专利名称：重组抗原HSV－ⅡgD包被酶标反应板的制法及ELISA检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物试剂盒，具体是一种将HSV-II gD重组蛋白用于检测HSV-II IgM的ELISA检测试剂盒。
背景技术：
单纯疱疹病毒II型(Herpes simplex virus II，HSV-II)在人群中感染十分广泛，是引起生殖器疱疹的主要病原体，也是导致TORCH综合征的主要病原体之一。新生儿通过多种途径感染，如宫内、产道等。孕妇早孕时感染可引起流产、胎儿先天性畸形；妊娠中、晚期感染者，早产、极低体重儿发生率增高；经产道感染新生儿，会引起脑炎及脑膜炎等。正常人首次感染生殖器时，病毒容易潜伏在脊神经内，形成潜伏感染，而后在一定条件下，如妊娠或免疫力低下等，病毒可被诱发激活、增殖、蔓延扩散，引起反复发作，致病。尤其是在孕妇早期感染或复发HSV-II，病毒可通过胎盘引起胎儿病毒血症、自发性流产、死胎、胎儿畸形和宫内发育迟缓等；如在分娩期经产道传染给新生儿，可引起新生儿疱疹。因此，及时准确的诊断有无HSV-II感染，不仅有助于生殖器炎症的治疗，并且对妇幼保健、围产医学和优生优育工作均有重要的指导意义。
鉴于HSV-II对人类的危害性较大，发现患者及时采取措施是保障人口素质及提高人类健康水平的关键。我国每年需要对大量的患者或孕妇进行HSV-II检测。目前市场上HSV-II的各种免疫诊断试剂盒质量参差不齐，既无统一的质量标准，又在无序生产与应用，给HSV-II的预防和诊治造成严重障碍。目前国外有研究者利用同类诊断试剂盒进行检测，但是此种试剂盒价格十分昂贵，限制了临床的广泛使用。而国产试剂盒多采用细胞培养的全病毒粗制抗原检测血清中特异性IgM，病毒产量低，所得病毒抗原纯度较低，且其抗原性可能与其它疱疹病毒有交叉，影响检测结果的准确性；这些试剂盒存在稳定性和重复性较差、灵敏度和特异性不高等缺点。
现已知，HSV-II至少包含10种包膜糖蛋白，而糖蛋白D(glycoprotein D，gD)是HSV-II的一个极为保守的高度免疫原性蛋白。作为HSV-II重要的特异性糖蛋白，gD能够在体内诱导细胞免疫和体液免疫，而且诱导产生的抗体具有中和作用。鉴于gD具有这些重要的功能及良好的抗原性，本发明利用基因工程的方法，自行设计并克隆表达了HSV-II gD特异性抗原片段，经亲和层析法对重组抗原进行纯化后，获得一种新的gD重组蛋白。经过改造过的gD重组蛋白既保留了其抗原性，又提高了gD重组蛋白的原核表达量。采用该重组蛋白，本发明成功地用间接ELISA法，方便快速地检出特异性HSV-II-IgM，并将该结果与美国BioCheck试剂盒相比较，一致性为97.0％。
发明内容
本发明的目的提供一种新的HSV-II gD-IgM型ELISA检测试剂盒及重组抗原HSV-II gD包被酶标反应板的制法，为临床诊断HSV-II提供快速、准确、简便的检测工具。
本发明技术方案如下特异性重组抗原HSV-II gD包被酶标反应板的制备方法，通过下列步骤制备而成(1)HSV-II gD重组蛋白的载体构建①HSV-II gD的原核表达以HSV-II Sav标准病毒株DNA作为模板，通过特异性引物PCR扩增gD特异性基因片段，长约447bp。将目的基因连接于pGEM-4T原核表达载体上，转化E.coli DH5α感受态细菌中。根据卡那霉素抗性挑取克隆，并提取质粒，通过PCR、双酶切、测序进行鉴定，得到与目的基因一致的基因片段。证明gD特异性基因片断已正确连入pGEM-4T中。
②gD重组蛋白的表达与鉴定将上述含有重组质粒pGEM-4T/gD的阳性克隆菌经IPTG诱导后，表达的蛋白通过SDS-PAGE蛋白电泳及考马斯亮蓝染色显示，与空菌相比，在30KD左右有一条浓染的新增蛋白质条带。经Westernblotting鉴定，能与gD单克隆抗体特异性结合，说明其具有较强的免疫原性。
③HSV-II gD重组蛋白的大量表达、纯化对pGEM-4T/gD工程菌进行发酵，超声破菌，亲和层析纯化后得到大量的gD重组蛋白。
(2)HSV-II gD重组蛋白作为抗原，用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释成适宜浓度后按100μl/孔包被96孔酶标板，置湿盒中，4℃12～24h，PBST洗板3次，每次3min，然后拍干；得到酶标反应板。
(3)用含10％小牛血清的PBS加满孔(约200μl/孔)，37℃孵育，封闭1h，洗板3次，拍干并密封，即可得到HSV-II gD抗原包被酶标反应板。
这种新的HSV-II gD IgM型ELISA检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒由上述特异性重组抗原HSV-II gD包被酶标反应板、标本稀释液、洗涤液、酶标二抗、底物液、终止液构成。具体分为(1)、标本稀释液含10％小牛血清和2％抗人IgG的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；(2)、洗涤液含有0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲液(PBST)；(3)、酶标二抗辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgM单抗；(4)、底物液TMB-H2O2尿素溶液；(5)、终止液2mol/L H2SO4溶液。
本发明试剂盒的检测结果与国产的全病毒--ELISA法及美国BioCheck试剂盒的检测特异性分别是本法为98.9％；全病毒--ELISA法82.4％。敏感性分别是本法为80％；全病毒-ELISA法60％。且本法与美国BioCheck法有较高一致性，为97.0％。
本发明试剂盒选取HSV-II抗原性较强的gD蛋白的部分序列，通过分析，选择其中的抗原表位和亲水性区域，采用基因重组技术，原核表达，亲和层析后获得一种新的gD重组蛋白，该抗原不仅具有高特异性，且具有高纯度和高稳定性，在提取纯化后，包板作为试剂盒中的重要组分。与全病毒抗原相比，该重组抗原可规模化、标准化生产，更安全、经济。
具体实施例方式
1、试剂(1)包被液(0.05mol/l，pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液)Na2CO31.5g，NaHCO32.9g，Na2N30.2g，加双蒸水至1000ml，调至pH9.6。
(2)标本稀释液(含10％小牛血清和2％抗人IgG的0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)pH7.4)，PBSNaCl 8.0g、KH2PO40.2g、Na2HPO412H2O 2.9g、KCl 0.2g，硫柳汞0.1g，加双蒸水至1000ml，调至pH7.4，即得。
(3)封闭液(10％小牛血清的PBS溶液)小牛血清100ml/PBS(pH7.4)900ml。
(4)洗涤液(PBST，pH7.4)NaCl 8.0g、KH2PO40.2g、Na2HPO412H2O 2.9g、KCl0.2g、Tween 200.5ml、硫柳汞0.1g、加双蒸水至1000ml，调至pH7.4。
(5)酶标二抗(HRP*鼠抗人IgM单抗)辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgM单抗。
(6)底物液(TMB-H2O2尿素溶液)①底物液A(3、3‘、5、5‘-四甲基联苯胺，TMB)TMB200mg，无水乙醇100ml，加双蒸水至1000ml。
②底物液B缓冲液(0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液，pH5.0～5.4)Na2HPO414.60g，柠檬酸9.33g，0.75％过氧化氢尿素6.4ml，加双蒸水至1000ml，调至pH5.0～5.4。
③将底物液A和B按1∶1混合，即成TMB-H2O2尿素溶液。
(7)终止液(2mol/L H2SO4溶液)双蒸水600ml，浓硫酸100ml(缓慢滴加并不断搅拌)，加双蒸水至900ml。
2、主要仪器(1)酶标仪BIO-RAD Model 550(2)ELISA反应板Corning Incorporated costar R 96 Well EIA/RIA plate3、方法酶标二抗最适滴度的选择(1)用100ng/ml人IgM进行包被，洗涤。
(2)将酶标抗人IgM单抗用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，保温、洗涤。
(3)加底物液显色。加终止液终止反应后，读取吸光度(A)，取A值在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标二抗的最适滴度为1∶1000。
棋盘滴定法选择包被抗原最适滴度(1)用包被液将HSV-II gD抗原作一系列稀释后进行包被，洗涤。
(2)将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液按10倍递增系列稀释，加样，保温，洗涤。
(3)加按最适滴度稀释的酶标抗人IgM单抗，保温，洗涤。
(4)加底物液显色，加终止液终止反应后读取A值。
(5)选择强阳性参考血清的A值为0.8～1.0间、阴性参考血清的A值小于0.1的包被抗原的稀释度作为最适滴度为20～40μg/孔。
特异性重组抗原HSV-II gD包被反应板的制备方法(1)HSV-II gD重组蛋白作为抗原，用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释成适宜浓度后按100μl/孔包被96孔酶标板，置湿盒中，4℃ 12～24h，用洗涤液洗板3次，每次3min，然后拍干；得到酶标反应板。
(3)用含10％小牛血清的PBS加满孔，37℃孵育，封闭1h，用洗涤液洗板3次后密封。该板即可得到抗原gD包被酶标反应板。
洗涤液为含有0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲液(PBST)；HSV-II gD IgM型ELISA检测试剂盒，由上述特异性重组抗原HSV-II gD包被酶标反应板、标本稀释液、洗涤液、酶标二抗、底物液、终止液构成。
具体分为(1)、标本稀释液含10％小牛血清和2％抗人IgG的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；(2)、洗涤液含有0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲液(PBST)；(3)、酶标二抗辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgM单抗；(4)、底物液TMB-H2O2尿素溶液；(5)、终止液2mol/L H2SO4溶液。
利用上述试剂盒采用ELISA法检测血清中HSV-II gD IgM(1)待检血清，加入1∶100稀释的待检血清到包被好的酶标反应板，100μl/孔，37℃孵育1h，洗板3次；(2)加酶标物，加入HRP(辣根过氧化酶)标记的鼠抗人IgM单抗，100μl/孔，37℃孵育40min，(3)显色，用洗涤液洗板后每孔加入底物液TMB-H2O2尿素液100μl，37℃或室温避光显色15分钟；(4)每孔加入2mol/L H2SO450μl，终止反应；(5)结果判断，空白孔调零，读取450nm波长处吸光度，即OD450值。
(6)计算结果，将待检标本血清平均OD值(P)除以阴性血清平均OD值(N)，求得P/N值，P/N≥2.1为阳性，P/N＜2.1为阴性。
权利要求
1.重组抗原HSV-IIgD包被酶标反应板的制法，其特征在于通过下列步骤制备而成(1)、以HSV-IISav标准病毒株DNA作为模板，扩增长约446bp的特异性目的基因，与克隆表达载体pGEM-4T连接，转化入E.coli DH5α，表达大量纯化gD蛋白；(2)、将HSV-II gD蛋白抗原用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释后包被96孔酶标板，10μl/孔，置湿盒中，4℃12～24小时，洗涤液洗板3次，每次3min，然后拍干；(3)、用含10％小牛血清的PBS加满孔，37℃孵育，封闭1h，洗板3次后密封；该板即为重组抗原HSV-II gD包被酶标反应板，用于HSV-II gD-IgM的特异性检测。
2.据权利要求1所述的制法，其特征在于所述的pH9.6的碳酸盐缓冲液为Na2CO31.5g，NaHCO32.9g，Na2N30.2g，加双蒸水至1000ml，调至pH9.6，得到。
3.据权利要求1所述的制法，其特征在于PBS为NaCl 8.0g、KH2PO40.2g、Na2HPO412H2O 2.9g、KCl 0.2g，硫柳汞0.1g，加双蒸水至1000ml，调至pH7.4，得到。
4.应用重组抗原HSV-IIgD包被酶标反应板的ELISA检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒由重组抗原HSV-IIgD包被酶标反应板、标本稀释液、洗涤液、底物液、终止液构成，具体组份为(1)、标本稀释液含10％小牛血清和2％抗人IgG的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；(2)、洗涤液含有0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲液(PBST)；(3)、酶标二抗辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgM单抗；(4)、底物液TMB-H2O2尿素溶液；(5)、终止液2mol/L H2SO4溶液。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述的PBS为NaCl 8.0g、KH2PO40.2g、Na2HPO412H2O 2.9g、KCl 0.2g，硫柳汞0.1g，加双蒸水至1000ml，调至pH7.4，得到；PBST为NaCl 8.0g、KH2PO40.2g、Na2HPO412H2O 2.9g、KCl 0.2g、Tween 200.5ml、硫柳汞0.1g、加双蒸水至1000ml，调至pH7.4，得到；底物液为(TMB-H2O2尿素溶液)①底物液A(3、3‘、5、5‘-四甲基联苯胺，TMB)TMB200mg，无水乙醇100ml，加双蒸水至1000ml，得到；②底物液B缓冲液(0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液，pH5.0～5.4)Na2HPO414.60g，柠檬酸9.33g，0.75％过氧化氢尿素6.4ml，加双蒸水至1000ml，调至pH5.0～5.4，得到；③将底物液A和B按体积比1∶1混合，即成TMB-H2O2尿素溶液。
全文摘要
本发明涉及重组抗原HSV－IIgD包被酶标反应板的制法及ELISA检测试剂盒，其关键技术之处主要在于用基因工程方法制备特异性重组抗原——HSV－IIgD。该抗原在提取纯化后，再制成gD包被酶标反应板；试剂盒由重组抗原HSV－IIgD包被酶标反应板、标本稀释液、洗涤液、底物液、终止液构成。建立敏感快速的ELISA抗体捕获血清中HSV－II特异性IgM抗体的方法，具有高特异性，高稳定性。试剂盒主要供实验室研究和临床诊断使用。
文档编号G01N33/543GK1804630SQ20051012292
公开日2006年7月19日 申请日期2005年12月5日 优先权日2005年12月5日
发明者王明丽 申请人:王明丽