专利名称：Hiv－1多表位重组膜抗原及其表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及HIV抗原，尤其涉及HIV-1多表位重组膜抗原。
慢性病毒属HIV-1是人类获得性免疫缺陷综合症的致病因子之一。HIV-1蛋白对于病毒感染的诊断具有重要意义。因这些蛋白能在感染者体中诱发相应抗体。其中最重要的蛋白是env基因表达的产物。该基因表达一个前体多蛋白，糖基化后，被酶解成两种蛋白，一种为外膜蛋白gp120，另一种为跨膜蛋白gp41。两种糖蛋白包含许多变异区与保守区，对决定HIV的宿主特异性及感染过程具有不同的重要功能。gp120高度变异，具有高度的免疫原性，能诱导机体产生抗体，其中许多为中和抗体。gp120的C-端则存在一个高度保守的免疫优势表位，能检出约70％的HIV-1阳性血清，对HIV-1的诊断具有重要意义。gp41则高度保守，不同株之间的相似性可达80％，且不含有高变区。据有关文献表明，gp41的膜外区含有三个保守的免疫优势表位簇第一表位簇包括584～609氨基酸残基，它识别几乎所有的感染血清；第二表位簇包括649～668氨基酸残基，能识别80％的HIV-1阳性血清；第三位表位簇则是构象依赖的，抗体与该表位的结合可能依赖于两个不连续的螺旋区域，针对gp41的抗体出现在感染的早期并持续到病程发展的末期，是HIV-1感染血清学检测的最理想抗原。
早期利用合成肽及重组蛋白的实验结果表明，gp41上存在一个包含一个二硫键的免疫优势表位。利用包含该优势表位的合成多肽以及重组抗原，能检测多数的阳性血清，但往往需要附加gp120 C-端合成肽以及g24重组蛋白等抗原，才能获得满意的灵敏度。chang等人在E.coli中表达的gp41重组蛋白P121。包含了第一表位簇在内的81个氨基酸残基，用其检测240份HIV-1阳性血清，有两份漏检。
本实验室曾在E.coli中高效表达了重组抗原，该抗原包括gp41的100个氨基酸残基，单独使用该抗原包被ELISA板，不能通过鉴定。
本发明的目的在于重组一个多表位的膜抗原MEre，能基本覆盖gp120与gp41上所有已知的高度保守的免疫优势表位，使其特异性及灵敏度达到100％。
本发明的目的通过以下技术方案得以实现。
删除gp41N端519～547之间的疏水区域，设计合适的接头，使MEre基因通过表达载体在E.coli中高效表达，获得包括gp120上C-端高度保守的37aa亲水区域及gp41大部分膜外区域(548～675)的高特异性及高灵敏度的抗原。
与现有技术相比，本发明重组的抗原MEre，包括了几乎gp120和gp41上所有已知的高度保守的免疫优势表位，其特异性及灵敏度可达到100％。
图1为HIV-1多表位重组膜抗原的DNA编码序列。
图2为HIV-1多表位重组膜抗原的氨基酸序列。
本发明的实施例包括以下步骤1.HIV-1多表位重组膜抗原及基因的克隆及表达质粒的构建。
PCR引物E1 CGGAATTCAT ATGAGGGACA ATTGGAGAE2 GGGGTACCTG ATCCTGATCC TCTTTTTTCT CTCTGCAC▲E3 CGGGATCCTT AACTTGCCCA TTTATCT使用E1与E2引物扩增env gp120 C端109 bpE12片段，扩增条件为95℃45秒，50℃45秒，72℃45秒；扩增27～35个循环后，68～75℃延伸4～10分钟。使用E1与E3引物，扩增env gp41 N端576bp E13片段，扩增条件为95℃50秒，50℃1分钟，72℃ 1分钟；扩增27～35个循环，68～75℃延伸4～10分钟。
利用E12PCR产物两段的酶切位点EcoRI与KpnI，将其克隆到PUC18载体上，得到PUC-E12。该克隆质粒用KpnI酶切，T7 DNA聚合酶削平后，再以BamHI酶切，回收载体片段。E13 PCR产物以HaeIII与BamHI双酶切，回收384bp片段。将以上两片段连接，构建pUC-MEre。MEre与E13相比，删除了编码gp41 N端519-547氨基酸的基因片段，而代之以GSGS DNA编码序列。MEre基因包括了gp120 C端482-518位氨基酸以及gp41 548-675位氨基酸的DNA编码序列，连接处使用了GSGS柔性接头。MEre编码蛋白包括了所有已知的gp120上存在的高度保守的免疫优势表位。gp41N端具有融合性质的疏水氨基酸的去除，有利于该基因在宿主菌中的表达，本实施例为大肠杆菌。
pUC-MEre基因两端分别带有EcoRI与BamHI位点。利用两位点克隆到质粒载体上，本实施例为pGEMEX-1载体，构建了PGEMEX-MEre。将该质粒以EcoRI酶切后，使用Klenow大片段补平，使得载体g10编码序列与MEre基因序列阅读框架一致，构建表达质粒pGEMEX-MEre。
构建的正确性用酶切及PCR方法证实。在该表达载体上，MEre基因的转录由g10启动子控制，表达蛋白包括了载体序列编码的284 aa以及MEre编码的169 aa，预期分子量为49.4kD。
2.MEre基因的融合表达用PGEMEX-MEre转化E.coli BL21(DE3)。挑取单克隆，接种于50ml含有氨卞青霉素的LB中30℃过夜生长。以后再转接到同样的培养基中，30℃生长至OD600＝0.8～1.0，加入IPTG诱导MEre融合蛋白的表达，诱导3～4小时后收菌。结果表明在49.4kD处有高水平的蛋白表达。重组蛋白主要以包涵体的形式存在，表达水平为重组蛋白占包涵体蛋白的50％以上。
3.重组蛋白的制备电泳纯化将培养后的重组菌重悬于40mlTE(pH8.0)中，加入溶菌酶50mg裂解菌体，10分钟后，超声破碎，提取包涵体。用TE充分洗涤后，将包涵体悬于6ml蒸馏水中，加入2ml 4X样品处理液，煮沸后，进行制备电泳纯化。
4.纯化MEre重组蛋白与HIV-1阳性与阴性血清的ELISA反应结果HIV-1标准血清(PANEL9500)由卫生部鉴定所提供，包括28份阴性血清，与11份HIV-1阳性血清。纯化抗原以0.1M的碳酸氢钠溶液稀释到浓度为1ug/ml，以每孔100ul包被96孔聚苯乙烯微量滴定板，4℃过夜。以含1％BSA的PBST(含0.05％Tween的PBS)封闭2小时。标准血清以1∶50稀释，加样反应。以PBST充分洗涤后，加入酶标二抗，温育洗涤，以OPD显色，测492nm的光吸收值。结果表明单独使用MEre抗原，对阳性血清的检出率即可达100％，特异性为100％。
权利要求
1.一种HIV-1多表位重组膜抗原基因的DNA编码序列，其特征在于该DNA序列包括gp120 C端482-518位氨基酸片段的DNA编码序列和gp41 N端548-675位氨基酸片段的DNA编码序列。
2.根据独立权利要求1所述的HIV-1多表位重组膜抗原基因的DNA编码序列，其特征在于该编码序列还包括编码连接gp120与gp41的接头的DNA序列。
3.根据权利要求2所述的HIV-1多表位重组膜抗原基因的DNA编码序列，其特征在于编码连接gp120和gp41接头的DNA序列为GSGS的DNA编码序列。
4.一种重组表达载体，其特征在于该表达载体是质粒上插入了如权利要求1所述的多表位重组抗原基因的DNA编码序列。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于该表达载体所采用的质粒为pGEMEX-1。
6.一种重组大肠杆菌，其特征在于该重组大肠杆菌含有如权利要求4所述的重组表达载体。
7.根据权利要求6所述的重组大肠杆菌，其特征在于该重组大肠杆菌所含有的表达载体为pGEMEX-1。
8.一种HIV-1多表位重组膜抗原的氨基酸序列，其特征在于该氨基酸序列由权利要求1述的HIV-1多表位重组膜抗原基因的DNA编码序列所编码。
9.一种HIV-1多表位重组膜抗原的氨基酸序列，其特征在于该氨基酸序列由权利要求2所述的HIV-1多表位重组膜抗原基因的DNA编码序列所编码。
10.一种HIV-1多表位重组膜抗原的氨基酸序列，其特征在于该氨基酸序列由权利要求3所述的HIV-1多表位重组膜抗原基因的DNA编码序列所编码。
11.一种生产HIV-1多表位膜重组抗原的方法，其特征在于该方法包括重组质粒的构建，重组菌的构建，重组菌的表达培养，重组抗原的分离纯化及分析鉴定。
全文摘要
本发明涉及HIV－1多表位重组膜抗原。该重组膜抗原包括了gp120上C－端高度保守的亲水区域482—518位氨基酸(7224nt－7333nt)及gp41膜外区域548—675位氨基酸(7423nt－7805nt),几乎覆盖了gp120与gp41上所有已知的高度保守的免疫优势表位,使其特异性与灵敏度均达到100%。
文档编号C12N15/33GK1195702SQ97103890
公开日1998年10月14日 申请日期1997年4月8日 优先权日1997年4月8日
发明者韩保光, 孟莉, 马贤凯, 宋晓国, 凌世淦, 王鸿雁 申请人:军事医学科学院基础医学研究所