObp。
[0032] D6S474基因座的DNA引物为：
[0033]正向引物 5' -GGTTTTCCAAGAGATAGACCAATTA-3'（SEQIDNO:7);
[0034]反向引物 5' -GTCCTCTCATAAATCCCTACTCATATC-3'（SEQIDNO:8);
[0035] 扩增产物长度为107~136bp。
[0036] D2S1776基因座的DNA引物为：
[0037]正向引物 5' -TGAACACAGATGTTAAGTGTGTATATG-3'（SEQIDNO:9);
[0038]反向引物 5' -GTCTGAGGTGGACAGTTATGAAA-3'（SEQIDNO:10);
[0039] 扩增产物长度为127~161bp。
[0040] D1S1627基因座的DNA引物为：
[0041]正向引物 5' -CATGAGGTTTGCAAATACTATCTTAAC-3'（SEQIDNO:11);
[0042]反向引物 5' -GTTTTAATTTTCTCCAAATCTCCA-3'（SEQIDNO:12);
[0043] 扩增产物长度为81~lOObp。
[0044] D3S4529基因座的DNA引物为：
[0045]正向引物 5' -CCCAAAATTACTTGAGCCAAT-3'（SEQIDNO:13);
[0046]反向引物 5' -GAGACAAAATGAAGAAACAGACAG-3'（SEQIDNO:14);
[0047] 扩增产物长度为111~139bp。
[0048] D9S2157基因座的DNA引物为：
[0049]正向引物 5' -CAAAGCGAGACTCTGTCTCAA-3'（SEQIDNO:15);
[0050]反向引物 5' -GAAAATGCTATCCTCTTTGGTATAAAT-3'（SEQIDNO:16);
[0051] 扩增产物长度为71~107bp。
[0052] D9S1122基因座的DNA引物为：
[0053]正向引物 5' -GGGTATTTCAAGATAACTGTAGATAGG-3'（SEQIDNO:17);
[0054]反向引物 5' -GCTTCTGAAAGCTTCTAGTTTACC-3'（SEQIDNO:18);
[0055] 扩增产物长度为93~125bp。
[0056] D10S1435基因座的DNA引物为：
[0057]正向引物 5' -TGTTATAATGCATTGAGTTTTATTCTG-3'（SEQIDNO:19);
[0058]反向引物 5' -GCCTGTCTCAAAAATAAAGAGATAGACA-3'（SEQIDNO:20);
[0059] 扩增产物长度为82~139bp。
[0060] D12ATA63基因座的DNA引物为：
[0061]正向引物 5' -GAGCGAGACCCTGTCTCAAG-3'（SEQIDNO:21);
[0062]反向引物 5' -GGAAAAGACATAGGATAGCAATTT-3'（SEQIDNO:22);
[0063] 扩增产物长度为76~106bp。
[0064] D20S1082基因座的DNA引物为：
[0065]正向引物 5' -ACATGTATCCCAGAACTTAAAGTAAAC-3'（SEQIDNO:23);
[0066]反向引物 5' -GCAGAAGGGAAAATTGAAGCTG-3'（SEQIDNO:24);
[0067] 扩增产物长度为73