一种基于il-18基因调节武定鸡抗沙门氏菌能力的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于动物分子育种的基因工程技术领域，特别涉及一种基于IL-18基因调节武定鸡抗沙门氏菌能力的方法。
【背景技术】
[0002]近年来，由于家禽产业的选育工作正处在从传统家禽业向现代家禽业转型的过程中，过度追求快大型鸡种的选育，导致家禽抗病力的严重下降。目前抗病育种已得到越来越多的认识和重视，因此，免疫抗病研究是现代家禽育种研究的一大热点。由于家禽的品种、养殖环境、饲料等都会在实际生产过程中对禽类的抗病力产生影响，但禽类机体自身固有免疫代谢能力在机体抗病效应中的表现中有着举足轻重的地位。机体的免疫反应是一个复杂而强大的体系，在整个免疫过程中，有大量的器官、细胞、基因、蛋白等参与，也使得整个过程更加的完整有效。当免疫反应发生时，首先是对于抗原的识别，随后启动淋巴细胞增殖，免疫蛋白大量分泌、运输，最后通过特异的抗体进行抗原反应解决外源异物的入侵。在此过程中，伴随着大量基因的表达与抑制。因此，IL-18基因的发现对阐明机体免疫应答水平的调控机理具有重要的意义，同时将为畜牧业从抗病育种方向开辟一条新途径。
[0003]白细胞介素18(Interleukin-18，IL-18)，又称为 IFN-C 诱导因子(IFN-C-1nducingfactor，IGIF)是一种具有多方向和多层次免疫调节功能的细胞因子，主要由巨噬细胞和Kupffer细胞产生。它对多种细胞尤其是免疫细胞具有多项性作用，从而在增强免疫机能、抗肿瘤、抗感染等方面发挥重要的作用。研究表明，IL-18基因能提高机体对疫苗的免疫应答能力，提高细胞的免疫力和疫苗的保护率，显著促进T、B淋巴细胞的增殖反应，从而增强机体抗病毒感染能力。目前，IL-18基因已在多种动物中被定位和标记。在畜禽育种过程中，由于对畜禽生长速度过度选择，对抗生素等的大量使用，导致畜禽机体免疫能力下降，畜禽机体抗药性增强。因此，IL-18基因的研究对控制畜禽快速增长，改善机体免疫能力具有重要的意义。目前IL-18基因的表达对增强机体免疫能力的影响及抗菌机理，国内外尚未见报道。
【发明内容】
[0004]本发明根据IL-18基因的表达对增强机体免疫能力的影响及抗菌机理，IL-18基因在动物分子育种中作为调节武定鸡抗沙门氏菌能力强弱的应用，通过测定武定鸡脾脏、胸腺、法氏囊三个组织中IL-18基因的相对表达量，判断武定鸡抗沙门氏菌能力与IL-18基因的相对表达量的关系，IL-18基因的相对表达量多的武定鸡抗沙门氏菌能力强，IL-18基因的相对表达量少的武定鸡抗沙门氏菌能力弱，并且对脾脏中IL-18基因的相对表达量小于2.2或胸腺中IL-18基因的相对表达量小于3.6或法氏囊中IL-18基因的相对表达量小于7.0的武定鸡，对其进行肌注灭活沙门氏菌，使得武定鸡脾脏中IL-18基因的相对表达量不小于
2.2，胸腺中IL-18基因的相对表达量不小于3.6，法氏囊中IL-18基因的相对表达量不小于7.0，使得武定鸡IL-18基因的相对表达量增多，增强武定鸡抗沙门氏菌的能力。
[0005]为了达到上述目的，本发明提出如下技术方案:
[0006]所述的基于IL-18基因调节武定鸡抗沙门氏菌能力的方法包括以下具体步骤为:
[0007]1)免疫器官中总RNA的提取
[0008]选取同一批次出壳的武定鸡健康鸡只100只进行隔离饲养，利用RNA提取试剂提取武定鸡免疫器官总RNA，将提取的RNA反转录成cDNA，_20°C保存；
[0009]2)RT_PCR 引物设计
[0010]根据GenBank中武定鸡IL-18序列信息，利用Primer Premier 5.0设计引物，并合成，合成后进行荧光定量PCR，荧光定量PCR的反应条件为:94°C预变性3min; 94°C变性30s，59.2°C退火30s、72°C延伸30s，39个循环;72°C后延伸7min进行扩增；
[0011]3)定量检测
[0012]检测武定鸡脾脏、胸腺、法氏囊三个组织中IL-18基因的相对表达量；
[0013]4)肌注灭活沙门氏菌
[0014]对脾脏中IL-18基因的相对表达量小于2.2或胸腺中IL-18基因的相对表达量小于3.6或法氏囊中IL-18基因的相对表达量小于7.0的武定鸡，对其进行肌注灭活沙门氏菌，使得武定鸡脾脏中IL-18基因的相对表达量不小于2.2，胸腺中IL-18基因的相对表达量不小于3.6，法氏囊中IL-18基因的相对表达量不小于7.0，增强武定鸡抗沙门氏菌的能力。
[0015]进一步，在步骤1)中所述的RNA提取试剂为:RNAiso Plus。
[0016]进一步，在步骤2)中用于荧光定量PCR的IL-18基因的引物序列为:
[0017]F:5，-tggaatgcgatgccttttgt-3，
[0018]R:5，-aggtgcggtggttttgtaac-3’
[0019]内参β-actin rRNA的引物序列为:
[0020]F:5 ’-tggactcctacaaccaacgg-3’
[0021 ] R:5，-catcctccttgaactcgcag-3，。
[0022]本发明的有益效果:本发明基于IL-18基因在武定鸡免疫器官中的表达，判断武定鸡抗沙门氏菌能力与IL-18基因的相对表达量的关系，IL-18基因的相对表达量多的武定鸡抗沙门氏菌能力强，IL-18基因的相对表达量少的武定鸡抗沙门氏菌能力弱，并且对脾脏中IL-18基因的相对表达量小于2.2或胸腺中IL-18基因的相对表达量小于3.6或法氏囊中IL-18基因的相对表达量小于7.0的武定鸡，对其进行肌注灭活沙门氏菌，使得武定鸡脾脏中IL-18基因的相对表达量不小于2.2，胸腺中IL-18基因的相对表达量不小于3.6，法氏囊中IL-18基因的相对表达量不小于7.0，使得武定鸡IL-18基因的相对表达量提高，有利于增强武定鸡抗沙门氏菌的能力，IL-18基因的研究对控制畜禽快速生长，改善机体免疫能力具有重要的研究，由于家禽的品种、养殖环境、饲料等都会在实际生产中对禽类的抗病力产生影响，但禽类机体自身固有免疫代谢能力在机体抗病效应中的表现中有着举足轻重的地位，因此，IL-18基因的发现对阐明机体免疫应答水平的调控机理具有重要的意义，同时将为畜牧业从抗病育种方向开辟一条新途径，本发明从免疫器官中总RNA的提取、RT-PCR引物设计、定量检测、肌注灭活沙门氏菌一个完整的步骤，精确的测量IL-18基因的相对表达量与武定鸡抗沙门氏菌能力强弱的关系，并对IL-18基因的相对表达量低的武定鸡进行肌注灭活沙门氏菌，使得武定鸡抗沙门氏菌的能力增强。
【附图说明】
[0023]图1感染组和非感染组脾脏中IL-18基因表达的比较分析图；
[0024]图2感染组和非感染组胸腺中IL-18基因表达的比较分析图；
[0025]图3感染组和非感染组法氏囊中IL-18基因表达的比较分析图。
【具体实施方式】
[0026]下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0027]实施例1
[0028]所述基于IL-18基因调节武定鸡抗沙门氏菌能力的方法包括以下具体步骤为:
[0029]1)免疫器官中总RNA的提取
[0030]选取同一批次出壳的武定鸡健康鸡只100只进行沙门氏菌感染，隔离饲养，利用RNA提取试剂提取武定鸡免疫器官总RNA，RNA提取试剂为RNAiso Plus，将提取的RNA反转录成 cDNA，-20°C 保存；
[0031]2) RT-PCR 引物设计
[0032]根据GenBank中武定鸡IL-18序列信息，利用Primer Premier 5.0设计引物，并合成，合成后进行荧光定量PCR，用于荧光定量PCR的IL-18基因的引物序列为:
[0033]F:5，-tggaatgcgatgccttttgt-3，
[0034]R:5 ’-aggtgcggtggttttgtaac-3’
[0035]内参β-actin rRNA的引物序列为:
[0036]F:5 ’-tggactcctacaaccaacgg-3’
[0037]R:5，-catcctccttgaactcgcag-3’
[0038]荧光定量PCR的反应条件为:94°C预变性3min ； 94°C变性30s，59.2°C退火30s、72°C延伸30s，39个循环;72°C后延伸7min进行扩增；
[0039]3)定量检测
[0040]如图1-3所示，对感染组和非感染组在4周龄、8周龄和12周龄IL-18基因在脾脏、胸腺和法氏囊中的相对表达量进行检测，感染组脾脏中IL-18基因的相对表达量为4周龄为:4.8，8周龄为:2.2，12周龄为:4.0;在胸腺中IL-18基因的相对表达量为4周龄为:3.6，8周龄为:4.0，12周龄为:4.5;在法式囊中IL-18基因的相对表达量为4周龄为:10.0，8周龄为:8.0，12周龄为:7.0。
[0041 ] 实施例2
[0042]所述基于IL-18基因调节武定鸡抗沙门氏菌能力的方法包括以下具体步骤为:
[0043]1)免疫器官中总RNA的提取
[0044]选取同一批次出壳的武定鸡健康鸡只100只进行隔离饲养，利用RNA提取试剂提取武定鸡免疫器官总RNA，