专利名称：重组梅毒螺旋体表位抗原及多表位嵌合抗原的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组梅毒螺旋体表位抗原，还涉及重组梅毒螺旋体多表位嵌合抗原。
梅毒螺旋体是性病梅毒的病原体，最早报道是14世纪在欧洲，大约在16世纪传入中国。自青霉素闻世后，该病得到了一定程度的控制，但仍远未消灭。且近十多年来，随着艾滋病的传播，梅毒又有抬头之势，应引起重视。目前还没有针对梅毒的有效疫苗，因此，早期检出病人，及时治疗，控制血源，是有效控制疾病传播的重要措施。
检测梅毒螺旋体感染有多种方法，如用病灶组织可直接检测病原体；用PCR法检测螺旋体基因也有报道(Pietravalle M，et al.Diagnostic relevance ofpolymerase chain reaction technology for T.pallidum in subjects with syphilis indifferent phases of infection.New Microbiol 1999 Apr；22(2)99-104)但还不普遍。血清学反应是目前最常用的检测方法。早先常采用非特异类脂质抗原(心磷脂)，检测抗心磷脂抗体，如性病研究实验室(VDRL)、不加热血清反应素试验(USR)和快速血浆反应素环状试验(RPR)等。这些方法较灵敏，但不特异，有假阳性反应，因而常需作确认试验。以梅毒螺旋体为抗原的特异性检测方法，有梅毒荧光螺旋体抗体吸附试验(FTA-ABS)和梅毒螺旋体血凝试验(TPHA)，其特异性和灵敏度均较高。但由于梅毒螺旋体培养困难，试剂的成本较高，再由于梅毒螺旋体的抗原性较复杂，和其它病原体，尤其是类似的螺旋体病(如雅司)仍可有一定的非特异性反应。鉴于以上情况，人们正在寻求用重组蛋白质作抗原的途径。近年来，梅毒全基因组序列都已得到了确定基因组全长约1,138,006bp，据推断具有1041个编码框(FraserCM et al，Complete Genome Sequence of Treponema pallidum，the SyphilisSpirochete.Science，1998；281375)。随着基因克隆技术的发展，用梅毒重组蛋白质为抗原的免疫测定方法已有不少研究，如免疫俘获EIA(ICE)测定法(Young H.et al.Novel recombinant-antigen enzyme immunoassay forserological diagnosis of sphilis.J Clin Microbiol 1998 Apr；36(4)913)。据报道在特异性和灵敏度方面，均和FTA-ABS法相当或更好。显示这类酶免疫检测试剂有着广阔的发展前景。为了获得良好的酶免疫检测试剂，抗原的研究非常重要。早期用于血清学检测的重组梅毒抗原有4D抗原(Radolf JD，et al.Serodiagnosis of syphilis by enzyme-linked immunosorbent assay with purifiedrecombinant Treponema pallidum antigen 4D.J Infect Dis 1986 Jun；153(6)1023)和TmpA(Ijsselmuiden OE，et al.Sensitivity and specificity of an enzyme-linkedimmunosorbent assay using the recombinant DNA-derived Treponema pallidumprotein TmpA for serodiagnosis of syphilis and the potential use of TmpA forassessing the effect of antibiotic therapy.J Clin Microbiol 1989 Jan；27(1)152-7)，据报道，后者对一期梅毒的检测率为76％，二期为100％，对无症状梅毒也可达98％，与血凝法相当。但根据最近研究显示，在梅毒基因编码的众多抗原中，除TmpA(也称TpN42)外，还有TpN17，TpN15，Tpm47具有较高的抗原性，其中又以TpN17的抗原活性最高(Fujimura K，et al.Reactivity ofrecombinant Treponema pallidum(r-Tp)antigens with anti-Tp antibodies inhuman syphilitic sera evaluated by ELISA.J Clin Lab Anal 1997；11(6)315.和Sato NS，et al.Analysis of Treponema pallidum recombinant antigens fordiagnosis of syphilis by Western blotting technique.Rev Inst Med Trop Sao Paulo1999 Mar-Apr；41(2)115)。但有报道认为TpN17，TpN15，TpN47三种抗原联用，检测灵敏度又较任何一种抗原单用为高(Gerber A，RecombinantTreponema pallidum antigens in syphilis serology.Immunobiology1996-97；196(5)535)。重组蛋白质作抗原的试剂一般非特异反应较低，但使用大片段的重组抗原，也有报道可有一定的非特异反应性，如4D抗原，可和大部分雅司病人血清发生交叉反应(Radolf JD，et al.Serodiagnosis ofsyphilis by enzyme-linked immunosorbent assay with purified recombinantTreponema pallidum antigen 4D.J Infect Dis 1986 Jun；153(6)1023)。也已经发现在TpN47中有一段序列(411PGTEYT416)和人纤维粘连蛋白(fibronectin)存在着较高的同源性，这可能和某些自身免疫性疾病，可与梅毒检测试剂发生交叉反应性有关(Baughn RE，et al.Molecular mimicry between animmunodominant amino acid motif on the 47-kDa lipoprotein of Treponemapallidum(Tpp47)and multiple repeats of analogous sequences in fibronectin.JImmunol 1996 Jul 15；157(2)720)，这种同源性和交叉反应性，在其它的梅毒抗原中也是可能存在的。因此，如能应用小片段的表位抗原，而不用大片段的重组蛋白，应可进一步提高检测的特异性。但目前文献上，除TpN42已有用重叠肽研究其主要抗原表位的报道外(Antoni G，et al.Detection of antigenicdeterminants in the Treponema pallidum membrane protein TmpA usingoverlapping synthetic peptides.J Immunol Methods 1996 Jan 16；189(1)137-40)，还未见其它报道。
本发明的一个目的是提供一些单片段的重组梅毒表位抗原。
本发明的另一目的是提供一个融合各抗原表位的多表位嵌合抗原。
根据本发明的一个方面，单片段重组梅毒螺旋体表位抗原的氨基酸序列为ARRGEKEAVYDYQHKEGRFKSQDADYHRV或SVLSKQETEDSRGRKKWEYETDPSV。
根据本发明的另一个方面，重组梅毒螺旋体多表位嵌合抗原包含上述单片段表位抗原。
本发明的重组梅毒螺旋体多表位嵌合抗原优选为上述单片段表位抗原与TpN17的第22至156位氨基酸和TpN42的第23至41位氨基酸的融合，其氨基酸序列为ARRGEKEAVYDYQHKEGRFKSQDADYHRVSGGGSSGGGSVLSKQETEDSRGRKKWEYETDPSGGGSSGGGSASGAKEEAEKKAAEQRALLSGGGSSGGGSCVSCTTVCPHAGKAKAEKVECALKGGIFRGTLPAADCPGIDTTVTFNADGTAQKVELALEKKSAPSPLTYRGTWMVREDGIVELSLVSSEQSKAPHEKELYELIDSNSVRYMGAPGAGKPSKEMAPFYVLKKTKK。
本发明的上述抗原表位和多表位嵌合抗原可通过以下技术方案得到。
在众多梅毒基因编码的蛋白质中，目前已知能用于诊断试剂的蛋白质主要有TpN17、TpN15、TpN42和TpN47四种。为了选择各蛋白质的主要抗原表位，首先从网上(Gene-Bank)获得以上四种蛋白质的氨基酸全序列；用计算机软件Gold-Key分析各抗原的抗原表位(也称抗原决定簇)，并从中选择主要的抗原表位加于重组表达，进一步加于组合连接。
抗原基因的合成可用PCR方法，从梅毒基因中扩增获得，也可用化学合成法，前者对大基因片段的获取较为有利，后者适合小基因片段的合成。考虑我们要合成的基因片段都不长，拟采用化学合成法。化学合成基因可省去提取模板基因的操作，方便快速；另一优点是可以选择在大肠杆菌的偏性密码子，这样可有利于在E.coli中获得高效的表达。所以我们选用化学合成法，也并不直接选用文献报道的梅毒基因序列的密码子，而是根据抗原表位的肽序列，和大肠杆菌中高表达的偏性密码子，推断出核苷酸序列加以合成。化学法合成基因一次能合成的长度有限，一般不超过60碱基。对TpN15，TpN47和TpN42，可先合成两条3’端有一段互补重叠的基因片段，将二者退火后用聚合酶延伸，获得正负双链DNA基因。但要合成全长135氨基酸TpN17基因，合成两条基因片段是远远不够的，所以共合成了九条有部分序列重叠的基因片段，从中间向两端逐步延伸合成。
为了便于基因间的相互连接，并在连接后可获得较好的抗原活性，在抗原表位间需有一连接臂，我们在表位的上下游分别加上G-G-G-S和S-G-G-G，所以在合成基因时应加上相应的基因。最后为了便于合成的基因克隆到表达载体，还合成了两条和连接臂相配的通用引物，引入两个酶切位点XhoI和XbaI，以适合表达载体pBVIL1。
载体pBVIL1是在我们以前构建的白介素1表达质粒pBV220/IL-1β(郭甫坤，凌世淦等，IL-1β及其突变体克隆、表达与活性研究，军事医学科学院院刊，1999，23(3)238-9)的基础了上构建而成的。即选择IL-1β分子表面g-环处，插入的可供基因克隆的酶切位点为XhoI和XbaI，最终构建成表达载体pBVIL1。该载体已于2000年1月27日进行够保藏，保藏机构和编号为CGMCC NO0437。其构建方法已于2000年1月28日申请中国专利，专利申请号为00100695.9，在此一并列为本发明的参考资料。
上述已提到合成的基因的两端已引入酶切位点XhoI和XbaI，这和载体pBVIL1是相符的。所以各基因片段均可方便地用双酶切法插入载体pBVIL1中，构建成相应的表达质粒。构建的表达质粒需用PCR法鉴定，以证明各基因片段已获正确地插入。
多表位嵌合抗原表达质粒是在各梅毒表位抗原表达质粒的基础上构建而成的。把其中一个质粒作为载体；另一含有基因TpN15的质粒作为模板，用含有SpeI的通用引物及含有BamHI的原IL-1基因3’端引物，扩增出含有TpN15和部分IL-1的基因片段，插入用XhoI和BamHI双切的TpN47基因的后面，获得含有TpN47和TpN15两个基因的质粒。由于新质粒中，TpN47和TpN15基因间的连接是由互补酶XbaI和SpeI之间的相连，连接后酶切位点不复存在，因此，新质粒又可成为新的载体，而另一含有TpN42质粒，可作为模板，扩增出含有TpN42的基因片段，连接在TpN47-15的后面，获得质粒pBVIL1/TpN47-15-42。同理，进一步可获得质粒pBVIL1/TpN47-15-42-17。多表位嵌合质粒，也要经PCR鉴定，证明可以扩增出相应的融合基因片段。
各表位抗原及多表位嵌合抗原表达质粒，转化E.coli HB101后，通过热诱导培养，取全菌液进行SDS-PAGE鉴定，证明各表达质粒均已获得了高效的表达。再经离子交换柱及凝胶过滤纯化，均可获得电泳纯的梅毒表位抗原和多表位嵌合抗原的纯品。
实验证明，本发明的不同的表位抗原均有一定的活性，其中以TpN17的检率最高，而多表位嵌合抗原的活性更高，而且我们的抗原只需一个嵌合抗原，生产成本低，又只是表位抗原，应有更高的特异性。
下面结合附图对本发明作进一步详细地描述，这些实施例仅用于解释、而不以任何方式限制本发明。
图1为TpN17分子及抗原表位分析图(a.TpN17分子的氨基酸序列；b.抗原表位分析图示，横座标为氨基酸位置，纵座标为抗原性)。
图2为TpN15分子抗原表位分析(a.TpN15分子的氨基酸序列；b.抗原表位分析图；c.选择的抗原表位在分子中位置和氨基酸序列)。
图3为TpN47分子抗原表位分析图(a.TpN47分子的氨基酸序列；b.抗原表位分析图；c.选择的抗原表位在分子中位置和氨基酸序列)。
图4为TpN42分子抗原表位分析图(a.TpN42分子的氨基酸序列；b.抗原表位分析图；c.选择的抗原表位在分子中位置和氨基酸序列)。
图5为四种主要表位抗原的氨基酸序列及其推断的基因序列。
图6是为了合成四种梅毒表位抗原基因，需合成的基因片段及通用引物。
图7为TpN17基因分步合成示意图。
图8为梅毒表位抗原表达质粒的构建示意图，图中TpNx代表任一的表位抗原。
图9为表位抗原间连接及多表位抗原表达质粒构建示意图。
图10为各种重组梅毒抗原纯品的SDS-PAGE鉴定结果图(1.TpN47，2.TpN42，3.TpN17，4.TpN15，5.TpN47+15，6.TpN47+15+42，7.TpN47+15+42+17，8.蛋白标准)。
实施例1重组梅毒抗原表位的选择1.TpN17抗原表位的选择TpN17的全序列如
图1a所示，有156氨基酸，用Gold-Key软件分析抗原决定簇，如
图1b所示，其中N端为疏水信号肽序列，没有明确的抗原表位，在分子的其它部分存在着多个抗原表位。由于TpN17在各抗原中活性是最高的，所以我们选了除N-端21个氨基酸以外的其它部分，即22～156(135氨基酸)。
2.TpN15抗原表位的选择TpN15的全序列如图2a所示，全序列共有124氨基酸，用Gold-Key软件分析抗原表位，如图3b所示，在TpN15中有2个主要的抗原表位，一是在中段(第41～60氨基酸)，再是在C-末端(113～120氨基酸)。所以我们选了这两个表位，然后再加以连接，所以，拟合成的抗原表位组合的氨基酸序列如图2c所示。
3.TpN47抗原表位的选择TpN47的全序列如图3a所示，全序列有415氨基酸，用Gold-Key软件分析抗原决定簇，如图3b所示，在TpN47分子中虽有数个抗原表位，但较强的抗原表位只有1个，主要是在分子的82～97位，我们也只选择这一表位，同时考虑了前后序列可能对表位三维结构的影响，适当加于延长，最后选择第78～101氨基酸，如图3c所示。
4.TpN42抗原表位的选择TpN42的全序列如图4a所示，全序列有405氨基酸，用Gold-Key软件分析抗原决定簇，如图4b所示，在TpN42分子中虽有数个抗原表位，但较强的抗原表位也只有1个，主要是在分子N端25-37氨基酸，并适当向前后延伸，最后选择序列为23～41位，这和文献上用重叠肽研究的抗原表位是一致的。同时也避开了文献报道和fibronectin可能有交叉免疫反应性的区段。
实施例2.梅毒表位抗原及多表位嵌合抗原的克隆与表达1.含表位抗原及多表位嵌合抗原表达质粒的构建1.1.合成基因片段的设计与合成根据各合成基因的需要，设计了如图6已提到的基因片段。基因片段序列设计后均委托上海生工生物技术服务有限公司合成。
1.2.PCR法获得TpNs基因TpN15，Tpn47和TpN42的基因合成方法，除所用合成基因片段不同外，均用两步PCR合成法
第一步在PCR扩增管中，依次加入H2O 41μl，10×PCR Buffer 5μl，分别加入各自基因的合成的一对基因片段(20pmole/μl)R、F(图6)各1μl，10mmol/L 4 dNTP 1μl，2U/μl的Taq DNA聚合酶1μl，混匀，1000rpm离心30”，然后放入PCR扩增仪(GeneAmp PCR System 2400)中扩增。PCR反应条件为94℃ 1分钟，94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分，5个循环。
第二步以第一步的PCR产物为模板进行扩增。即在PCR扩增管中，依次加入H2O 40μl，10×PCR Buffer 5μl，20pmole/μl通用引物R1、F1各1μl(图6)，1/10的第一步PCR产物1μl，10mmol/L 4 dNTP 1μl，2U/μl的Taq DNA聚合酶1μl，混匀，1000rpm离心30”，然后放入PCR扩增仪中扩增。PCR反应条件为94℃ 3分后，94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分，30个循环后再72℃延伸5分。
对于TpN17的分六步合成(图7)1)先用TpN17引物F5，R6以上述第一步方法扩增。2)以后均以上一次扩增产物为模板，分别以F4和R7，F3和R8，F2和R9，F1和R9，以及通用引物F1和R1为引物，按上述第二步方法扩增。
PCR产物的纯化用上海华舜生物工程有限公司生产的“小量PCR产物纯化”试剂盒进行纯化，即于PCR产物中加入PB 0.25ml，全量移入吸附柱，然后按说明书方法进行清洗和洗脱，然后电泳鉴定。
1.3表达质粒的构建1.3.1 PCR产物及表达载体pBVIL1双酶切取以上纯化的PCR产物及pBVIL1表达载体各30ul分别放于Eeppendorf离心管中，各加入10×buffer(H)4ul、XbaI(10u/ul)和XhoI(12u/ul)各1ul，加灭菌蒸馏水至40ul，置37℃水浴酶切过夜。
酶切产物的琼脂糖凝胶电泳纯化和回收PCR产物及载体pBVIL1经双酶切后，用1.2％琼脂糖凝胶进行纯化，具体方法按《分子克隆》(科学出版社，第二版)的方法进行。纯化基因再用上海华舜生物工程有限公司生产的小量胶回收试剂盒回收即在紫外灯下分别切下含质粒和目的基因的琼脂糖，放于Eeppendorf离心管中，各加入S1液，置55℃水浴10分钟使胶溶解，加入等量异丙醇，混匀，55℃温浴1分钟，然后分别移入吸附柱后，按试剂盒说明书进行纯化。
1.3.2连接于灭菌Eeppendorf离心管中加入上述酶切后的载体及目的基因各1ul、10×T4 DNA Ligase buffer 1ul、T4 DNA Ligase(12u/ul)1ul，加灭菌蒸馏水至10ul，置16℃过夜。
1.3.3转化在超净工作台中，用无菌吸头取100μl感受态细胞(感受态细胞按《分子克隆》(科学出版社，第二版)的方法进行)悬液于Eppendorfl中，加入上述连接物5μl，轻轻旋转混匀，冰浴30分。立即转移到42℃水浴中放置2分钟，每管加入0.5ml LB培养基(不加抗生素)，30℃水浴摇床培养60分钟后，各取0.2ml分别涂于LB琼脂培养基平皿上(含抗生素)，室温晾干后，置37℃恒温箱倒置培养过夜。挑选数个菌落，分别接种于LB中(5ml/管)，培养过夜，次日各取0.1ml转移到LB中(2ml/管)，32℃培养3小时，42℃水浴摇床中诱导培养4h，收菌，用SDS-PAGE鉴定，选择目的基因获得高表达菌株，作进一步鉴定。
1.3.4质粒提取及鉴定取上述SDS-PAGE鉴定证明目的基因获得高表达的菌株，按《分子克隆》(科学出版社，第二版)方法提取质粒。以质粒为模板，用各基因的F1引物和通用引R2进行PCR扩增(方法同上述第二步)，然后用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
2.表位抗原及多表位嵌合抗原的表达与纯化2.1表达菌株的培养取-70℃保存的表达菌株20ul接种于LB培养基中(100ml LB/500ml三角瓶)，30℃空气摇床培养过夜，次日按5％的比例转种于LB培养基(同上)，30℃空气摇床培养约3小时，当OD600值达到0.7时，立即将培养瓶转到42℃水浴摇床中，诱导培养4小时。将菌液合并，6000rpm离心20分钟，弃上清，收集沉淀部分。
2.2提取包涵体将沉淀称湿重，用10倍体积的20mmol/L pH8.0TE缓冲液将沉淀悬起，加入溶菌酶(1mg/ml悬液)，在室温下磁力搅拌10分钟。在冰浴中超声波破碎菌，每次超30秒钟，间隔30秒钟，共超10次。8℃，12000rpm，离心20分钟，弃上清，沉淀用1mol/L NaCl(用TE配制)洗一次，再用TE洗2次，收集沉淀。沉淀用8M脲(用PH8.0TE配制)溶解，加1％β-巯基乙醇。再于20℃，12000rpm，离心10分钟，去沉淀取上清。
2.3纯化将上述溶解的包涵体溶液过Q-Sepharose FF阴离子交换柱，用平衡液(pH8.0，20mmol/L TE含6mol/L脲，0.1％β-巯基乙醇)洗，收集未结合部分，再过S-Sepharose FF阳离子交换柱，用平衡液清洗后，用不同浓度的NaCl(用平衡液配制)洗脱，收集各洗脱峰，经SDS-PAGE鉴定，收集0.1mol/L NaCl洗脱峰。再过Sephardex G-50凝胶过滤柱，收集第一洗脱峰。各种纯化重组表位抗原及多表位嵌合抗原均用SDS-PAGE鉴定(
图10)。
3.梅毒表位抗原活性鉴定将纯化的梅毒表位抗原及多表位融合抗原，用pH9.5的碳酸盐缓冲液稀释到2.0ug/ml，包被ELISA测定板，经封闭后，对中国红十字会北京血站提供的122份梅毒阳性血清，进行了测定。并和日本TPHA试剂盒以及用进口的梅毒抗原(重组TpN17，TpN15，pN47三种抗原组合)组装的试剂盒进行比较测定，结果如表1所示。
表1.表位抗原、多表位嵌合抗原对122份梅毒阳性血清测定结果试剂盒(抗原名称)阳性份数 阴性份数15 70 5217 91 3142 88 3447 64 58融合 94 28日本(TPHA) 91 31WK(进口抗原) 92 30
权利要求
1.重组梅毒螺旋体表位抗原，其特征在于其氨基酸序列为ARRGEKEAVYDYQHKEGRFKSQDADYHRV或SVLSKQETEDSRGRKKWEYETDPSV。
2.梅毒螺旋体多表位嵌合抗原，其特征在于其氨基酸序列包含权利要求1所述表位抗原。
3.权利要求2所述的梅毒螺旋体多表位嵌合抗原，其特征在于其氨基酸序列为ARRGEKEAVYDYQHKEGRFKSQDADYHRVSGGGSSGGGSVLSKQETEDSRGRKKWEYETDPSGGGSSGGGSASGAKEEAEKKAAEQRALLSGGGSSGGGSCVSCTTVCPHAGKAKAEKVECALKGGIFRGTLPAADCPGIDTTVTFNADGTAQKVELALEKKSAPSPLTYRGTWMVREDGIVELSLVSSEQSKAPHEKELYELIDSNSVRYMGAPGAGKPSKEMAPFYVLKKTKK。
全文摘要
本发明涉及单片段重组梅毒螺旋体表位抗原,其氨基酸序列为ARRGEKEAVYD YQHKEGRFKSQDADYHRV或SVLSKQETEDSRGRKKWEYETDPSV。本发明还涉及包含上述表位抗原的多表位嵌合抗原。本发明的表位抗原活性高,多表位嵌合抗原特异性高、生产成本低。
文档编号C12P21/02GK1370782SQ0110442
公开日2002年9月25日 申请日期2001年2月26日 优先权日2001年2月26日
发明者凌世淦, 张贺秋, 宋晓国, 马贤凯 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所