交仪中，湿润原位杂交仪湿度条，插入湿条，盖上杂交仪上 盖，设置"Denat&Hyb"程序，变性85°C5分钟，杂交37°C10~18小时。（若无杂交仪，可使 用替代仪器，如恒温热台进行变性，电热烘箱/或水浴锅进行杂交，需注意温度准确及保持 杂交湿度）。
[0084] 3、杂交后洗涤及复染（避光操作）
[0085] 3. 1洗涤前30分钟，将配制好的洗液I，洗液II，放入37±1°C的水浴中，测量以确 保温度合适；
[0086] 3. 2关闭杂交仪电源，将玻片取出，轻轻撕去橡皮胶，移去盖玻片（若盖玻片难以 去除，可以将其放入洗液I中微微摇晃，以利于其脱落；
[0087] 3. 3玻片放入37 ± 1 °C洗液I(2XSSC)中10分钟；
[0088] 3. 4取出玻片，再将其放入37±1C洗液II(0.1%NP-40/2XSSC)中5分钟；
[0089] 3. 5取出玻片，室温70%乙醇中3分钟；
[0090] 3. 6取出玻片，暗处自然干燥玻片；
[0091] 3. 7室温，滴加10μ1DAPI复染剂到22X22mm的盖玻片，载玻片目标区域朝下， 轻放于盖玻片上，轻压，避免产生气泡，在暗处存放，待观察。
[0092] 4、结果分析
[0093] 相关荧光和DAPI需用合适的滤块观察。
[0094] 1.使用合适的滤镜，在10X物镜下寻找，在100X物镜下计数；
[0095]2.调整合适的焦距，对信号和背景有明确的概念；信号点应位于细胞内；当细胞 外存在荧光信号点时，要注意与细胞内信号点区分，最好能避开该区域进行计数；
[0096] 3.扫视几个细胞区域，要求细胞边界完整、无重叠，DAPI染色均匀，绿色和红色信 号清晰；跳过信号弱及没有特定信号或高背景的细胞计数；需要主观辨别的细胞不计数；
[0097] 4.从选择区域的左上角开始分析，从左到右扫视，观察多个视野；
[0098]5.转到100X物镜，调整焦距，在核的不同层次找到所有信号点；
[0099] 6.在每个细胞内计数信号点；调焦找到每个细胞内的所有信号点，计数一个区域 内的两种信号，只计数每种颜色有1个或更多FISH信号的，没有信号或只有单种颜色信号 的细胞不计数；记录观察到的细胞总数（正常及异常信号数目）。
[0100] 6. 1正常信号：红色信号和绿色信号相邻或融合（双通滤块下观察红绿信号重叠 呈黄色融合信号或红绿信号相邻距离小于单个信号直径时认为单个融合信号）；
[0101] 6. 2异常信号：至少有一组红色信号和绿色信号相距大于一个或更多信号直径， 红绿信号分裂，如1F1R1G;至少有一组红绿融合信号和一个及以上绿色信号，红色信号缺 失，如lFnG(n彡 1)。
[0102] 7.设定阴性阈值
[0103] 随机选取10例以上的前列腺增生样本当阴性质控片。每张阴性质控片随机计数 信号完整的100个细胞，统计每例样本中出现异常信号细胞的数目及百分比，统计百分比 的平均值及标准差，阴性阈值设定为平均值+3倍标准差。
[0104] 实施例4 :ERG基因检测试剂盒临床使用评价
[0105] 使用实施例1所述两组检测探针，实施例2所述检测试剂盒对20份临床样本（福 尔马林固定石蜡包埋组织样本，其经过病理检测确诊，具体见下表），进行检测。根据实施 例3的检测方法重复检测3次，结果相符，检测结果的重复性好；两种探针组合的检测一致 性佳。图3为检测信号类型为2F，ERG重排检测阴性。图4为检测信号类型为1G1F，ERG重 排检测阳性。
[0106]
[0107]
[0108] 从检测结果可知，在对这些样本进行分子标志物检测后，可以据检测结果对样本 进行分子分型，依据检测指标的意义，用于临床治疗方案制定、用药选择和疗效判断。
[0109] 本发明中，分别各使用ERG基因两组探针中的一种探针也能实现相应的检测，具 体结果省略，但相对探针组合使用而言，组合探针的使用，检测信号会更好。理论上探针长 度越长，实际检测时获得的荧光信号亮度越明亮，但因为可能涉及到更多基因序列，所得到 的信号复杂性可能性增多，对检测实现的难度也增强。本发明所述针对ERG基因的组1和 组2的检测探针的BAC克隆总长度分别为：325Kb和266Kb，为包含ERG基因断裂位点两端 序列的核酸混合物。
[0110] 发明人在对本发明所述探针验证中发现，较长的检测探针确实获得更强的荧光信 号，并且在对临床样本的检测验证中也获得了相同的结果。因此，在荧光探针的设计中，可 以通过适当延长荧光探针长度增加信号亮度，但具体如何组合使用，存在的一定的技术困 难，要实现很好的检测结果，除了设计中的经验之外，还需通过临床样本验证评估信号类型 差异，需要发明人付出大量艰辛的工作，寻求合适的探针组合。
[0111] 所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例 中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛 盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0112] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护 范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种ERG基因检测探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)选取两组BAC克隆，其中一组为RP11-720N21和CTD-2556C4中至少一种，和另一组 为 RP11-360N24 和 RP11-110N12 中的至少一种； ⑵对克隆分别提取质粒，得到质粒DNA，定量； (3)用荧光素标记质粒DNA，两组质粒DNA所标记的荧光素不相同，同组质粒DNA所标 记的荧光素相同，即得。2. 根据权利要求1所述的ERG基因检测探针的制备方法，其特征在于，其中一组所述 BAC 克隆为 RP11-720N21 和 CTD-2556C4。3. 根据权利要求1所述的ERG基因检测探针的制备方法，其特征在于，其中一组所述 BAC 克隆为 RP11-360N24 和 RP11-110N12。4. 根据权利要求1-3任一项所述的ERG基因检测探针的制备方法，其特征在于， 所述焚光素为 Alexa FlllOr? 488、FITC、Alexa 555、Rhodamine、Texas Red、 pacific biue_?、DEAC05. 根据权利要求1-4任一项所述的制备方法得到的ERG基因检测探针。6. 根据权利要求5所述ERG基因检测试剂盒，其特征在于，还包括有用于封闭重复序列 的 COT Human DNA，和 DAPI 复染剂。
【专利摘要】本发明涉及ERG基因检测探针及其制备方法，该方法包括以下步骤：选取两组BAC克隆，其中一组为RP11-720N21和CTD-2556C4中至少一种，和另一组为RP11-360N24和RP11-110N12中的至少一种；对克隆分别提取质粒提取，得到质粒DNA，定量；用荧光素标记。本发明还公开了包含有ERG基因检测探针的试剂盒。本发明通过筛选到最优的ERG检测探针，信号计数行准确、快速，且结果的重复性好；补充了临床中ERG突变检测的不足，有利于筛选更多受益于靶向药物的患者，提高患者生存率和总生存期。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105420398
【申请号】CN201511033942
【发明人】何瑰, 陈绍宇, 张会清
【申请人】广州安必平医药科技股份有限公司
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月30日