Erg基因检测探针及其制备方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术，特别是涉及ERG基因检测探针及其制备方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 前列腺癌是老年男性常见的一种恶性肿瘤性疾病。在欧美国家，前列腺癌死亡率 在各类恶性肿瘤疾病中居于第二位。我国前列腺癌的发病率远低于西方国家；但由于饮食、 环境和生活习惯等因素的改变，近年来发病率显著上升趋势。国内前列腺癌的分期特点和 生存率共同显示，就诊患者多为晚期的前列腺癌患者，治疗效果不佳。因此，在早期检测前 列腺癌已成为一项重要的课题。TMPRSS2基因与ETS融合一般仅存在于前列腺癌中，其它肿 瘤、良性前列腺增生和正常上皮中不出现。它是前列腺癌发生的早期事件，通过检测该异常 发生，可以提高临床检测的灵敏度和特异性，为临床提供相比PSA筛查和穿刺活检更为准 确、客观的诊断指标。但检查中需注意，ERG基因重排在不同种群、不同样本群中阳性率有 差异，可能与基因变异的多因素影响、疾病分级、前列腺癌的高度异质性、样本来源、检测方 法相关。
[0003] 前列腺癌的发病年龄往往在65岁以上，因为年龄原因，很多病人的死亡原因并非 前列腺癌，而是并发其他疾病造成死亡。因此，手术治疗并非适合于所有病人。学术界对于 TMPRSS2-ETS融合基因在前列腺癌中的预后意义存在争议，多数认为与预后不良相关，研究 提示缺失较断裂生存更差、复发时间更短；重排与低Gleason评分相关，拷贝数增加与高级 别或晚期肿瘤相关；研究各病灶间ERG重排类型（缺失、断裂）差异可作为独立的预测转移 指标。
[0004]TMPRSS2-ETS可指导阿比特龙（abiraterone)用药。简言之，前列腺癌的临床病理 的标准，包括Gleason评分不足以区分患者是否需要立即和积极治疗，从而导致过度治疗。 TMPRSS2-ETS融合作为前列腺癌发病的早期事件具有独特和重要的临床价值，通过对疑似 前列腺癌患者、具家族史高危人群进行检测，可以作为前列腺癌诊断、预后判断、患者分层 和治疗方案选择的重要生物标志物，弥补其它检测方法的不足。
[0005] 用于前列腺癌早期诊断的主要方法有血清前列腺特异性抗原（PSA)筛查、直肠指 诊（DRE)、穿刺活检及荧光原位杂交法（FISH)检测相关基因等。血清PSA检测已作为前列腺 癌筛选指标广泛应用于临床，但PSA具有器官特异性，而非肿瘤特异性，前列腺良性疾病和 药物因素也可导致血清PSA升高；DRE是诊断前列腺癌的首要步骤，但灵敏度和特异性低， DRE发现的前列腺癌只有33%被证实为早期局限性；穿刺活检是对PSA和DRE测定后怀疑 为前列腺癌的一种定性检查，可以了解癌组织范围和病理分级等，是前列腺系统穿刺活检 术的"金标准"，有较高的特异性，但同时也存在出血、发热和脓肿等并发症。Tomlins等利 用癌基因异常特征分析技术，证实在前列腺癌中发现跨膜丝氨酸蛋白酶编码基因TMPRSS2 与ETS转录因子家族成员ERG、ETV1和ETV4之间发生融合，而良性前列腺增生标本中并检 测不到该融合基因，因此具有很高的特异性。目前融合基因检测主要有RT-PCR和FISH两 者方法。RT-PCR对样本要求较高部分甲醛固定、石蜡包埋标本因RNA降解影响结果的可靠 性，不能直接显示标本组织形态学的关系；灵敏度高，易造成假阳性。而FISH技术具有客 观、灵敏度高（单个细胞内）、准确性好（直接检测基因状态）、重复性好（标准化操作不受 RNA稳定性影响）、无创等优点，因此应用FISH技术检测前列腺组织中是否存在TMPRSS2和 ETS位点的基因重排将具有更高的特异性。Perner等对136例前列腺癌病例分别用RT-PCR 以及FISH方法进行检测，发现在原发性前列腺癌中PCR检测TMPRSS2-ERG融合基因的检出 率为49. 2%，而FISH的检出率为60. 3%。
[0006] 荧光原位杂交技术基于碱基互补原则，用已知序列标记DNA探针与载玻片上的待 测DNA/RNA互补杂交，在荧光显微镜下检测杂交信号判断结果。FISH技术将细胞遗传学和 分子生物学改变联系起来，让微小的基因改变显现于肉眼之下，拓展了细胞遗传学检测的 范围，显著提高了其识别异常染色体的能力。目前已被广泛应用于肿瘤研究中的基因扩增、 易位重排及缺失等检测。
[0007] 国外FISH技术成熟，检测方法进展很快，检测的精确率也不断提高。各种商业化 的探针种类繁多，FISH检测因其无创、特异、重复性高、操作简单等优点，在临床上已经逐渐 取代一些传统方法，成为某些肿瘤的诊断方法。如WHO推荐使用FISH技术作为诊断软组织 肉瘤和淋巴造血系统肿瘤的方法；FISH检测是目前公认的最为准确的HER-2检测方法，是 个体化治疗的金标准。目前，CFDA和CE认证的FISH检测试剂和相关产品极多，较好的满 足了临床和科研的需要。国内FISH技术相对于国外起步较晚，应用主要集中在基础医学研 究领域。不过，通过这一阶段的发展，已经为临床检测积累了大量科学数据和试验方法，技 术上益趋成熟，也出现了基于该技术的检测试剂，但种类少，质量相对于国外试剂也有较大 的差距。这些问题对于满足国内市场需求和推广临床应用极为不利。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的之一是提供一种ERG基因检测探针及其制备方法，所制备的探针可 用于检测ERG基因状态，即ERG基因重排的检测，实现细胞和/或染色体中直接观察信号类 型。
[0009] 实现上述目的的技术方案如下。
[0010] 一种ERG基因检测探针的制备方法，包括以下步骤：
[0011] (1)选取两组BAC克隆，其中一组为RP11-720N21和CTD-2556C4中至少一种，另一 组为RP11-360N24和RP11-110N12中的至少一种；
[0012] (2)对克隆分别提取质粒，得到质粒DNA，定量；
[0013] (3)用荧光素标记质粒DNA，两组质粒DNA所标记的荧光素不相同，同组质粒DNA 所标记的荧光素相同，即得。
[0014] 在其中一个实施例中，其中一组所述BAC克隆为RP11-720N21和CTD-2556C4。
[0015] 在其中一个实施例中，其中一组所述BAC克隆为RP11-360N24和RP11-110N12。
[0016] 在其中一个实施例中，标记荧光素选择本领域已知的荧光染料，优选地，荧光素为 AlexaFiu〇r?488、.FITC、AlexaF丨ll〇r?555、Rhodamine、TexasRed、pacificblue?, DEAC〇
[0017] 在其中一个实施例中，基因探针的标记可以采用现有技术中的方法将相应荧光素 标记至双链核酸上，所述方法包括但不限于：随机引物法、切口平移等，标记基因探针可以 使用市售的缺口平移标记试剂盒和/或随机引物标记试剂盒，优选abbott和/或Roche公 司的NickTranslationKit。本发明步骤（3)优选采用随机引物法、切口平移法对质粒DNA 进行荧光素标记。
[0018] 本发明的另一目的是提供一种ERG基因检测试剂盒。
[0019] 实现该目的技术方案如下。
[0020] 一种ERG基因检测试剂盒，包括有上述ERG基因检测探针。
[0021] 在其中一个实施例中，还包括有用于封闭重复序列的COTHumanDNA，和DAPI复染 剂。
[0022] 本发明具有以下有益效果：
[0023] 1、本发明通过筛选到最优的ERG基因重排检测探针及其组合，采用 FISH(FluorescenceIn-SituHybridization)方法对ERG基因重排进行检测，信号计数行 准确、快速，且结果的重复性好；补充了临床中检测试剂依赖进口的不足，有利于后续该检 测探针应用于临床研究，进行前列腺癌早期诊断、治疗选择等方面。
[0024] 2、通过本发明所述的ERG