人巨细胞病毒(hcmv)的重组抗原的制作方法

专利名称：：人巨细胞病毒(hcmv)的重组抗原的制作方法
技术领域：
：本文所述的发明涉及制备非直接应用于动物或人体的诊断手段的
技术领域：
。本发明还提供了多种化合物，它们的制备方法，它们的使用方法以及包含这些化合物的组合物，其中所述的化合物适用于在药物和诊断领域中的工业应用中，特别适用于人巨细胞病毒感染的检测和诊断，以及适用于治疗和预防所述的感染。
背景技术：
：在所有的治疗领域中，早期诊断是优选的，并且是非常理想的目标，特别是因为早期诊断会相当大地改善患者的生命，并且附带对卫生保健系统和患者而言都是节省的。特别是在本文所描述的本发明的情况下，在孕妇中潜在地或已经发生巨细胞病毒感染、需要特别关注胎儿健康的情况下，以及在被感染的受试者、特别是免疫功能低下的那些受试者中，早期诊断是非常重要的课题。人巨细胞病毒(HCMV)是人疱渗病毒-5的俗名，其为疱疹病毒科的高度宿主特异性病毒。就形态学而言，HCMV是该病毒科中最大的病毒，其具有编码了大约165个基因的235kbp的双链DNA基因组(Dolanetal.，2004,J.Gen.Virol.85:1301-1312)。与所有的疱渗病毒相似，HCMV在宿主中经历潜伏和再活化。该病毒在人类群体中是普遍的，并且在宿主中有50-90%发生了再活化。所述的病毒在人类群体中是普遍的，并且到50岁为止，有50-90%的成年人为血清阳性，而这取决于社会经济学因素和地理位置(GandhiandKhanna，2004，LancetInfect.4:725-738)。人类是HCMV的唯一储存库(reservoir)。初次感染HCMV通常是无症状的，并且自限于免疫活性宿主中，但是会形成周期性再活化的终身载体状态，并使病毒从粘膜位点上脱落。与此截然不同的是，在免疫抑制的成人中，潜伏病毒的再活化可以引起具有非常严重后果的肺炎(Gandhietal.，2003，BloodRev.l7:259-264)。此外，在怀孕期间发生初次感染可以导致流产，或者在先天性感染的新生儿中导致严重的胎儿疾病(RevelloandGerna，Clin.Microbiol.Rev.2002，15:680-715)。就HCMV感染问题的广泛综述而言，读者可参考专业的医学文献。通过在血液或体液中分离出病毒和/或病毒产物、采用PCR检测特定的核苷酸序列、并检测由于宿主响应所述的感染而产生的特异性抗-HCMV抗体来建立HCMV感染的诊断(RevelloandGerna，Clin.Microbiol.Rev.2002,15:680-715)。对临床医生的主要挑战是诊断孕妇中的初次HCMV感染，以及诊断他们的新生儿中的先天性感染。在这两种情况下，为了在适当的时间实施合适的治疗以及为了避免对胎儿和新生儿造成可能的损害，非常重要的是确定孕妇是在怀孕前还是在怀孕后发生的病毒感染。此外，必需确定由母亲向胎儿的垂直传播是何时发生的。在妊娠期间的血清转化、以及对新生儿中先天性感染的诊断通常是通过试图检测多种抗-HCMV免疫球蛋白(IgG，IgM，IgG的亲合力)的存在情况、并对比母亲与其孩子的免疫特征来进行的。但是，可利用的商业化测定法不能提供足够的敏感性和特异性以正确诊断所有患者中的感染情况。此外，大多数的当前可以利用的免疫测定法使用了由HCMV-感染的成纤维细胞培养物衍生得到的、限定不清的病毒抗原，并且在他们检测血清免疫球蛋白的能力存在变化。最后，由于缺少金标准，在HCMV血清诊断问题中的另一个问题是所得结果的真正的分类。因此，利用特异性的、敏感的和新型的诊断试剂是理想的。大量的研究已经发现了多种不同的HCMV抗原蛋白质，并且还测定出相应的基因序列。在用于诊断和治疗目的的大部分所关注的疫苗形式的蛋白质中，我们应该提及ppl50,其为病毒的大磷酸化间层蛋白(tegumentprotein)，已经证明该蛋白质可以通过已知对HCMV呈抗体阳性的血清来进行非常可靠的检测。并未发现在这种蛋白质，与EB病毒(Epstein-Barr)、7jc痘带状疱渗病毒(varicella-zoster)和单纯疱渗病毒(herpessimplexvirus)的蛋白质之间具有同源性，因此降低了与其他病毒蛋白质发生交叉反应的风险。长期以来，HCMV抗原首先是以以多种方式获得的抗原混合物的形式被人们所知和利用的。例如，Greijer及其同事(Greijeretal.，J.Clin.Microbiol.1999，37:179-188)净艮道了由pp52(UL44)和ppl50(UL32)衍生得到的、用于以特异性和高度敏感性早期检测HCMVIgM的多种肽的特异性结合，然而选择来自ppl50(UL32)、gB(UL55)和pp28(UL99)的多种肽的组合来得到对HCMVIgG的最佳且特异性的反应性。根据使用所述这些肽的组合物所得的结果，建立新的高度特异性的血清诊断测定法。与使用"金标准"(基于病毒抗原的ELISA)所获得的结果相比，这些测定法对IgG和IgM的敏感度分别为98.9%和96.4%。根据所述研究的结果，可以断定高度限定的合成肽的特异性组合物可以取代在当前血清诊断中使用的复合HCMV病毒提取物。在近10年中，许多研究已经报道了重组抗原在用于血清诊断HCMV感染和用于治疗性应用(例如疫苗)中的用途。应该强调的是，所有这些抗原都是通过分子生物学技术的手段而获得的，其中使用了在细菌和哺乳动物细胞中表达的蛋白质。所引用的文件均未描述使由HCMV基因组衍生得到cDNA片段文库在A噬菌体中表达/暴露(噬菌体展示)，从而得到病原体抗原的片段的技术。国际专利申请WO03/010198公开了以与k噬菌体的蛋白质D(pD)的氨基末端部分发生分子融合的DM表达和蛋白质暴露的载体。这种栽体被称为入KM4，其与用于表达实验的那些载体(例如参见Agtll)不同，这是由于由所述的外源DNA片段编码的重组蛋白质是以与噬菌体本身的蛋白质所形成的融合产物的形式表达，然后被暴露在衣壳上。根据该方法，只要所述的蛋白质片段的开放阅读框(ORF)与pD—致，所述噬菌体便可以使该蛋白质片段暴露于表面上。对所述文库中克隆的DNA片段的尺寸加以选择，以代表200至IOOO个核苦酸碱基对(bp)的中等尺寸的群体，并且就统计学原因而言，大部分的阅读框移位的序列都包含不能进行翻译、并由此进行暴露在噬菌体表面上的终止密码子。发明概述目前，已经发现了亲合力的选择与噬菌体展示技术的组合方法提供了用于鉴定HCMV的特异性抗原片段的方法，具体而言是通过使用来自被感染个体的一盘血清来在HCMVDNA片段的噬菌体展示文库上进行亲合力选择。DNA片段是通过对HCMV病毒的基因组DNA进行酶解而获得的。采用该方法，证明可以由极大的文库(即，表达极大量的不同序列)中鉴定出抗原片段。由此鉴定的抗原片段可以用于诊断和治疗目的。此外，已经发现HCMV蛋白质的抗原性区域的组合物(重组嵌合蛋白质的形式)保留了单个抗原片段的抗原性性质，并改善了其中使用了这些抗原片段的诊断测定法的性能。由此制得的相应嵌合蛋白质可以用于i貪断和治疗目的。因此，本文所述的本发明的一个目标是提供通过使用来自被感染的个体的一盘血清来在HCMVDNA片段的噬菌体展示文库上进行亲合力选择、从而用于鉴定HCMV蛋白质的抗原片段的方法。本发明所提供的方法可以证实已知的HCMV抗原作为诊断试剂的用途，还可以在已知的抗原中鉴定触发人的免疫应答的表位，并且这一部分也是本发明的另一目标；而且还可以鉴定HCMV蛋白质的抗原性功能，就HCMV蛋白质而言，所述的功能以前是未知的；最后，根据本发明的方法还提供了HCMV基因产物的新抗原片段，这同样也构成了本发明的另一目标。本发明的另一目标是使用上文提及的方法分离和表征的抗原片段，其用作单一的重组蛋白质，或组合为"抗原混合物"，或者通过其他的基因工程方法而形成的嵌合抗原。本文所述的本发明还扩^^至所述抗原性区域中所包含的表位。所述重组蛋白质(抗原片段以及通过将所选抗原的2个或多个抗原性区域相组合而得到的嵌合抗原)作为诊断试剂的用途，以及包含所述重组蛋白质的相关诊断佐剂(例如酶联免疫测定，或者试剂盒，或者其他支持物)构成了本发明的另一个目标。所述抗原片段和嵌合抗原作为活性试剂用于制备配制物、特别是疫苗形式(其可用于预防和治疗人类的感染)中的用途构成了本发明的其他目标。本发明的另一个目标是提供编码上文提及的抗原片段和嵌合抗原的基因序列、他们作为特别用于预防和治疗HCMV感染(例如基因治疗)的药物的用途。本发明还扩展至在严格杂交状态下与上文提及的片段的序列发生杂交的基因序列。此外，下文通过实施例和附图来详细说明上述及其他目标。发明详述本发明的主要目标是提供HCMV基因产物的重组抗原片段，以及提供通过融合HCMV蛋白质的不同的抗原性区域而获得的重组嵌合抗原，以及由此获得的重组产物用于研发选择性诊断和治疗手段的用途。当将本发明的嵌合抗原用于使用血清来检测感染的诊断免疫测定法时，使用本发明的嵌合抗原优于上文所述文献中已知的其他类型的抗原或抗原片段的主要优点如下，并且这些优点是明显的-就完整的HCMV抗原(其是经裂解制备的，来自被感染细胞的全细胞提取物)的应用而言，所述的重组嵌合抗原具有避免由于存在其他非病毒物质而发生的非特异性反应，并且提供良好的再现性的优点。—就HCMV抗原的单一抗原性区域的应用而言，所述的重组嵌合抗原显示出改善其中使用了这些抗原的测定法的敏感性的优点。换言之，它们的应用减少或消除了假阳性反应的发生。一就单一抗原性区域的混合物或者集合的工业适用性和生产而言，其优点在于通过经济且可再现的方法更容易生产包含3个或多个抗原性区域的单一的经改造的构建体，而不是单独地生产各种单一的片段并随后再将它们组装起来。这些以及其他的优点在实施例部分中示出。本发明包括从HCMVDNA制备的DNA片段的表达/暴露文库的构建；使用已经被HCMV感染的患者的血清选择这种文库；对抗原片段进行表征；以及使用所述的片段用于研发选择性的诊断和治疗手段。根据本发明的方法将亲合力的选择与噬菌体展示的能力有利地组合。如本领域中普通的技术人员所理解的那样，噬菌体展示所意味的是基于选择表达/暴露文库的策略，其中将小的蛋白质结构域暴露在包含相应遗传信息的噬菌体的表面上。噬菌体展示类型的文库是使用衍生自病原有机体的DM构建而成的，该文库可以开发亲合力选择，所述的亲合力选择是以将特异性的血清(其对病原体具有反应性)与噬菌体的集合进行温育为基础的，其中所述的噬菌体在它们的衣壳上表达病原体蛋白质的部分，并且包含相应的遗传信息。可以容易地回收与血清中存在的抗体发生特异性结合的噬菌体，其与固体支承体(例如磁珠)保持结合(通过抗体本身)；而与此截然不同的是，非特异性结合的噬菌体则被洗脱。当恰好作为所述选择的结果而使得所述文库的复杂性(即，不同数量的序列)被大幅降低时，仅仅在后来的阶段进行直接筛选，即，分析单一噬菌体克隆与给定血清的抗体的结合能力。具体而言，本发明涵盖了由选自如下的氨基酸序列构成的人巨细胞病毒(HCMV)抗原片段SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14，和它们的混合物。根据另一个实施方式，本发明涵盖了嵌合重组抗原，该抗原包含HCMV蛋白质的至少3个不同的抗原性区域的融合体，其中所述的抗原性区域是结合HCMV-特异性抗体的B细胞表位；优选地，所述的HCMV-特异性抗体从已经受到HCMV感染的受试者的血清提取。优选地，在本发明的嵌合抗原中，所述的3种不同的抗原性区域通过共价键或通过肽连接体而连接；更优选地，3种不同的抗原性区域中的每个由选自如下的氨基酸序列构成SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12和SEQIDNO:14。根据本发明的具体的实施方式，所述的嵌合抗原包含SEQIDNO:16所示的氨基酸序列，或者SEQIDNO:18所示的氨基酸序列。术语"多肽"通常用于包含至少4个相邻的氨基酸(通常为20至500个相邻的氨基酸)的多肽链。本文所称的术语"表位"涉及被T-细胞受体或B-细胞受体或抗体所识别和结合的抗原分子的部分(即，在大型分子上的决定区，针对该决定区可以产生抗体，并且该抗体可以与所述的决定区相结合)。本文所用的该术语意欲包括天然分子或可以模仿天然抗原决定区的合成分子的抗原决定区。模仿天然的抗原决定区的分子还可以被称为"模拟表位"，并且就不是通过抗原的一级序列的连续区段形成的表位而言，这些术语可以交换使用。根据本发明，表位为9至40个氨基酸的长度的多肽链。本文所称的术语"抗原片段"或"抗原性区域"涉及包含表位的抗原性分子的区域。根据本发明，抗原片段为大约50至大约500个、优选为100至200个氨基酸长度的多肽链。术语"嵌合构建体，，或"融合构建体"在本文中用于指包含至少1个上文所定义的氨基酸序列的多肽。由此，所述的多肽是由如下核酸序列所编码的，其中所述的核酸序列是通过将编码本发明的经分离的多肽的核酸序列与包含HCMV基因产物的免疫显性表位的其他抗原片段相连而产生的，并且所述的核酸序列还包含在细菌细胞中进行基因表达和复制所必须的重要核酸序列。优选地，其他抗原片段可以选自HCMV的噬菌体展示文库(例如本发明所述的抗原片段)和/或所述文献中已知的HCMV的抗原性区域。本发明的嵌合抗原可以采用已知的方法进行改造。融合体可以为直接的(一个氨基酸序列的c-末端通过筒单的共价键与其他氨基酸的N-末端相连)，或者它们可以使用不同长度的挠性连接体结构域(例如人IgG的铰链区)和/或由小氨基酸(例如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或丙氨酸)构成的多肽连接体。例如，所述的连接体可以是被丝氨酸或苏氨酸以一定的间隔所隔开的多甘氨酸重复。优选地，所述的连接体由3个甘氨酸残基和2个丝氨酸残基构成，从而得到氨基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Ser(SGGGS连接体)。本发明的另一个目标是提供编码上文所定义的嵌合抗原的核苷酸序列。优选地，本发明的核苷酸序列选自SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16。根据本发明的另一方面，所述的核苷酸序列包含至少3种不同的核苷酸序列，该核苷酸序列选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11和SEQIDNO:13。此外，在严格的杂交条件下与任何根据权利要求8至10的序列发生杂交的、具有任何上文所提及的核苷酸序列的核苷酸序列，以及由该序列所编码的嵌合重组抗原都包含在本发明的范围内。优选地，所述的核苷酸序列为DNA序列。本发明的重组抗原可以通过使用合适的表达载体，在原核或真核表达系统中进行克隆和表达来制备。可以采用本领域已知的任何方法。例如，可以通过本领域中公知的技术(参见Sambrooketal，1989，MolecularCloning:alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY)来将编码本发明的抗原的DNA分子插入到合适的经构建的表达栽体中。这种载体是本发明的另一个目标。为了能够表达所需的蛋白质(在这种情况下是抗原片段和嵌合抗原)，表达载体还应该包含具有转录和翻译调控信息的特定核苷酸序列，其中所述的特定核苷酸序列以允许基因表达和蛋白质生产的方式而与编码所需蛋白质的DNA连接。首先，为了使基因被转录，其前方必需为可以被RNA聚合酶识别的启动子，聚合酶与该启动子结合并由此起始转录过程。目前有多种此类启动子被使用，这些启动子具有不同的效率(强和弱启动子)。对于真核宿主而言，可以根据宿主的性质来使用不同的转录和翻译调控序列。这些序列来源于病毒(例如腺病毒、牛乳头瘤病毒、猿猴病毒等)，其中所述的调控信号与特定的基因相关，而这些特定的基因具有高的表达水平。实例有疱疹病毒的TK启动子、SV40早期启动子、酵母gal4基因启动子等。可以选择能够进行抑制和活化的转录起始调控信号，这样可以调整基因的表达。所有这些宿主均为本发明的另一个目标。可以将编码本发明的重组抗原的核酸分子连接至异源序列，从而使得组合的核酸分子编码融合蛋白质。这种组合的核酸分子包括在本发明的实施方式中。例如，将它们连接至编码如下蛋白质的DM,所述蛋白质允许通过仅一步的亲和层析来纯化所述重组抗原。这种连接/融合的蛋白质可以是例如谷胱甘肽S转移酶(GST)，从而在GST蛋白质的羧基末端产生融合产物。在经转化的大肠杆菌细胞的细胞质中表达的、相应的重组蛋白质可以通过使用谷胱甘肽-琼脂糖树脂的亲合层析来进行纯化。备选地，所述的连接/融合的蛋白质可以是多组氨酸标签(也称为His-标签)，从而在重组蛋白质的羧基末端或氨基末端产生融合产物。在经转化的大肠杆菌细胞的细胞质中表达的、相应的重组产物可以通过使用了镍-螯合剂(例如Ni-NTA树脂，得自Qiagen,USA)亲合层析的亲合层析来进行纯化。将包含编码本发明的抗原片段的核苷酸序列的DM分子插入到载体中，该载体具有可操作地连接的转录和翻译调控信号，该信号能够在宿主细胞中复制所需的基因序列。还可以通过引入一个或多个标记物来选择由被引入的DNA所稳定转化的细胞，其中所述的标记物可以对含有所述表达载体的宿主细胞进行选择。所述的标记物还可以向营养缺陷型宿主提供光营养、杀虫剂抗性(例如抗生素)或重金属(例如铜)等。所述的可选择的标记物基因可以直接与待表达的DNA基因序列相连，或者通过共转染而被引入到相同的细胞中。此外，还需要其他元件用于本发明的蛋白质的最佳合成。选择特定的质粒或病毒载体中的重要因素包括从不含有所述载体的那些受体细胞中识别和选择出含有所述栽体的受体细胞的容易程度；在特定的宿主中具有所需载体的拷贝数量；以及是否能够令人满意地使所述的载体在不同种类的宿主细胞之间"穿梭"。一旦制备包含所述构建体的载体或DM序列用于表达，便可以通过多种合适手段中的任何手段来将所述的DNA构建体引入到合适的宿主细胞中，其中所述的手段为转化、转染、缀合、原生质体融合、电穿孔、磷酸钩沉淀、直接微注射等宿主细胞可以为原核的或真核的。真核宿主的实例为哺乳动物细胞，例如人、猴子、小鼠和中国仓鼠卵(CHO)细胞。在这些宿主细胞中的表达为蛋白质分子提供了翻译后的修饰，包括正确的折叠或者在正确的位点进行糖基化。此外，酵母细胞可以进行翻译后的肽修饰，其中包括糖基化。在酵母中存在有使用强启动子序列的大量重組DNA策略和用于生产所需蛋白质的高拷贝数的质粒。酵母识别经克隆的哺乳动物基因产物上的前导序列，并且分泌出具有前导序列的肽(即，前肽)。原核宿主的实例为细菌，例如大肠杆菌(^sc力er/c力/aco//)。在引入栽体之后，宿主细胞在选择性培养基中生长，所述的选择性培养基就包含载体的细胞生长进行选择。经克隆的基因序列的表达产生所需蛋白质的生产。通过任何一种已知的方法来进行重组抗原的纯化，就纯化而言，即，任何常规的工艺包括提取、沉淀、层析、电泳等。就纯化本发明的抗原而言，可以使用的其他纯化工艺是使用单克隆抗体的亲合层析，其中所述的单克隆抗体结合靶蛋白质，并且可以在柱内所包含的凝胶基质上制备并固定于其上。将含有所述重組蛋白质的不纯的制备物通过所述的柱。所述的抗原通过特异性抗体与所述的柱结合，而杂质通过。洗涤后，通过pH或离子强度的改变将所述抗原从凝胶上洗脱下来。本发明的另一方面是提供用于制备上文所述的重组抗原的方法，该方法包括培养宿主细胞，其中所述的宿主细胞经包含本发明的核苷酸序列的载体所转化，以及分离所需的产物。本发明的另一个目标是提供包含编码上文所述融合蛋白质的DNA序列的DNA分子，以及基本上相同的核苷酸序列。"基本上相同的核苷酸序列"包括所有其他的核酸序列，由于遗传密码的简并性，所述的其他的核酸序列还编码给定的氨基酸序列。本发明的另一目标是提供如下核苷酸序列，该核苷酸序列在高度序列^交，条件是所得的:原保持了相同^生物学活性即可，即，能够与针对寄生虫的抗体结合。如本文所用的术语"杂交，，是指两种核酸分子通过氢鍵键合彼此结合。通常，其中的一种分子被固定在固体支承体上，而另一种分子游离于溶液中。然后，将所述的两种分子在有利于氢键键合的条件下彼此接触放置。影响所述键合的因素包括溶剂的种类和体积；反应温度；杂交时间；振荡情况；阻断液相分子与固体支承体之间发生非特异性附着的试剂(Denhardt试剂或BLOTTO);分子的浓度；增加分子结合速率的化合物(葡聚糖硫酸酯或聚乙二醇)的使用情况；以及杂交后洗涤条件的严格程度。严格条件是杂交实验中所采用的温度、杂交溶液中一价阳离子的摩尔浓度和甲酰胺的百分比的函数。为了测定与任何一组给定条件有关的严格程度，首先使用Meinkoth等人(1984)的等式来测定100%—致性的杂交体的稳定性，其中100%—致性以DNA-DNA杂交体的熔融温度Tm来表示，其中所述的等式为Tm-81.5。C+16.6(LogM)+0.41(%GC)-0.61(%form)-500/L,其中M为一价阳离子的摩尔浓度，^GC为DNA中G和C核苷酸的百分比，％form为杂交溶液中曱酰胺的百分比，而L为以碱基对表示的杂交体长度。相对于由100%—致性的杂交体计算的温度而言，Tm每降低rC，允许的错配量便增加1%。因此，如果在特定的盐和甲酰胺浓度下，用于任何给定杂交实验的Tm低于根据Meinkoth等式计算得到的、用于100%杂交体的Tm以IO'C，则即使错配增加至10%,杂交也会发生。如本文所用，高度严格的条件是指耐受多至大约15%的序列差异的那些条件，而中度严格条件是指耐受多至大约20%的序列差异的那些条件。无意于进行限定，高度严格(低于杂交体计算的Tra以12-15。C)条件和中度严格(低于杂交体计算的Tra以15-20'C)条件的实例采用低于杂交体计算的Tm的合适温度下，2XSSC的洗涤溶液(标准的柠檬酸盐)和0.5%的SDS。所述条件的最终严格情况主要应归于洗涤条件，特别是如果所釆用的杂交条件允许较不稳定的杂交体与稳定的杂交体一起形成的那些条件。然后，在更高严格程度的洗涤条件下除去较不稳定的杂交体。可以与上文所述的高度严格至中度严格的洗涤条件一起使用的、普通的杂交条件是在低于Tm以大约2(TC-25^:的温度下，在6XSSC(或6XSSPE)、5XDenhardt，s试剂、0.5°/。SDS、100|ig/ml变性的破碎鲑鱼精子DNA的溶液中进行杂交。如果使用混合探针，则优选的是使用四曱基氯化铵(TMAC)，而并非SSC(Ausubel，1987-1998)。此外，术语"核酸分子，，还包括DNA和RNA的类似物，例如包含经修饰的主链的那些。本发明的另一方面是上文所述的嵌合抗原在作为药物的用途。具体而言，本发明的一个主要目标是提供嵌合抗原在作为活性组分用于制备预防或治疗HCMV感染的药物中的用途。所述的药物组合物应该优选地包含治疗有效量的本发明的嵌合抗原或者相应的核苷酸序列。由此，本发明的嵌合抗原可以起到用于预防或治疗HCMV感染的疫苗的作用。就治疗用途而言，在药物或疫苗的制备在用于进一步参考的普通知识的构架范围内的情况下，读者可以再次参考本说明书中所引用的专利文献。根据本发明的另一方面，提供了多肽疫苗。两种主要类型的多肽疫苗为与佐剂物质混合的多肽，以及与抗原呈递细胞(APC)—起引入的多肽(Mayordomoetal.1995，NatureMed.1:1297)。用于后一种疫苗的最常见细胞是骨髓和外周血来源的树突细胞，因为这些细胞表达辅助激活CTL的共刺激分子。可以通过用编码所述多肽的多核苷酸(例如DNA，RNA)加载APC，或者用所述的多肽本身加载APC来进行所述多肽的呈递。根据第一种类型的多肽疫苗，将刺激免疫原性的佐剂物质与所述的多肽混合，从而改善对所述多肽的免疫应答。免疫佐剂通常被分为两种基本的类型铝盐和油状乳剂。磷酸铝和氢氧化铝(铝)佐剂在基于铝的疫苗中诱导出升高水平的针对抗原的抗体，而这一水平要高于使用相应的水性疫苗所得到的抗体。例如美国专利号5,747,653、6，013，264、6,306,404和6，372，223中所公开的，研发出了大量的基于铝的疫苗，并包括该疫苗的制备方法。但是，铝的化合物并非总能增强疫苗的免疫原性。基于油的佐剂的主要成分为油、乳化剂和免疫刺激剂。最早类型的基于油的乳化佐剂为弗氏不完全佐剂(IFA)(其由大约50:50的油包水乳液构成)、和弗氏完全佐剂(CFA)(其为包含被杀灭的结核菌的相似制备物)。CFA的有效的抗体刺激效果还未被任何其他佐剂超越。然而，由于严重的毒性反应，CFA只可以用于实验目的，而不能用于人或兽用的疫苗中。IFA在人类中的应用限于其中水性疫苗是相对无效的、并且铝的化合物不能提供足够的佐剂活性的那些临床情况。通过增强抗原的免疫原性、作为疫苗佐剂的经改善的乳液的实例包括例如在美国专利号5，961，970中公开的亚微乳液(submicronemulsion)、以及在美国专利号5,716，637中公开的固体脂肪纳米乳液。可以通过多种方法来帮助本发明的多肽的吸收。例如，如美国专利号5,554，378中所公开的那样，霍乱毒素B亚单元的非毒性衍生物，或者内毒素大肠杆菌的治愈不稳定性内毒素的结构相关亚单元B的非毒性衍生物可以被加入到所述的组合物中。可以将本发明的多肽组合物直接施用至个体，以用于免疫个体。备选地，根据本发明的实施方式，所述的多肽可以用于产生具有已知单克隆抗体的特性和活性的新型抗体。使用这些多肽的T-细胞的离体活化还可以引发所需的免疫刺激的活性。因此，所述的组合物可以用于在离体系统中诱导抗体，并且随后可以将所诱导的抗体施用至个体，以用于治疗感染。如本领域所述，所述的组合物还可以用于离体系统中，以便刺激在所采用的免疫治疗方法中待施用的T-细胞。如本文所用的术语"治疗有效量"是指治疗、改善或预防靶向的疾病或状况，或者展示可检测的治疗性或预防性效果所需要的治疗试剂的量。就任何化合物而言，可以在例如肿瘤性细胞的细胞培养物测定法中，或者在动物模型(通常为小鼠、兔、狗或猪)中对治疗有效剂量进行最初的估测。所述的动物模型还可以用于测定施用的合适浓度范围和途径。随后，此类信息可以用于测定在人类中施用的可用剂量和途径。用于人类受试者的精确的有效量取决于疾病状态的严重程度、受试者的总体健康情况、受试者的年龄、受试者的体重、受试者的性别、饮食情况、施用的时间、施用的频率、药物的组合情况、反应的敏感性、以及对治疗的耐受情况/应答情况。可以通过常规的实验来测定所述的量，并且该量在临床医生的判断范围内。所述的组合物可以单独地向患者进行施用，或者可以与其他试剂、药物或激素形成的组合进行施用。药物组合物还可以包含用于施用治疗试剂的可药用的载体。此类栽体包括抗体和其他多肽、基因、和诸如脂质体之类的其他治疗试剂，前体条件是所述的载体本身不能诱导产生对接受所述组合物的个体有害的抗体，并且所述的载体可以在不具有不适的毒性的条件下进行施用。合适的载体可以为大的、緩慢代谢的高分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚甘氨酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物以及无活性的病毒粒子。在治疗组合物中的可药用的载体可以另外包含液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。此外，诸如润湿剂或乳化剂、pH緩沖物质等之类的辅助物质可以存在于所述的组合物中。此类栽体可以使所述的药物组合物被配制成用于患者消化的片剂、丸剂、糖衣丸、胶嚢、液体、凝胶、糖浆、浆料、悬浮液等。本发明的组合物一旦被配制形成，便可以直接施用至受试者。待治疗的受试者可以为动物；具体而言，可以治疗人类受试者。本发明所用的药物组合物可以通过多种途径进行施用，所述的途径包括但不限于口服、静脉内、肌肉内、动脉内、骨髓内、膜内、心室内、透皮或经皮应用(例如参见W098/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、肠、局部、舌下、阴道内或直肠手段。此外，还可以使用基因枪或无针注射器来施用本发明的药物组合物。通常，所述的治疗组合物可以被制备成可注射的液体溶液或悬浮液；此外，还可以制备在注射前适用于溶解于或悬浮于液体媒介物中的固体形成。剂量治疗可以为单剂量时间表或多剂量时间表。治疗患有HCMV感染的哺乳动物的方法代表了本发明的一个方面，其中所述的方法包括施用治疗有效量的上文所述的疫苗。本发明的其他目标是上文所述的重组抗原作为活性试剂用于诊断HCMV感染、特别是作为用于诊断感染时间的用途。此外，用于诊断HCMV感染的、包含至少一种抗原片段或抗原片段的组合或嵌合抗原的试剂盒也是本发明的一部分。此类试剂盒可用于诊断急性和/或潜伏性的HCMV感染。事实上，本发明的重组抗原可以用于任何测定法形式中，其中所述的测定法形式使用已知的抗原用于检测抗体。所有这些测定法的共同特征在于所述的抗原可以在允许该抗原与疑似含有抗体的肌体成分中存在的任何此类抗体发生结合的条件下与所述成分相接触。所述的条件通常为使用了过量抗原的生理温度、PH和离子强度。将抗原与样本温育，然后对由抗原构成的免疫复合物进行检测。免疫测定法的设计经过了多次的改变，并且许多形式都是本领域已知的。多种方案使用了例如固体支承体或免疫沉淀。大部分的测定法涉及使用标记的抗体或多肽；所述的标记物可以为例如酶、焚光、化学发光、放射性或染料分子。扩增免疫复合物的信号的测定法也是已知的；其实例为使用了生物素和抗生物素蛋白的测定法，以及诸如ELISA测定法之类的酶标记或介导的免疫测定法。所述的免疫测定法可以是但不限于异源或同源形式，以及标准的或竟争性的类型。在异源形式中，多肽通常与固体基质或支承体结合，从而有利于在温育之后从多肽中分离出样品。可以使用的固体支承体的实例为硝酸纤维素(例如膜或微孔形式)，聚氯乙烯(例如薄片或微孔)，聚苯乙烯乳胶(例如珠子或微孔板形式)，聚偏氟乙烯(也称为ImmulonTM)，重氮纸，尼龙膜，活化的珠子以及蛋白质A珠子。例如，在异源形式中，可以使用DynatechImmulonTMi或ImmulonTM2孩史孔板，或者0.25英寸的聚苯乙烯珠子(PrecisionPlasticBall)。通常在从测试样品中分离出包含抗原多肽的固体支承体之后、并且在检测结合的抗体之前来洗涤所述的固体支承体。标准的和竟争性的形式也是本领域已知的。在同源形式中，将测试样品与抗原的组合物一起在溶液中温育。例如，可以在能够使所形成的任何抗原-抗体复合物发生沉淀的条件下。用于这些测定法的标准的或竟争性的形式是本领域已知的。在标准的形式中，形成抗体-抗原复合物的抗体的量被直接监测。这可以通过测定经标记的抗异种(例如抗人)的抗体是否由于复合物的形成而发生结合来完成，其中所述的抗体能够识别抗HCMV抗体上的表位。在竟争性的形式中，样品中抗体的量是通过监测对所述的复合物中已知量的标记抗体(或其他竟争性的配体)的结合的竟争性作用来推断的。包含抗HCMV抗体的所形成复合物(或者在竟争性测定法的情况下，竟争性抗体的量)可以通过多种已知技术中的任何技术来检测，这取决于所述的形式。例如，可以使用与标记物(例如酶标记物)复合的抗异种IgG的缀合体来检测所述复合物中的未被标记的抗体。在免疫沉淀或凝集测定形式中，重组抗原与抗体之间的反应形成了从溶液或悬浮液中沉淀出的网络，并且形成了可视的一层或一薄层沉淀物。如果在测试样本中不含有抗HCMV的抗体，则不能形成可视的沉淀物。本发明的重组抗原通常以试剂盒的形式被包装起来以用于这些这些免疫测定法中。当在标记物不能直接产生信号的情况下，所述的测定形式需要相同的信号生成试剂(例如酶底物)时，所述的试剂盒通常在单独的容器中装有抗原(已经与固体基质结合，或者与将它们与基质结合对试剂分离)、对照抗体配制物(阳性和/或阴性)、标记的抗体的组合。用于实施所述测定法的说明书(例如书面的、磁带、VCR、CD-ROM等)通常也被包含在所述的试剂盒内。由此，作为本发明的目标的诊断试剂盒是本领域的专家所已知的。现在，通过实施例和附图来更详细地说明本发明。图1.细菌表达载体pGEX-SN-Flag的质粒图谱。图2.所选择的噬菌体克隆的图示。将从噬菌体展示文库中分离的重組HCMV抗原片段与相应的天然蛋白质的序列进行比对。该图显示出各个克隆的相应氨基酸，以及它们在HCMV蛋白质序列上的位置。图3.重组嵌合抗原的图示。编码HCMV基因产物的蛋白质片段的克隆CM-4.4、CM-2.7、CM-1.3、CM-2.10、CM-3.3和CM-8.3的DNA序列用于构建GST-EC7-Flag，GST-EC8-Flag和GST-EC14融合蛋白质。图4.重组抗原大肠杆菌细胞中的表达。A-经纯化的重组GST(泳道2)、GST-CM1.3(泳道3)、GST-CM2.7(泳道4)、GST-CM4.4(泳道5)、GST-CM2.10(泳道6)、GST-CM3.3(泳道7)、GST-CM7.3(泳道8)和GST-CM8.3(泳道9)融合蛋白质的SDS-PAGE分析。所述的重组蛋白质经过了在12%丙烯酰胺凝胶上的电泳(0，002mg/泳道)。KDa,分子量标记物(泳道1)。B-经纯化的重组GST(泳道2)和嵌合抗原GST-EC7-Flag(泳道3)和GST-EC8-Flag(泳道4)的SDS-PAGE分析(12°/。丙烯酰胺凝胶)。KDa，分子量标记物(泳道1)。C-经纯化的重组GST(泳道l)、以及嵌合抗原GST-EC7-Flag(泳道2)和GST-EC8-Flag(泳道3)的WesternBlot分析，其使用了抗Flag的辣根过氧化物酶缀合的单克隆抗体。实施例入展示HCMVDNA文库的构建来自HCMV(AD169株)的基因组DNA是市售可得的(AdvancedBiotechnology,MD，USA)。4吏用0.5ng的核酸内切酶DNaseI(Sigma-Aldrich，USA)将10iag的总DNA随才几石皮碎。将DNA和Dnasel的混合物在15t:下温育20分钟，并采用"QIAquickPCRPurificationKU"(Qiagen，CA，USA)的手段根据制造商提供的说明书纯化所得的DM片段。通过将所述的DNA与酶T4DM聚合酶(NewEnglandBiolabs，MA，USA)在15。C下温育60分钟，将DM片段的末端"截平(flattened)"。然后，通过在苯酚/氯仿中提取及随后在乙醇中沉淀的手段来纯化所述的片段。使用酶T4DNA连接酶将所得的DNA与20倍摩尔过量的"合成连接体"连接，从而将限制性位点Spel和Notl加入到所述片段的末端。根据Beghetto等人之前所描迷的工艺(Beghettoetal.，Int.J.Parasitol.2003，33:163-173)，使用6个连接体。通过在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳来由所述的连接混合物中除去过量的未连接的连接体，然后由所述的凝胶上切下分子量范围为200bp至1000个碱基对(bp)的DM片段，随后通过"Qiaquickgelextractionkit"(Qiagen，CA，USA)的手段，根据制造商提供的说明书来进行纯化。将载体人KM4用Spel/Notl进行酶切，然后与所述的DNA片段连接。就所述文库的构建而言，形成6种连接混合物，每种混合物都包含0.4Mg的载体和大约7ng的插入物。所述的连接后，将其在体外与"Gigapackgold"(Stratagene，USA)—起包装，并铺板用于感染BB4细胞(大肠杆菌菌林BB4的细菌细胞；Sambrooketal.，1989，MolecularCloning:alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY)。所述的噬菌体在37t:下过夜温育后，在装有SM緩沖剂的平板中对其进行洗脱(Sambrooketal.，1989，MolecularCloning:alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY)，然后进行纯化和浓缩，再在含有7%二甲亚砜的SM緩冲剂中储存在-80'C。以具有插入物的独立克隆的总数来计算的文库的复杂性为2xl()6个克隆。使用人血清进行的HCMV展示文库的亲合力选择将涂敷有蛋白质G(DynabeadsProtein-G，Dynal，Norway)的磁珠在室温下与10u1的人血清温育30分钟。然后，将所得的珠子与封闭溶液在37。C下温育1小时，其中所述的封闭溶液由溶于PBS中的5%脱脂奶粉、0.05%Tween20以及10raMMgS04构成。将大约101。个噬菌体粒子的文库加入到所述的珠子中，并在1ml的封闭溶液中稀释，以用于在室温下进一步温育4小时，并进行轻微的搅拌。将所得的珠子用1ml的洗涤溶液(PBS、1%TritonXlOO、10mMMgS04)洗涤10次。扩增结合的噬菌体以用于感染直接被加入到珠子(每次选择均为1.2ml)中的BB4细胞，随后在室温下温育30分钟。将NZY-TopAgar(Sambrooketal，1989，MolecularCloning:alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY)加入到珠子的混合物中，然后立即将细胞倒入到NZY平板中。将所得的平板在3VC下温育12-16小时。第二天，通过在每个平板中加入15ml的SM緩冲剂来从各平板上收集噬菌体，然后在室温下搅拌4小时。通过在PEG/NaCl(20%聚乙二醇，NaCl1M)中进行沉淀来纯化所述的噬菌体，最后将所得噬菌体悬浮于5ml的SM中，在存放于+4。C下。Phage-ELISA使用抗入多克隆抗体(0.7Mg/ml溶于50mM的NaHC03中，pH9.6)24将多孔板(Maxisorb，Nunc,Denmark)在4°C下涂敷过夜。在除去涂敷溶液后，将所述的板用封闭溶液(溶于PBS中的5%的脱脂奶粉、0.05%Tween-20)温育1小时，然后用洗涤緩沖剂(PBS、0.05%Tween-20)洗涤两次。将IOOjn1含有噬菌体溶解物的封闭溶液混合物加入到各孔中，并在37t:下温育60分钟。在室温下，将lul的人血清与溶于100ul封闭溶液中的109个野生型噬菌体粒子、1jul的兔血清、1ja1的BB4细胞的细菌提取物、1ia1胎牛血清温育30分钟。将所述的板在与噬菌体溶解物温育后洗涤5次，然后在37。C下与血清溶液温育60分钟。然后将所述的板洗涤5次，再与包含抗人IgG辣根过氧化物酶缀合抗体(Sigma-Aldrich,USA)的封闭溶液温育30分钟。将所述的板洗涤5次，使用100ju1的TMB液体底物(Sigma-Aldrich，USA)测定酶活性。15分钟的显影后，通过加入25)il2M的H2S(^来终止反应。最后，^f吏用自动化的ELISA读取器(Multiskan，Labsystem,Finland)分析所述的板，并将所得结果用OD=OD45。nm-OD^^表示。以两个独立测定法的平均值来评估ELISA的数据。免疫篩选通过在室温下温育60分钟的手段将噬菌斑由细菌培养基中转移至硝酸纤维素过滤器(Schleicher&Schuell，Germany)上。在室温下，将该过滤器在封闭溶液(溶于PBS中的5%的脱脂奶粉、0.05°/。Tween-20)中封闭60分钟。将40|a1的人血清与40|i1的BB4细胞的细菌提取物、109个野生型A噬菌体粒子在4ml的封闭溶液中进行预先温育。在除去封闭溶液后，在室温下，将所述的过滤器与所述的血清温育3小时，并进行搅拌。然后，将所述的过滤器用洗涤緩冲剂(PBS、0.05%Tween-20)洗涤5次，再在室温下用抗人IgG碱性磷酸酶缀合抗体(Sigma-Aldrich，USA)在封闭溶液中温育60分钟。在将所述的过滤器洗涤5次以后，加入5ml的显影溶液(底物BCIP和NBT，Sigma-Aldrich，USA)，并通过在水中洗涤过滤器来中断显影。从各个噬菌斑上分离被证明为阳性的噬菌体克隆，然后进行扩增以用于随后的表征(Sambrooketal.，1989，MolecularCloning:alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY)。阳性克隆的表征随后，对所选噬菌体的DNA插入物进行测序，并与当前可用的多个序歹'J数据库(Non—RedundantGenbankCDS,Non—RedundantDatabaseofGenbankEstDivision,Non-ReduiidaiitGenbank+EMBL+DDBJ+PDBSequences)进行对比。所得的序列可以分为三组-编码已知HCMV抗原的片段的序列；-编码已知HCMV蛋白质的片段的序列，但是并不清楚该HCMV蛋白质是否与人抗体应答有关；-编码未知蛋白质的片段的序列(例如ORF)。例如，下表1给出了一些所选克隆的序列表1名称序列特征ACCAAAGACACGTCGTTACAGGCTCCGCCTTCM-2.10CCTACGAGGAAAGTGTTTATAATTCTGGTCGCUL55AAAGGACCGGGACCACCGTCGTCTGATGCAT(SEQID1)CCACGGCGGCTCCGCCTTACAGCAACGAGCA(片段)GGCTTACCAGATGCTTCTGGCCCTGGCCCGTCTGGACGCAGAGCAGCGAGCGCAGCAAAACGGTACAGATTCTTTGGACGGACAGACTGGCACGCATGCTCACATTAACACCGTCTCCTGTCCTACCGTCM-3.3TATGAGGTTCGACCAGCGGCTGCTGGAAGAGUL71GGCGACGAGGAGGATGAAGTGACCGTGATGT(SEQID3)CGCCGTCACCCGAGCCCGTGCAACAGCAGCC(片段)GCCGGTCGAGCCCGTGCAGCAGCAGCCCCAGGGACGCGGGTCTCACCGTCGGCGCTACAAGGAGTCGGCGCCGCAAGAGACGCTGCCTACGAATCACGAACGCGAGATTTTGGATCTCATGCGACACAGCCCCGACGTGCCTCGGGAGGCGGTGATGTCACCGACCATGGTCACCATACCTCCTCCCCAGATACCCTTTGTGGGTTCCGCGCGTGAACTTTCACGTCGCTCTGGCGAACCCTCGACGGTGACM-8.3TTTATATCCCCTCGAGCAACGAGGACACGCCUL25GGCGGATGAGGAGGCGGAGGACAGCGTTTT(SEQID5)CACGAGCACGCGGGCGCGCAGCGCCACGGA(片段)AGATCTGGATCGCATGGAGGCCGGTTTGTCGCCCTACAGCGTCTCCTCGGACGCTCCGTCGTCCTTCGAGCTCGTGCGCGAGACCGGCGGCACCGGCGCCGCCAAGAAACCGAGCGAAAAGAAACGATCGTTT分类糖蛋白-B,包膜蛋白质假定的蛋白质间层蛋白质C丌ATTCTCGAGGAGATTCGACGTCCGCTGCCCM-L3AGATGGCACGGGGGGCGACGGCCCCGAGGGUL56CGAGGCTATTCACCTGCGTGGACGGGAGGCG(SEQID7)CAT(片段)病毒DNA结合蛋白质CM-1.3(SEQID9)ACGAGCCAGAAACCGGTGCTGGGCAAGCGAGTCGCGACGCCGCACGCGTCCGCCCGAGCGCAGACGGTGACGTCGACGCCGGTTCAGGGAAGGCTAGAGAAACAGGTGTCGGGCACGCCGTCGACGGTACCCGCCACGCTGTTGCAACCTCAACCGGCTTCGTCTAAAACGACGTCATCAAGGAACGTGAC丌CTGGCGCGGGAACCTCTTCCGCTTC丌CGGCTCGACAGCCGTCAGCCTCGGCGTCCGTTTTGTCGCCCACGGAGGATGATGTCGTGTCCCCCGCCACATCGCCGCTGTCCATGCTTTCGTCAGCCTCTCCGTCCCCGGCCAAGAGTGCCCCCCCGTCTCCGGTGAAAGGCCGGGGCAGCCGCGTCGGTGTTCCTTCCTTGAAACCTACTTTGGGCGGCAAGGCGGTGGTAGGTCGACCGCCCTCGGTCCCCGTGAGCGGTAGCGCGCCGGGTCGCCTGTCCGGCAGCUL32(片段)间层磷酸化蛋白质(ppl50)CTGGTGGACATCACGGATACCGAGACGAGCGCM-2.7CCAAACCGCCCGTCACCACCGCGTACAAGTTUL32间层磷酸化CGAGCAACCGACGTTGACGTTCGGCGCCGGA(SEQID11)GTTAACGTTCCTGCTGGCGCCGGCGCTGCCA(片段)蛋白质TCCTCACGCCGACGCCTGTCAATCCTTCCACGGCCCCCGCTCCGGCCCCGACACCTACCTTC(ppl50)GCGGGTACCCAAACCCCGGTCAACGGTAACTCGCCCTGGGCTCCGACGGCGCCGTTGCCCGGGGATATGAACCCCGCCAACTGGCCGCGCGAACGCGCGTGGGCCCTCAAGAATCCTCACCTGGC7TACAATCCCTTCAGGATGCCTACGACTTCCACGGCTTCTCAAAACACCGTGTCCACCACCCCTCGGAGGCCGTCGACTCCACGCGCCGCGGTGACACAAACAGCGTCTCGGGACGCCGCTGATGAGGTTTGGGCTTTAAGGGACCTTGGCAGTCAGAAACCGACCAGCGGTCCC7TGACM-4.4ACATCCCGCAACAACAACAGCGTCACGCGGCUL32间层磷酸孑匕TTTCAGTCTCGTCTCCCCGCAGGTGACCAAG(SEQID13)GCCAGCCCGGGAAGGGTCCGTCGGGACAGC(片段)蛋白质GCGTGGGACGTGAGGCCGCTCACGGAGACCAGAGGGGATCTTTTCTCGGGCGACGAGGATT(pp150)CCGACAGCTCGGATGGCTATCCCCCCAACCGTCAAGATCCGCGTTTCACCGACACGCTGGTGGACATCACGGATACCGAGATT序列CM-2.IO构成HCMV基因组的DNA片段，被归为UL55—类，并且编码包膜糖蛋白gB的片段(Pereiraetal，Virol.，1984139:73-86)，该片段从未被鉴定为被人抗体应答所识别的"抗原片段"。所述的克隆具有氨基酸序列QQNGTDSLDGQTGTH(SEQID2)，并且其作为包含表位的片段的用途被涵盖在本发明的范围内。序列CM-3.3构成HCMV基因組的DM片段，被归为UL71—类(Davisonetal.,J.Gen.Virol.2003，84:17-28)，并且编码从未被鉴定为被人体液应答所识别的"抗原"的多肽。所述的克隆具有氨基酸序列A圆TVSCPTVMRFDQRLLEEGDEEDEVTVMSPSPEPVQQQPPVEPVQQQPQGRGSHRRRYKESAPQETLPTNHEREILDLMRHSPDWREAVMSPTMVTIPPPQIPFVGSAREL(SEQID4),并且其作为包含表位的片段用途被涵盖在本发明的范围内。序列CM-8.3构成HCMV基因组的DNA片段，被归为UL25—类，并且编石马间层抗原的片段(Lazzarottoetal.，J.Gen.Virol.2001，82:335-338)，该片段从未被鉴定为被人抗体应答所识别的"抗原片段"。所述的克隆具有氨基酸序列SRRSGEPSTVIYIPSSNEDTPADEEAEDSVFTSTRARSATEDLDRMEAGLSPYSVSSDAPSSFELVRETGGTGAAKKPSEKKRSF(SEQID6),并且其作为包含表位的片段用途被涵盖在本发明的范围内。序列CM-7.3构成HCMV基因组的DNA片段，被归为UL56—类(Kroskyetal.，J.Virol.1998,72:4721-4728)，并且编码从未被鉴定为被人体液应答所识别的"抗原片段，，的该多肽。所述的克隆具有氨基酸序列LILEEIRRPLPDGTGGDGPEGEAIHLRGREAH(SEQID8)，并且其作为包含表位的片段用途被涵盖在本发明的范围内。序列CM-1.3、CM-2.7和CM-4.4构成HCMV基因组的DNA片段，被归为UL32—类，并且编码大型结构的间层磷酸化蛋白质ppl50的片段(Jahnetai，J.Virol.1987，61:1358-1367)，该片段从未被鉴定为可以被人抗体应答所识别的"抗原片段"。所述的克隆具有氨基酸序列TSQKPVLGKRVATPHASARAQTVTSTPVQGRLEKQVSGTPSTVPATLLQPQPASSKTTSSRNVTSGAGTSSASSARQPSASASVLSPTEDDWSPATSPLSMLSSASPSPAKSAPPSPVKGRGSRVGVPSLKPTLGGKAWGRPPSVPVSGSAPGRLSGS(SEQID10),LVDITDTETSAKPPVTTAYKFEQPTLTFGAGVNVPAGAGAAILTPTPVNPSTAPAPAPTPTFAGTQTPVNGNSPWAPTAPLPGDMNPANWPRERAWALKNPHLAYNPFRMPTTSTASQNTVSTTPRRPSTPRAAVTQTASRDAADEVWALRDL(SEQID12),和GSQKPTSGPLNIPQQQQRHAAFSLVSPQVTKASPGRVRRDSAWDVRPLTETRGDLFSGDEDSDSSDGYPPNRQDPRFTDTLVDITDTEI(SEQID14)，并且其作为包含表位的片段用途被涵盖在本发明的范围内。嵌合抗原的构建EC7蛋白质产物为包含克隆CM-1.3/CM-2.7和CM-4.4的DNA序列的嵌合分子。使用寡核苷酸K749(5'-GGACTAGTGGCAGTCAGAAACCGACCAG-30和K751(5'-GGACTAGTGGCAGTCAGAAACCGACCAG-30，SEQID14用作模板，来进行克隆CM-4.4的DNA扩增。寡核苷酸K751包含编码连接体SGGGS的序列，所述的序列将序列CM-4.4与CM-2.7连接起来。PCR的条件为94°C，30";52X:，30";72X:，30";共25个循环。使用寡核苷酸K750(5'-TCTGGTGGCGGTAGCCTGGTGGACATCACGGATAC-3')和K753(5'-CGTGCTACCGCCACCAGAAAGGTCCCTTAAAGCCCAAAC-3')，SEQID12用作模板，来进行克隆CM-2.7的DNA扩增。寡核普酸K753包含编码连接体SGGGS的序列，该序列将序列CM-2.7与CM-1.3连接起来。PCR的条件为94°C，30";52。C，30";72°C，30";共25个循环。使用寡核苷酸K752(5'-TCTGGTGGCGGTAGCACGAGCCAGAAACCGGTGCTG-30和K754(5'-CCGCGGCCGCTGGACACGACATCATCCTCC-3')，SEQID10用作模板，来进行克隆CM-l,3的DM扩增。PCR的条件为94°C，30";52°C，30";72。C,30";共25个循环。通过"QiagenPurificationKit"(Qiagen，CA，USA)手段纯化PCR产物。将50ng的SEQID14的DNA扩增产物和SEQID12的DNA扩增产物混合在一起，并通过使用寡核苷酸K749和K753,以所述的混合物作为模板来进行PCR反应。PCR的条件为94°C,30";52°C，30";72。C，90";共30个循环。将所得的50ng的DNA扩增产物用"QiagenPurificationKit"(Qiagen，CA，USA)进行纯化，然后与50ng的SEQID10的DNA扩增产物混合。最后，通过^f吏用K749和K754,以所述的DNA混合物作为模板来进行DNA扩增，以下为PCR的条件94°C，30";52'C,30";72。C，120";共30个循环。EC8蛋白质产物为含有DNA序列CM-2.10、CM-3.3和CM-8.3的嵌合分子。通过使用寡核苷酸K761(5'-GGACTAGTGCTCACATTAACACCGTCTC-3')和K762(5'-GTGAGCTACCGCCACCAGAAAGTTCACGCGCGGAAC-3,)，以SEQID4作为模板，以用于克隆CM-3.3的DNA扩增。寡核苷酸K762包含编码连接体SGGGS的序列，该序列将序列CM-3.3和CM-8.3连接起来。PCR的方案为94C，30";52C30";72匸，30";共25个循环。通过使用寡核苷酸K763(5'-CTTTCTGGTGGCGGTAGCTCACGTCGCTCTGGCG-3,)和K764(5'-GGTGCTACCGCCACCAGAAAACGATCGTTTCTTTTCGC-30，以SEQID6作为模板，以用于克隆CM-8.3的DNA扩增。所述的寡核苷酸K764包含编码连接体SGGGS的序列，该序列将序列CM-8.3和CM-2.10连接起来。PCR的方案为:94°C，30";52°C,30";72°C,30";共25个循环。通过使用寡核苷酸K765(5'-TTTTCTGGTGGCGGTAGCACCAAAGACACGTCGTTAC—30和K766(5'-CCGCGGCCGCTACCGCCACCAGAATGCG-3')，以SEQID2作为模板，以用于克隆CM-2.10的DNA扩增。PCR的方案为94X:，30";52°C，30";72°C,30";共25个循环。通过"QiagenPurificationKit"(Qiagen，CA，USA)手段纯化所得的PCR产物。将50ng的SEQID6的DNA扩增产物和SEQID8的DM扩增产物混合在一起，并通过使用寡核苷酸K761和K764,以所述的混合物作为模板来进行PCR反应。PCR的方案为94°C，30";52^C，30";72。C，90";共30个循环。将所得的50ng的DNA扩增产物进行纯化，然后与50ng的SEQID2的DNA扩增产物混合。最后，通过使用K761和K766,以所述的DNA混合物作为才莫板来进行DNA扩增，随后进行的PCR的条件为94°C,30";52C，30";72°C，120";共30个循环。EC14蛋白质产物为包含克隆CM-2.7、CM-2.10和CM-1.3的DNA序列的嵌合分子。通过使用寡核苷酸K825(5'-GGGGATCCCACTAGTCGTGCTGGCCAGCCGCTG-3,)和K826(5'-GGTGCTACCGCCACCAGAAAGGTCCCTTAAAGCCCAAAC-30,以SEQID12作为才莫板，以用于克隆CM-2.7的DNA扩增。寡核普酸K826包含编码连接体SGGGS的序列，该将序列CM-2.7和CM-2.IQ连接起来。通过使用寡核苷酸K827(5'-CCTTTCTGGTGGCGGTAGCACCAAAGACACGTCGTTACAG-30和K828(5'-GAGACTACCACCCCCGGAATGCGTGCCAGTCTGTCCG-30，以SEQID2作为模板，以用于克隆CM-2.10的DNA扩增。通过使用寡核苷酸K829(5'-CATTCCGGGGGTGGTAGTCTCACGAGCCAGAAACCGG-3')和K830(5'-CCAGACTCGAGTCACCCGCGGCCGCTACCGCCACCAGAGCTGCO)，以SEQIDIO作为模板，以用于克隆CM-l.3的DNA扩增。通过"QiagenPurificationKit"(Qiagen，CA，USA)手段纯化所得的PCR产物。将50ng的SEQID12的DNA扩增产物和SEQID2的DM扩增产物混合在一起，并通过使用寡核苷酸K825和K828，以所述的混合物作为模板来进行PCR反应。PCR的条件为94"C，30";50°C,30";72°C，90";共30个循环。将所得的50ng的DNA扩增产物用"QiagenPurificationKit"(Qiagen，CA，USA)进4亍纯4t，然后与50ng的SEQID10的DNA扩增产物混合。最后，通过使用K825和K830，以所述的DNA混合物作为模板来进行DNA扩增，随后进行的PCR的条件为:94°C，30";50°C，30";72。C，120";共30个循环。例如，下表2给出了EC7和EC8嵌合抗原的DNA序列表2_名称_______ACTAGTGGCAGTCAGAAACCGACCAGCGGTCCCTTGAACATCCCGC~EC7AACAACAACAGCGTCACGCGGCTTTCAGTCTCGTCTCCCCGCAGGTGACCAAGGCCAGCCCGGGAAGGGTCCGTCGGGACAGCGCGTGGGAC(SEQID15)GTGAGGCCGCTCACGGAGACCAGAGGGGATCTTTTCTCGGGCGACGAGGATTCCGACAGCTCGGATGGCTATCCCCCCAACCGTCAAGATCCGCGTTTCACCGACACGCTGGTGGACATCACGGATACCGAGATTTCTGGTGGCGGTAGCCTGGTGGACATCACGGATACCGAGACGAGCGCCAAACCGCCCGTCACCACCGCGTACAAGTTCGAGCAACCGACGTTGACGTTCGGCGCCGGAGTTAACGTTCCTGCTGGCGCCGGCGCTGCCATCCTCACGCCGACGCCTGTCAATCCTTCCACGGCCCCCGCTCCGGCCCCGACACCTACCTTCGCGGGTACCCAAACCCCGGTCAACGGTAACTCGCCCTGGGCTCCGACGGCGCCGTTGCCCGGGGATATGAACCCCGCCAACTGGCCGCGCGAACGCGCGTGGGCCCTCAAGAATCCTCACCTGGCTTACAATCCCTTCAGGATGCCTACGACTTCCACGGCTTCTCAAAACACCGTGTCCACCACCCCTCGGAGGCCGTCGACTCCACGCGCCGCGGTGACACAAACAGCGTCTCGGGACGCCGCTGATGAGGTTTGGGCTTTAAGGGACCTTTCTGGTGGCGGTAGCACGAGCCAGAAACCGGTGCTGGGCAAGCGAGTCGCGACGCCGCACGCGTCCGCCCGAGCGCAGACGGTGACGTCGACACCGGTTCAGGGAAGGGTAGAGAAACAGGTATCGGGCACGCCGTCGACGGTACCCGCCACGCTGTTGCAACCTCAACCGGCTTCGTCTAAAACAACGTCATCAAGGAACGTGACTTCTGGCGCGAGAACCTCTTCCGCTTCGGCTCGACAGCCGTCAGCCTCGGCGTCCGTTTTGTCGCCCACGGAGGATGATGTCGTGTCCCCCTCTGGTGGCGGTAGCGGCCGCACTAGTGCTCACATTAACACCGTCTCCTGTCCTACCGTTATGAGGTTCEC8GACCAGCGGCTGCTGGAAGAGGGCGACGAGGAGGATGAAGTGACCGTGATGTCGCCGTCACCCGAGCCCGTGCAACAGCAGCCGCCGGTCG(SEQID17)AGCCCGTGCAGCAGCAGCCCCAGGGACGCGGGTCTCACCGTCGGCGCTACAAGGAGTCGGCGCCGCAAGAGACGCTGCCTACGAATCACGAACGCGAGATTTTGGATCTCATGCGACACAGCCCCGACGTGCCTCGGGAGGCGGTGATGTCACCGACCATGGTCACCATACCTCCTCCCCAGATACCCTTTGTGGGTTCCGCGCGTGAACTTTCTGGTGGCGGTAGCTCACGTCGCTCTGGCGAACCCTCGACGGTGATTTATATCCCCTCGAGCAACGAGGACACGCCGGCGGATGAGGAGGCGGAGGACAGCGTTTTCACGAGCACGCGGGCGCGCAGCGCCACGGAAGATCTGGATCGCATGGAGGCCGGTTTGTCGCCCTACAGCGTCTCCTCGGACGCTCCGTCGTCCTTCGAGCTCGTGCGCGAGACCGGCGGCACCGGCGCCGCCAAGAAACCGAGCGAAAAGAAACGATCGTTTTCTGGTGGCGGTAGCACCAAAGACACGTCGTTACAGGC丁CCGCCTTCCTACGAGGAAAGTGTTTATAATTCTGGTCGCAAAGGACCGGGACCACCGTCGTCTGATGCATCCACGGCGGCTCCGCCTTACACCAACGAGCAGGCTTACCAGATGCTTCTGGCCCTGGCCCGTCTGGACGCAGAGCAGCGAGCGCAGCAAAACGGTACAGATTCT7TGGACGGACAGACTGGCACGCATTCTGGTGGCGGTAGCGGCCGCACTAGTCGTGCTGGCCAGCCGCTGGTGGACATCACGGATACCGAGAEC14CGAGCGCCAAACCGCCCGTCACCACCGCGTACAAGTTCGAGCAACCGACGTTGACGTTCGGCGCCGGAGTTAACGTTCCTGCTGGCGCCGGC(SEQID35)GCTGCCATCCTCACGCCGACGCCTGTCAATCCTTCCACGGCCCCCGCTCCGGCCCCGACACCTACCTTCGCGGGTACCCAAACCCCGGTCAACGGTAACTCGCCCTGGGCTCCGACGGCGCCGTTGCCCGGGGATATGAACCCCGCCAACTGGCCGCGCGAACGCGCGTGGGCCCTCAAGAATCCTCACCTGGCTTACAATCCCTTCAGGATGCCTACGACTTCCACGGCTTCTCAAAACACCGTGTCCACCACCCCTCGGAGGCCGTCGACTCCACGCGCCGCGGTGACACAAACAGCGTCTCGGGACGCCGCTGATGAGGTTTGGGCTTTAAGGGACCTTTCTGGTGGCGGTAGCACCAAAGACACGTCGTTACAGGCTCCGCCTTCCTACGAGGAAAGTGTTTATAATTCTGGTCGCAAAGGACCGGGACCACCGTCGTCTGATGCATCCACGGCGGCTCCGCCTTACACCAACGAGCAGGCTTACCAGATGCTTCTGGCCCTGGCCCGTCTGGACGCAGAGCAGCGAGCGCAGCAAAACGGTACAGATTCTTTGGACGGACAGACTGGCACGCATTCCGGGGGTGGTAGTCTCACGAGCCAGAAACCGGTGCTGGGCAAGCGAGTCGCGACGCCGCACGCGTCCGCCCGAGCGCAGACGGTGACGTCGACGCCGGTTCAGGGAAGGCTAGAGAAACAGGTGTCGGGCACGCCGTCGACGGTACCCGCCACGCTGTTGCAACCTCAACCGGCTTCGTCTAAAACGACGTCATCAAGGAACGTGACTTCTGGCGCGGGAACCTCTTCCGCTTCTTCGGCTCGACAGCCGTCAGCCTCGGCGTCCGTTTTGTCGCCCACGGAGGATGATGTCGTGTCCCCCGCCACATCGCCGCTGTCCATGCTTTCGTCAGCCTCTCCGTCCCCGGCCAAGAGTGCCCCCCCGTCTCCGGTGAAAGGCCGGGGCAGCCGCGTCGGTGTTCCTTCCTTGAAACCTACTTTGGGCGGCAAGGCGGTGGTAGGTCGACCGCCCTCGGTCCCCGTGAGCGGTAGCGCGCCGGGTCGCCTGTCCGGCAGCTCTGGTGGCGGTAGCGGCCGC嵌合蛋白质EC7具有氨基酸序列TSGSQKPTSGPLNIPQQQQRHAAFSLVSPQVTKASPGRVRRDSAWDVRPLTETRGDLFSGDEDSDSSDGYPPNRQDPRFTDTLVDITDTEISGGGSLVDITDTETTAYKFEQPTLTFGAGVNVPAGAGAAILTPTPVNPSTAPAPAPTPTFAGTQTPVNGNSPWAPTAPLPGDMNPA隨PRERAWALKNPHLAYNPFRMPTTSTASQNTVSTTPRRPSTPRAAVTQTASRDAADEVWALRDLSGGGSTSQKPVLGKRVATPHASARAQTVTSTPVQGRVEKQVSGTPSTVPATLLQPQPASSKTTSSRNVTSGARTSSASARQPSASASVLSPTEDDVVSPSGGGSGR(SEQID16)，并且其作为包含多个HCMV蛋白质片段的重組抗原的用途也被涵盖在本发明的范围内。嵌合蛋白质EC8具有氨基酸序列TSAHINTVSCPTVMRFDQRLLEEGDEEDEVTVMSPSPEPVQQQPPVEPVQQQPQGRGSHRRRYKESAPQETLPTNHEREILDLMRHSPDVPREAVMSPTMVTIPPPQIPFVGSARELSGGGSSRRSGEPSTVIYIPSSNEDTPADEEAEDSVFTSTRARSATEDLDRMEAGLSPYSVSSDAPSSFELVRETGGTGAAKKPSEKKRSFSGGGSTKDTSLQAPPSYEESVYNSGRKGPGPPSSDASTAAPPYTNEQAYQMLLALARLDAEQRAQQNGTDSLDGQTGTHSGGGSGR(SEQID18),并且其作为包含多个HCMV蛋白质片段的重组抗原的用途也被涵盖在本发明的范围内。嵌合蛋白质EC14具有氨基酸序列PLVDITDTETSAKPPVTTAYKFEQPTLTFGAGVNVPAGAGAAILTPTPVNPSTAPAPAPTPTFAGTQTPVNGNSPWAPTAPLPGDMNPA瞎PRERAWALKNPHLAYNPFRMPTTSTASQNTVSTTPRRPSTPRAAVTQTASRDAADEVWALRDLSGGGSTKDTSLQAPPSYEESVYNSGRKGPGPPSSDASTAAPPYTNEQAYQMLLALARLDAEQRAQQNGTDSLDGQTGTHSGGGSLTSQKPVLGKRVATPHASARAQTVTSTPVQGRLEKQVSGTPSTVPATLLQPQPASSKTTSSRNVTSGAGTSSASSARQPSASASVLSPTEDDWSPATSPLSMLSSASPSPAKSAPPSPVKGRGSRVGVPSLKPTLGGKAWGRPPSVPVSGSAPGRLSGSSGGGSGR(SEQIDNO:36)，并且其作为包含多个HCMV蛋白质片段的重组抗原的用途也被涵盖在本发明的范围内。指导重组抗原作为与GST的融合产物在大肠杆菌细胞的细胞质中进行表达的DNA的构建将编码所选HCMV噬菌体克隆的DNA片段作为与蛋白质谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合产物进行克隆，并在细菌细胞的细胞质中表达出可溶性的蛋白质，以用于测定这些蛋白质的特异性和选择性。使用限制性酶Spel和Notl对克隆CM-2.10、CM-3.3、CM-8.3、CM-7.3、CM-1.2、CM-1.3、CM-1.5、CM-2.7、CM-2.11和CM-4.4的DNA序列进行消化。将经消化的DNA克隆到载体pGEX-SN(Minenkovaetal，InternationalJournalofCancer,2003，106:534-44)中，其中所述的载体事先使用Spel和Notl核酸内切酶进行消化，从而在GST蛋白质的羧基末端形成融合产物。此外，将编码嵌合抗原EC7、EC8和EC14的DNA克隆到载体pGEX-SN和pGEX-SN-Flag中，从而产生GST融合产物。通过插入短的dsDNA序列来构建质粒pGEX-SN-Flag，其中所述的dsDNA序列是通过将寡核苷酸K718(5'-GGCCGCGGAGACTACAAAGACGACGATGACAAATGAG-)和K719(5'-AATTCTCATTTGTCATCGTCGTCTTTGTAGTCTCCGC-3')退火到经Spe卜Notl消化的pGEX-SN载体中而得到的(参见图1)。根据标准的方案，将所得的质粒用于转化感受态的大肠杆菌细胞(Sambrooketal，1989，MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor)。重组抗原的生物化学表征在经转化的大肠杆菌细胞的细胞质中表达重组GST融合蛋白质，并通过寸吏用谷脱甘狀一J京月旨糖树月旨(AmershamPharmaciaBiotech,Sweden)的亲合层析根据制造商提供的说明书来进行纯化。分别通过SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析和Bradford测定法来评估蛋白质的纯度和浓度。使用抗-FLAG-M2单克隆抗体(ljag/ml;Sigma-Aldrich,USA)作为一级抗体、碱性硫酸酶缀合的山羊抗小鼠IgG的抗体(以1:10000的比例进行稀释；Sigma-Aldrich，USA)作为二级抗体、以及硝基四氮唑兰(NBT)加上5-溴-4-氯-3-吲咪磷酸酯(BCIP)作为底物，将所得的重组嵌合抗原GST-EC7-Flag和GST-EC8-Flag进行Western印迹分析。将亲合纯化的重组产物针对PBS进行透析，然后用PBS以lmg/ml的浓度进行稀释，再储存于-20匸，直至使用。纯化产物的产率为4mg/升至15mg/升细菌培养物。单一的重组抗原片段与得自HCMV感染个体的血清的IgG抗体的免疫反应性IgGRec-ELISA通过使用溶于涂敷緩沖剂(50mMNaHC03，pH9.6)中的浓度为1Ug/ml的单一抗原片段来涂敷Maxisorb多孔板(Nunc)，从而进行GST融合产物的ELISA过程。在4。C下温育过夜后，将所述的板在3rC下与封闭緩沖剂(溶于PBS中的5°/。脱脂奶粉，0.05%Tween-20)温育lh，随后与得自HCMV血清阳性和血清阴性的个体的血清在37。C下温育lh，其中所述的血清用封闭溶液以1:100进行稀释。将所述的板用溶于PBS中的0.05。/。Tween-20进行充分的洗涤，然后将在封闭溶液中以1:7500进行稀释的抗人IgG碱性磷酸酶缀合抗体(Sigma-Aldrich，USA)加入到各个孔中。在30分钟后，在37。C下，洗涤所述的板，并在显影溶液(10%二乙醇胺，pH9.8、0.5mMMgCh、0.05%NaN》中与发色团底物对硝基苯基磷酸酯(pNPP;Sigma-Aldrich，USA)温育。将所得的结果记录为使用自动化的ELISA读取器(MultiskanLabsystems，Finland)在405認和620nm处的光学密度(OD)之间的差异。就各种血清样品而言，一式两份进行测定，并计算平均值。下表3概括了基于单一抗原片段的ELISA测定法的结果，其中所述的单一抗原片段表达为GST融合蛋白质，并使用了得自36个HCMV血清阳性和33个HCMV血清阴性的个体的血清样品。使用全细胞HCMV抗原测定法ETI-CYTOK-GPLUS(Diasorin，Saluggia，Italy),根据制造商提供的说明书来测定血清样品中HCMV特异性的IgG。就每一种重组抗原而言，截止值(cutoffvalue)被测定为平均值+由HCMVIgG阴性血清得到的、三倍吸光读数的标准偏差。作为对照，对各种血清估测针对野生型GST蛋白质的IgG反应性。用于评估针对单一重组抗原的阳性IgG反应性的it断标准为OD。st抗原大于截止值，并且ODgst抗原大于0DGST。在表3的各栏中报道了反应性血清的数量和相应的百分比。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>下表4示出了使用来自25个妇女的血清样品(CA1-CAM)的IgGRec-ELISA测定法结果，其中所述的妇女在近期发生了HCMV的再活化，或者在怀孕过程中发生二次HCMV感染。使用全细胞HCMV抗原测定法ETI-CYTOK-GPLUS(Diasorin，Saluggia，Italy),或者通过使用单一的重组抗原免疫测定法来测定血清样品中HCMV特异性的IgG。就每一种GST-融合产物而言，截止值被测定为平均值+由HCMV血清反应呈阴性的受试者得到的、吸光读数的3SD(n=20)。ETI-CYTO-KPLUS,GST-CM2.10、GST-CM3.3、GST-CM8.3、GST-CM7.3、GST-CM1.3、GST-CM2.7和GST-CM4.4的截止值分别为0.2、0.073、0.078、0.101、0.089、0.145、0.147和0.138。以粗体字打印的值表示阳性应答。请注意，使用标准测定法得到的光学密度的数值不能与其他方法的数值比较，这是因为所有的测定法都是在未参照国际标准的情况下进行的。CYTOK~IgGRec-ELISA(光学密度)—样品GPLUSCM1.3CM2.7CM4.4CM2.10CM3.3CM8.3CM7.3诊断测试敏感性特异性一致性_^_^_(%)ET卜CYTOK-GPLUSTOD"TOOTOD""CM1.3Rec-ELISA92.010096.6CM2.7Rec-EUSA96.010098.3CM4.4Rec-ELISA88.010094.8CM2.10Rec-ELISA100100100CM3.3Rec-EUSA92.097.194.8CM8.3Rec-ELISA36.010072.4CM7.3Rec-ELISA56.010081.0'PPV:阳性预测值；NPV:阴性预测值。下表5示出了与使用单一重组抗原(IgGRec-ELISA)所得结果相比的、商业化测定法(ETI-CYTOK-GPLUS)的性能特征。由表5可以清楚地知道，当使用本发明的重组抗原片段时，除了基于CMV-3.3抗原片段的Rec-ELISA以外，所述测定法的特异性和阳性预测值(参见第3栏和第5栏，均报道了假阳性的发生情况)均达到了最大值(100%)。表5_1.9080.7270.5241.0080.2450.6972.3001.4452.2310.1422.8963.1962.4670.3820.2570.1192.8322.3932.6372.0301.2463.1173.1911.7222.9041.7270.8460.0490.0660.1640.3130.0610.1180.0820.1190.0600.0810.0660.3860.0740.1200.1310.3030.0540.0621.2681.7110.0780.0710.0550.0600.0640.1100.0640.0850.0600.0610.0800.0760.0690.13B0.1230.2040.1250.2860.0770.0810.1030.0580.1100.0770.0650.1521.2670.3561.2100.7850.5660.4200.7980.7871.2531.09901374870586816291576053056593.1653.2980.3890.诉10.1251.1970.7111,1733.0310.7263.1770.43820572657591.8412.0701.3841.4962.7482.3103.0462.8871加20.1280.1570.1420.0890.34013178914710.3400.1970.1520.0590.0750.1550.3950.4660.2630.1410.3951.1540.3552,3130.5920.2180.2800.S150.1772.0462.4182邻11.9421.3572.5923.0212.379n46674733626394506215920395991623424508387547039471755775929082310.4451.815pNppT9991967孤37o3ooooo8-oooooo5oo11119110123456789012345ccccccccccccccccccccccccc》1011c5cfcJOOO11cs0JT^74.14o3csf3<q1:J重组嵌合抗原与来自HCMV感染个体血清的IgG抗体的免疫反应性通过使用溶于涂敷緩冲剂中的浓度分别为0.5jLig/ml、2jug/ml和3Mg/ml的GST-EC7-Flag、GST-EC8-Flag和GST-EC14来涂敷Maxisorb板(Nunc)，从而进行重组嵌合抗原的ELISA过程。在4。C下温育过夜后，将所述的板在37。C下与封闭緩沖剂(溶于PBS中的5%脱脂奶粉、0.05。/。Tween-20)温育lh，随后与血清样品在37。C下温育lh，其中所述的血清样品以1:IOO稀释于封闭溶液中。将所述的板用溶于PBS中的0.05%Tween-20进行洗涤，然后将在封闭溶液中以1:20000进行稀释的抗人IgG辣根过氧化物酶缀合的抗体(1mg/ml;Sigma-Aldrich，USA)加入到各个孔中。最后，将所述的板与发色团底物四甲基联苯胺(TMB;Sigraa-Aldrich，USA)温育显示出酶的活性。将所得的结果记录为4吏用自动化的ELISA读取器(LabsystemMulUskan，Finland)在450nm和620nm处的光学密度(OpticalDensity,OD)之间的差异。就各种血清样品而言，一式两份进行测定，并计算平均值。下表6示出了使用嵌合抗原EC7-Flag、EC8-Flag和GST-EC14，或者全细胞HCMV抗原测定法ETI-CYTOK-GPLUS(Diasorin,SaluggiaItaly)的ELISA测定法的结果，其中使用的血清样品来自36个HCMV血清阳性(C1-C36)和33个HCMV血清阴性(N1-NH)的个体。就每一种嵌合抗原而言，截止值被测定为平均值+由HCMV血清阴性的受试者得到的、吸光读数的3SD。ETI-CYT0-KPLUS、GST-EC7-Flag、GST-EC8-Flag和GST-EC14的截止值分别为0.296、0.296、0.273和0.203。以粗体字打印的值表示阳性应答。请注意，使用标准测定法得到的光学密度的数值不能与其他方法的数值比较，这是因为所有的测定都是在未参照国际标准的情况下进行的。表6_样品ELISA测定法(光学密度)ETI-CYTOKGPLUSGST-EC7-FlagGST-EC8-FlagGST-EC140.8051.6791.4612.8961.3712.3602.2602.5851.9750.9611.3850.6570.6241.1710.S762.7722.1152.0192.1370.6372.6380.6223.0281.0271.3330.6681.7560.7591.5021.8691.2080.5230.9070.7370邻80.2810.7462.1322.4552.卿1.2263.0182.1531.4052.3402.7411.4111.2061.6710.8991.0923.1042.8311.4682.0451.0972.9961.0113.2010.9351.1461.3271.S260.8282.6132.2410.9171.5230.4242.2422.3020.2540.6262加61.6872.1851.8592.3371.5142.7712.4212.4991.4801.8251.1611.0448625271321750657176338620522761153922259060.486>-__r>i__0123456789012345678901235:56cccoccccccccccccccccccccccccccccccccS703276920559397214412411133S05253101222222122101112321031312121201102232134471787108106438<002222111111110210001表6血清_ELISA测定(光学密度)_样品ETI-CYT0KGPLUSGST-EC7-FlagGST-EC8-FlagGST-EC14下表7示出了与使用EC7和EC8嵌合抗原(IgGRec-ELISA)所得结果相比的、商业化测定法(ETI-CYTOK-GPLUS)的性能特征。由表7可以清楚地知道，当使用本发明的嵌合抗原时，所述测定法的敏感性(参见第2栏，报道了假阳性的发生情况)达到了最大值。此外，应该注意，4吏用了裂解的全细胞CMV抗原的商业化测试ETI-CYTOK-G以及具有嵌合抗原EC7或EC14的IgGrec-ELISA都显示出一致的性能特征，同时保持了通常与使用重组抗原所进行的测定法相关的、可再现的水平。0.0870.1740.1290.1210.0570.2730.0950.09200900.1190.0890.0930.0800.0840.1050.1140.1780.2760.1180.1180.172O細0.1030,1360.0850.0960.0960.0710.1000.0470.1670.0690.0740.1410.0730.0840.0760.1490.0750.0640.0690.1450.0400.0490.1860.1070.0510.1190.0540.1760.1320.0620.0850.0310.0550.0470.0400.0580.1690.1120.0380.0860.0510.1390.1460.0150.0490.3020.0370.0670.0430.1130.0490.1320.0520.0550.0410.3280.1120.1270.1010.0880.0950.0730.0340.0990.0450.1020.1620.0520.0560.0390.0720.1390.1230.0770,0640.1290.07701234523456789111111NNNNNNNNNNNNNN456789012345678901111111222222222233STINNNNNNNNNNNN2333NNNN845148327348740682501640166785226868811489O4O7538517196469Q01OO6179表7<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>'PPV:阳性预测值；NPV:阴性预测值。权利要求1.一种包含HCMV蛋白质的至少3个不同抗原性区域的融合物的嵌合重组抗原，其中所述的抗原性区域为B细胞表位，该B细胞表位与HCMV特异性抗体结合，其中所述的3个不同抗原性区域中的一个区域由氨基酸序列SEQIDNO2或SEQIDNO12构成。2.权利要求1所述的嵌合抗原，其中所述的HCMV特异性抗体是从已经感染有HCMV的受试者的血清提取得到的。3.权利要求1或2所述的嵌合抗原，其中所述的3个不同的抗原性区域通过共价键或肽连接体连接起来。4.任何前述权利要求所述的嵌合抗原，其中所述的嵌合抗原包含SEQIDNO:2和SEQIDNO:12所示的氨基酸序列。5.权利要求1至4中任一项所述的嵌合抗原，其中所述的嵌合抗原进一步包含SEQIDNO:IO的氨基酸序列。6.权利要求1至3中任一项所述的嵌合抗原，其中所述的嵌合抗原进一步包含SEQIDNO:n的氨基酸序列。7.权利要求1至3中任一项所述的嵌合抗原，其中所述的嵌合抗原进一步包含选自SEQIDNO:4、SEQIDNO:6和SEQIDNO:8的氨基酸序列。8.权利要求1至3中任一项所述的嵌合抗原，其包含SEQIDNO:16的氨基酸序列。9.权利要求1至3中任一项所述的嵌合抗原，其包含SEQIDNO:18的氨基酸序列。10.权利要求l至3中任一项所述的嵌合抗原，其包含SEQIDNO:36的氨基酸序列。11.一种编码根据任何前述权利要求所述的抗原的核苷酸序列。12.根据权利要求11所述的核苷酸序列，其包含SEQIDNO:15的核苷酸序列。13.根据权利要求11所述的核苷酸序列，其包含SEQIDNO:17的核苷酸序列。14.根据权利要求11所述的核苷酸序列，其包含SEQIDNO:35的核苷酸序列。15.—种在严格的杂交条件下与根据权利要求11至14的任何序列发生杂交的核苷酸序列。16.由权利要求15所述的核苷酸序列编码的嵌合重组抗原。17.权利要求11至15中任一项所述的核苷酸序列，其为DNA序列。18.—种包含权利要求17所述的DNA序列的载体。19.一种使用权利要求18所述的载体转化的宿主细胞。20.—种用于生产根据权利要求1至10、或16中任一项所述的抗原的方法，其包括培养权利要求19所述的宿主细胞，以及分离所需的产物。21.根据权利要求1至10、或16中任一项所述的抗原作为活性试剂用于诊断HCMV感染的用途。22.—种用于检测HCMV感染的诊断试剂，其包含至少一种根据权利要求1至10、或16中任一项所述的抗原。23.—种用于诊断HCMV感染的测定试剂盒，其包含至少一种根据权利要求22所述的诊断试剂。24.—种用于诊断HCMV感染的方法，其包括将测试样品与根据权利要求22所述的诊断试剂相接触。25.根据权利要求24所述的方法，其中就HCMV抗体的存在情况来检查所述的测试样品，并且所述的方法包括以下步骤(i)将所述的测试样品与权利要求22所述的诊断试剂一起温育；(ii)允许形成抗体-诊断试剂的复合物；以及(iii)检测所述复合物的存在情况。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述的测试样品为怀疑感染有HCMV的受试者的血清或血浆。27.根据权利要求1至10、或16中任一项所述的抗原作为药物的用途。28.权利要求1至10、或16中任一项所述的抗原作为活性组分在制备用于预防或治疗HCMV感染的药物中的用途。29.权利要求11至15中任一项所述的核苷酸序列作为药物的用途。30.权利要求11至15中任一项所述的核苷酸序列在制备用于治疗或预防HCMV感染的药物中的用途。31.—种免疫调节疫苗，其包含至少一种根据权利要求1至10、或16所述的抗原，以及佐剂。32.根据权利要求31所述的疫苗，其中所述的佐剂选自铝盐以及水包油的乳液。33.—种药物组合物，特别是疫苗形式的药物组合物，其包含至少一种权利要求1至10、或16中任一项所述的抗原。34.—种药物组合物，特别是疫苗形式的药物组合物，其包含至少一种权利要求11至15中任一项所述的核苷酸序列。35.根据权利要求33或34所述的组合物，其适用于在人和/或兽中使用。36.—种治疗患有HCMV感染的哺乳动物的方法，其包括施用治疗有效量的权利要求31至35中任一项所述的疫苗。全文摘要本文所述的发明涉及与针对HCMV感染的人类B-细胞应答的HCMV蛋白质的抗原性区域的鉴定方法，将这些抗原性区域组合成嵌合融合产物的形式的方法，以及它们作为诊断和免疫原性试剂的用途。文档编号C07K14/045GK101605808SQ200880004508公开日2009年12月16日申请日期2008年2月5日优先权日2007年2月7日发明者A·斯帕东尼,E·贝赫托,F·德帕奥利斯,N·加尔加诺申请人:希格马托制药工业公司