专利名称：转基因禽类的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种制备转基因禽类尤其是转基因鸡的方法。
转基因动物是近年来才发展起来的生物高技术。通过这一技术可以使外源基因导入动物基因组中，而使这种转基因动物具有新的特性。如快速生长、抗病、抗逆，以达到培育优良新品种的目的；或者导人外源基因改变体内基因的结构，使动物和人的某些遗传疾病得以治疗。或者培育在动物体中表达外源蛋白的动物，即“动物生物反应器”。要达到上述目的，转基因动物制备方法是首要的问题。
与哺乳动物胚胎相比，鸡的受精卵有卵黄包围，位于胚盘中央。当从受精到产出时已经过24小时，发育到九至十阶段。此时的细胞数目多达60000-80000个，进行外源DNA的注射显然是太晚了，根本不能与细胞中染色体整合。因而转基因鸡技术和转基因哺乳动物相比更加困难。在80年代初，Grittenden等人(1989，Theor.Appl.Genet.77，505-515)用反转录病毒，即禽白血病病毒(ALY)作载体，感染刚产出的受精卵的胚盘，使外源基因通过病毒的感染而插入到鸡的染色体中，得到了转基因鸡。后来许多人也得到同样的结果，但这一方法具有很多缺点，如插入基因的长度受到限制，制备高效感染病毒也很困难。另外，用病毒作载体得到的转基因鸡，使人们立即想到，这种鸡本身是否染上了这种病毒，对它产生了排斥心理，很难为世人所接受。到90年代以后，这种方法就逐渐为其它方法所代替。
Naito.M等人(荷兰阿姆斯特丹第XIX界世界禽类大会论文集1518-522，1992年9月22-24日)将带β-肌动蛋白启动子的β-半乳糖苷酶(LacZ)基因，用显微注射法，注入单细胞阶段鸡受精卵胚盘中。263个注入外源基因的蛋4日的成活率为48.7％，孵化率为11.8％。得到了19只公鸡和6只母鸡，并达到性成熟，取其血液和精液进行分析，得到两只DNA阳性的公鸡，为了测定两只公鸡所带DNA是否能转至它们的后代，用这两只公鸡与母鸡交配。其中一只公鸡(W-9266)得到75只后代，另一只公鸡(W-9237)得到34只后代。但经测定在这些后代中没有发现外源DNA存在。
英国爱丁堡AFRC Roslin研究所Love，J.等人(Bio/Technology，1994，1260-63)首次报道了他们的研究成果。他们将带有报道基因的质粒DNA微注射入鸡受精卵的胚盘中，体外培养12小时后分析存活的胚胎，发现近一半胚胎含有质粒DNA，在所有组织分析中，有6％相当于每个细胞有一个拷贝。有7只小鸡(占注射受精卵总数的5.5％)成活至性成熟，其中一只未满一年的小公鸡将3.4％的外源DNA传给其后代。这些鸡达到性成熟，并繁殖了子代转基因鸡，这一实验证实了微注射能将外源DNA稳定地导入种系中。
Rottmann.O.J(J.Anim.Breed.Genet.1992，10964-70)将新采集的鸡精液，用Krebs Ringer溶液洗涤3次，取1ml精子悬浮液(120×106精子)与500μl脂质体悬液混合，脂质体含有质粒DNA。在37℃下保温30分钟，混合物用作人工授精。每只母鸡输入100μl精子-脂质体悬液，每日早上收集鸡蛋，在37℃下孵化12天。经过12天孵化的鸡胚中，对其中158个进行了外源DNA分析，有41个(26％)含有外源基因。但进一步研究证实，DNA没有完全整合到鸡胚染色体中，而是处在“游离”状态。Rottmann.O.J(J.Anim.Breed.Genet.1996，113401-11)进行了类似的试验，结果只在12天鸡胚中检测到外源基因，而在青年鸡或成年鸡体内未检测到外源基因的存在，由于这一方法操作简单，很可能成为生产大批转基因的方法。
从上述可见，显微注射法技术难度高，成功率低；逆转录法难以为公众接受；精子载体法尚未完全成功；嵌合体法得到的不是真正的转基因鸡。制备真正的转基因禽类特别是转基因鸡尚需深入的研究和努力。
本发明的目的就在于提供一种新的转基因禽类的制备方法，其特点是方法简便、操作简单、易于应用和推广，导入率高，整合率高。
本发明描述了一种适用于将外源基因或DNA序列导入基因组中以制备包括鸡、鸭、鹅和鹌鹤等转基因禽类的方法。本方法采用了将外源DNA(或基因)包埋在中空螺旋状的脂质体中，再与精子共同孵育，使脂质体与精子融合，随后电击，增加精子膜的通透性，使DNA进入精子细胞内。再用此带有外源基因的精子给母鸡(禽)进行人工授精。最终DNA将随受精过程进入卵细胞，达到导入外源基因的目的。
具体地，本发明方法包括如下步骤1)制备脂质体/外源DNA混合液，即将脂质体和外源DNA按一定比例混合在室温孵育45分钟备用；2)采集新鲜精液，经处理后与上述步骤1)的脂质体/外源DNA液混合，在室温孵育45分钟备用；3)125uF/300V电击步骤2)的混合物后，立即给雌禽输精，收集48小时后所产禽蛋；4)用步骤3)的禽蛋孵化雏禽，采血提取DNA，检测外源DNA的整合，具有外源DNA整合的禽类即为转基因禽类。
在本发明方法步骤1)中，外源DNA和脂质体的比例为1∶4。所述外源DNA可以是任何希望转入禽类体内的基因或DNA序列，在本发明的实施例中以含有报道基因β-半乳糖苷酶基因的表达载体pOVΔβ和pOVβ(其构建见实施例，详见本发明人的中国专利申请99122092.7)为例说明了本发明转基因禽类制备方法的有效性。所用脂质体可以是任何市售的产品，例如Boehringer Mannheim公司的产品。脂质体是多阳离子化合物，与DNA有很高的亲和性，本领域广泛应用。
在本发明方法的步骤2)中，精子处理方法是用等体积的精液稀释液洗涤精子，并在3000转/分离心5分钟；再用2倍体积的精液稀释液悬浮精子。所述的精液稀释是任何能保持精子活性的缓冲液，例如本发明的实施例中采用如下配方的精液稀释液每100毫升稀释液含0.8g D-果糖(C.P.)，1.92g谷氨酸钠，0.5g无水醋酸钾，0.032g硫酸鱼精蛋白和0.3g聚乙烯氯戊环酮(分子量10000)，pH6.4，渗透压为300-320mOs/kg。经步骤2混合精液后，外源DNA与精子比例为每1毫升精液内含15-20微克外源DNA。
另外，本领域熟练技术人员还应理解的是，本发明方法步骤3)中，输精量根据不同的禽类等可发生变化，例如每只禽输入精液/外源DNA混合液0.05-010毫升。
本发明方法步骤4)中用于检测外源DNA的整合的方法可以是本领域已知的任何方法，例如PCR法和Southern印迹法。本领域技术人员应理解的是PCR法所用引物和Southern印迹法所用探针应特异于所导入的外源DNA或基因。
本发明的转基因禽类制备方法使基因能进入禽的基因组中，该方法所用的载体不含有任何有害病毒成分，完全是在禽类自然受精的状态下进行的。根据所用外源基因的设计，可用这种方法培育优质、高产、特殊用途的禽类。也可以提供禽类生物反应器，在禽类的器官、组织或是蛋中含有的外源目的蛋白，并可用于分离提纯的目的。
以下参照附图和实施例对本发明进行详细描述，其中
图1为表达质粒pCMVβ示意图。
图2为表达质粒pOVβ示意图。
图3为表达质粒pOVΔβ示意图。
实施例1本例中使用表达质粒pOVΔβ，按本发明方法进行了转基因试验。其中，表达质粒pOVΔβ是将含报道基因β-半乳糖苷酶基因(β-gal)的市售质粒pCMVβ(
图1，Promega公司产品)经HindIII和SalI酶切后再自连接为pCMVβΔ，pCMVβΔ随后经PstI和SmaI酶切打开一缺口，用T4连接酶在缺口处插入事先制备好的鸡卵清蛋白启动子(OV)而得到，该质粒的具体构建过程详见中国专利申请99122092.7。
制备转基因禽类的具体步骤如下
取50微克pOVΔβ质粒DNA溶于200微升无菌蒸馏水中，慢慢加至200微升(相当于200微克)脂质体(Boehringer Mannheim公司产品，产品号1781995)中，混匀，于室温孵育45分钟备用；采集鸡精液3毫升，加3毫升精液稀释液(每100毫升稀释液含0.8g D-果糖(C.P.)，1.92g谷氨酸钠，0.5g无水醋酸钾，0.032g硫酸鱼精蛋白和0.3g聚乙烯氯戊环酮(分子量10000)，pH6.4，渗透压为300-320mOs/kg)，用吸管轻轻吹打均匀，室温下3000rpm离心5分钟，倒掉上清，精子重新悬于6毫升精液稀释液中，将所得液体与上述质粒DNA/脂质体溶液混合，室温孵育45分钟；上述混合物用Bio-Rad公司的电脉冲仪(Genepulser)经125uF/300V电击后，立即给100只母鸡进行人工输精，收集48小时后所产鸡蛋，连续收集3天；用所收集的鸡蛋孵化出189只雏鸡，30天后采血，常规方法提取DNA，以引物OVFWD和BetaRev经PCR法分析法检测外源基因的整合。OVFWD和BetaRev序列如下OVFWD 5＇-TTA CTG TTG TAG TAG CCT ACC ATA G-3＇BetaRev5＇-CCA CAG ATG AAA CGC CGA GGT AA-3＇PCR测定的结果如表1所示表1F1代PCR测定结果
总整合率为5.29％实施例2本例中使用表达质粒pOVβ，按本发明方法进行了转基因试验。其中，表达质粒pOVβ是将pOVΔβ用BamHI酶切，去掉SV40片段后再插入事先制备的鸡卵清蛋白基因3＇端646bp片段而得到。该质粒的具体构建过程详见中国专利申请99122092.7。
除了使用pOVβ外，其余操作同实施例1，PCR测定结果如下表2表2F1代PCR测定结果
总整合率为5.91％
权利要求
1.一种制备转基因禽类的方法，其特征在于包括如下步骤1)制备脂质体/外源DNA混合液，即将脂质体和外源DNA按一定比例混合在室温孵育45分钟备用；2)采集新鲜精液，经处理后与上述步骤1)的脂质体/外源DNA液混合，在室温孵育45分钟备用；3)125uF/300V电击步骤2)的混合物后，立即给雌禽输精，收集48小时后所产禽蛋；4)用步骤3)的禽蛋孵化雏禽，采血提取DNA，检测外源DNA的整合，具有外源DNA整合的禽类即为转基因禽类。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的禽类为鸡。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中DNA和脂质体比例为1∶4，孵育时间为45分钟。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中精子处理方法是用等体积的精液稀释液洗涤精子，并在3000转/分离心5分钟；再用2倍体积的精液稀释液悬浮精子。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中外源DNA与精子比例为每1毫升精液内含15-20微克外源DNA。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中输精量为每只禽输入精液/外源DNA混合液0.05-010毫升。
全文摘要
本发明描述了一种适用于将外源基因或DNA序列导入基因组中以制备包鸡、鸭、鹅和鹌鹑等的转基因禽类的方法。本方法采用了将外源DNA(或基因)包埋在中空螺旋状的脂质体中,与精子共同孵育,使脂质体与精子融合,再加之电击,增加精子膜的通透性,使DNA进入精子细胞内。再用此带有外源基因的精子给雌禽进行人工授精。最终DNA将随受精过程进入卵细胞,达到导入外源基因的目的。
文档编号C12N15/87GK1372791SQ0110437
公开日2002年10月9日 申请日期2001年2月28日 优先权日2001年2月28日
发明者李建凡, 梁志清, 王小珂 申请人:中国农业科学院畜牧研究所, 香港大学, 北京实验动物研究中心