一种重组肝癌复合表位抗原,其制备方法及在制备肝癌特异免疫治疗药物中的应用的制作方法

专利名称：一种重组肝癌复合表位抗原,其制备方法及在制备肝癌特异免疫治疗药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域中一种重组抗原，具体地说涉及一种重组肝癌复合表位抗原，还涉及该抗原的制备方法及其在制备肝癌特异性免疫治疗药物中的应用。
背景技术：
原发性肝癌(HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，我国是世界上肝癌发病率最高的国家之一，我国肝癌患者约占全世界的50％，患者的5年存活率＜12％，死亡率高达每年20/105。因此，在我国加强肝癌的防治研究有着重要意义。
目前，肝癌的主要治疗方法为传统的手术切除、局部或全身化疗等，尽管患者的长期生存率有所提高，但术后5年复发率仍在43％-61％。为预防术后复发、治疗不能手术切除及不能耐受化疗的病人，人们一直在努力寻找着一种更有效的治疗方法。随着分子免疫学、肿瘤免疫治疗学的迅猛发展，使免疫治疗可能成为治疗肝癌的有效手段。目前开展的细胞因子免疫疗法、过继性免疫治疗虽在肝癌的治疗中取得了一些可喜的疗效，但激发的免疫反应并非肿瘤特异性。而主动特异性免疫治疗即肿瘤疫苗因其特异性高、针对性强成为免疫治疗的方向与主流，显示了良好的应用前景。
目前寻找、鉴定肿瘤特异性/相关性抗原是肿瘤疫苗研究的核心问题。对肝癌细胞表达的肿瘤抗原的研究尚处于不成熟阶段，大多集中于抗原mRNA及其蛋白的表达。肝癌组织中高表达AFP(80％)、MAGE-1(80％)、MAGE-3(68％)等抗原，其中除AFP外均为肿瘤睾丸(CT)抗原，它们在多种肿瘤组织中高表达，在除睾丸外的正常组织中不表达，此现象提示，可利用这些肿瘤抗原设计开发疫苗进行肝癌的免疫治疗。近年来人们对自身抗原(如AFP)的研究中发现针对自身蛋白的T细胞克隆在胚胎时并没有完全被免疫系统清除，这些自身蛋白质的CTL表位和MHC结合可为TCR识别进而激活T细胞，如果通过恰当的方式免疫机体，可产生有效的抗肿瘤效应。Vollmer和Butterfield开辟了AFP分子作为靶标的细胞免疫治疗的新途径，证实了AFP这种癌胚抗原作为肿瘤排斥性抗原的可行性(Vollmer CM，Eilber FC，Butterfield LH，et al.Alpha-fetoprotein-specific genetic immunotherapy forhepatocellular carcinoma.Cancer Res，1999，59(13)3064-3067.Grimm CF，Ortmann D，Mohr L，et al.Mouse alpha-fetoprotein-specific DNA-basedimmunotherapy of hepatocellular carcinoma leads to tumor regression in mice.Gastroenterology，2000，119(4)1104-1112.)。以AFP为靶标的治疗既可减低AFP的水平，又有利于延缓和抑制肝癌细胞的增殖提高机体的免疫功能。另外研究证实MAGE家族的多个成员在肝癌中高表达，在癌旁组织、肝硬化和慢性肝炎的肝组织中均未检测出MAGE基因的表达。同时从中也已鉴定出多个与不同HLA类型结合的CTL表位肽序列(Traversari C，van der Bruggen P，Luescher IF，et al.A nonapeptide encoded by human gene MAGE-1 is recognizedon HLA-A1 by cytolytic Tlymphocytes directed against tumor antigen MZ2-E.JExp Med，1992，1761453-1457.Celis E，Fikes J，Wentworth P，et al.Identificationof potential CTL epitopes of tumor-associated antigen MAGE-1 for five commonHLA-A alleles.Molecular Immunology，1994，311423-1430.Chaux P，Lethe B，Van Snick J，et al.A MAGE-1 peptide recognized on HLA-DR15 by CD4(+)Tcells.Eur J Immunol，2001，31(6)1910-1916.Fujie T，Tahara K，Tanaka F，er al.A MAGE-1-encoded HLA-A24-binding synthetic peptide induces specificanti-tumor cytotoxic T lymphocytes.Int J Cancer，1999，80(2)169-172.)，提示MAGE抗原用于肝癌的免疫治疗、肿瘤疫苗的研究均具有良好的应用前景。目前，MAGE抗原肽疫苗的研究已在黑素瘤等肿瘤患者中展开临床试验并已取得一定的疗效(Weber JS，Hua FL，Spears L.A phase I trial of an HLA-A1restricted MAGE-3 epitope peptide with incomplete Freund′s adjuvant in patientswith resected high-risk melanoma.J Immunother，1999，22(5)431-440.)。尽管如此，抗原肽疫苗应用中也表现出稳定性差，抗原表位单一的缺点。对某一蛋白质抗原而言，它不仅含有CTL表位、B细胞表位、Th细胞表位，而且还可含有抑制性、与自身抗原交叉反应性表位等不利于保护性免疫的区段。因此，在疫苗设计时应摒弃后者，再者细胞免疫中真正起作用的是T细胞表位。表位策略可最大限度减少无关成分甚至抑制成分的干扰，产生的免疫效果更加特异有效。应用单纯的肽疫苗有其限制性，如只能与特定HLA类型配合应用。如采用多种肿瘤表位联合接种，即多表位复合免疫原策略，可克服肿瘤的免疫逃逸及满足人群MHC限制性的覆盖面。

发明内容
为了克服现有肽疫苗的缺陷，本发明公开了一种重组肝癌复合表位抗原，该抗原具有如序列表中序列1所示的氨基酸序列或序列1所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有与序列1的氨基酸序列相同活性的氨基酸序列。
本发明还公开了一种具有转导活性的重组肝癌复合表位抗原，该抗原具有序列表中序列2所示的氨基酸序列或序列2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有与序列2的氨基酸序列相同活性的氨基酸序列。序列2所示氨基酸序列是在序列1所示氨基酸序列基础上，在其N端增加15个氨基酸残基而成。
本发明还公开了编码上述具有转导活性的重组肝癌复合表位抗原的核苷酸序列，如序列表中序列30所示。
本发明还公开了该重组肝癌复合表位抗原的制备方法。
根据文献我们从肝癌中高表达的多种肿瘤抗原中挑选出AFP、MAGE-1抗原作为模式肿瘤抗原，从中选择6个CTL表位作为候选表位，所选择表位见下表。
表1所选用表位一览表

根据Livingston BD等(Livingston BD，Newman M，Crimi C.Optimizationof epitope processing enhances immunogenicity of multiepitope DNAvaccines.Vaccine，2001，19(32)4652-4660.)的报道，紧邻表位3’端的氨基酸与表位在细胞内的加工递呈密切相关，且以碱性氨基酸(K，R)，含有酰胺基氨基酸(N，Q)，小分子氨基酸(C，G，A)等为好。因此构建多表位疫苗时应尽量避免在表位C+1位出现不利的氨基酸残基，以满足所有表位肽的有效加工递呈。原则上以-NG-加以连接，个别下一个表位第一位是N或小分子时，可以减少一个氨基酸。为了充分激活CD4+细胞介导的免疫作用，我们还在抗原中加入PADRE通用表位。将表位进行合理串联后，克隆入表达载体pBVIL1，用于构建以T细胞表位为主的重组肝癌复合表位抗原。
本发明设计了T(多CTL表位)和Tat(TatPTD与PADRE)2个片段进行复合多表位基因的合成，抗原基因的合成采用核心模板法(Donato AD，Nigris M，Russo N，et al.A method for synthesizing genes and cDNAs by the polymerasechain reaction.Analytical Biochemistry，1993，212(1)291-293.)，根据抗原表位的氨基酸序列和大肠杆菌中高表达的偏性密码子，推断出核苷酸序列加以合成。分别设计数对不超过58个碱基的3’端有一段互补重叠的引物，通过几次PCR反应可按设计合成抗原的基因。
将T、Tat基因克隆于原核表达载体pET22b分别构建PET/T、PET/Tat，再将测序正确的pET/Tat载体和PCR产物(P78)用EcoR I和BamH I双酶切，连接转化大肠杆菌JM109构建pET/Tat+T。将T与Tat+T基因分别亚克隆至原核表达载体pBVIL1(参见中国专利申请表达载体pBVIL1及其构建方法和用途，专利号ZL00100695.9)中，重新构建原核表达载体pBVIL1/T、pBVIL1/Tat+T。构建的表达质粒经DNA序列测定，证明表达载体构建成功。
将获得的重组表达质粒pBVIL1/T、pBVIL1/Tat+T分别转化E.coli HB101，然后通过热诱导培养，取全菌液进行SDS-PAGE鉴定，证明两个表达质粒均已获得了高效的表达，再经离子交换柱及凝胶过滤纯化，可获得两个重组肝癌复合表位抗原的纯品，它们的氨基酸序列分别如序列表中序列1和序列2所示。
本发明还公开了上述重组肝癌复合表位抗原在制备肿瘤特异性免疫治疗药物中的应用。
本发明通过实验，将Tat+T融合蛋白加入BHK、SP2/0细胞，进行蛋白抗原的体外转导活性检测，结果表明Tat确具有蛋白转导作用，Tat+T融合蛋白可跨膜进入细胞浆，而不含TatPTD的T蛋白则不能进入细胞浆。
大量研究结果表明，细胞免疫在肿瘤免疫中起了重要作用，而真正特异性杀伤肿瘤的是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，因此以增强机体CTL应答为目标的疫苗研究已成为肿瘤疫苗研究的热点。蛋白质类抗原通常较难产生CTL活性，因为蛋白质类外源性抗原，通常只能进入MHC-II类分子加工途径。为了增强蛋白质疫苗的CTL活性本发明采用了制备基因工程TatPTD融合分子的方法。HIV-1的反式激活蛋白Tat能跨越细胞膜进入细胞浆，制备基因工程TatPTD融合分子可介导外源蛋白质分子进入细胞，按MHC-I类分子的抗原加工递呈，因此，本发明的重组肝癌复合表位抗原用于肝癌特异性免疫治疗，可有望突破蛋白质免疫原不易引起CTL活性的瓶颈，发挥蛋白疫苗安全稳定的优势。
本发明所制备的重组肝癌复合表位抗原加上药学上可接受的辅料，可以制备肿瘤特异性免疫治疗药物。本发明设计研究的基因工程重组多表位免疫原则具有安全、稳定、减少免疫逃避和增加MHC覆盖面的优点。同时，在多个CTL表位的基础上，融合了通用DR等位基因表位(Pan-allelic DRepitope，PADRE)能和人类及多种动物不同DR分子结合，递呈于细胞表面，进而激活CD4+T辅助细胞，发挥免疫调节作用(Eileen DF，Stephen L H，JohnS et al.Pan DR binding sequence provides T-cell help for induction of protectiveantibodies against Plasmodium yoelii sporozoites.Vaccine，1999，17(9)，1201-1205.)。
本发明所制备的重组肝癌复合表位抗原在肝癌特异性免疫治疗中具有非常广阔的应用前景。


图1为分步PCR示意图。
图2为Tat基因分步PCR产物电泳鉴定图谱。其中泳道1为Tat12PCR产物；泳道2为Tat34PCR产物；M为DNA相对分子质量标准DL-2000图3为T基因分步PCR产物电泳鉴定图。其中泳道1为T12PCR产物；泳道2为T34PCR产物；泳道3为T56PCR产物；泳道4为T78PCR产物；M为DNA相对分子质量标准DL-2000图4为原核表达载体pBVIL1/T的酶切鉴定图谱。其中泳道1为pBVIL1/Xho I；泳道2为pBVIL1-T/Xho I；泳道3为pBVIL1-T/Xba I；泳道4为pBVIL1-T/Xba I+Xho I；泳道5为T基因PCR产物；泳道M1为DNA相对分子质量标准DL15000；泳道M2为DNA相对分子质量标准DL2000图5为原核表达载体pBVIL1/Tat+T的酶切鉴定图谱。其中泳道1为pBVIL1/Xho I；泳道2为pBVIL1-TatT/Xho I；泳道3为pBVIL1-TatT/XbaI；泳道4为pBVIL1-TatT/Xba I+Xho I；泳道5为Tat+T基因PCR产物；M1为DNA相对分子质量标准DL15000；M2为DNA相对分子质量标准DL2000图6为pBVIL1/T的序列分析结果图谱。
图7为pBVIL1/Tat+T的序列分析结果图谱。
图8为Tat+T蛋白纯化的SDS-PAGE电泳图谱。其中M为蛋白分子量标准；泳道1为pBVIL1/Tat+T全菌体；泳道2为pBVIL1/Tat+T超声破碎上清；泳道3为pBVIL1/Tat+T超声破碎沉淀；泳道4为纯化的Tat+T蛋白。
图9为Tat+T融合蛋白的跨膜活性的免疫荧光检测图谱。其中a为Tat+T蛋白转导的SP2/0细胞；b为Tat+T蛋白转导的BHK细胞；c为T蛋白转导的SP2/0细胞。
图10为Tat+T融合蛋白跨膜活性的Western印迹检测图谱。其中泳道1为T蛋白转导的SP2/0细胞；泳道2为SP2/0细胞；泳道3为Tat+T蛋白转导的SP2/0细胞；泳道4为pBVIL1/Tat+T全菌体对照。
具体实施例方式
实施例一肝癌复合表位抗原的分子设计与基因合成一.材料原核表达载体pET22b为Novagen公司产品；原核表达载体pBVIL1已经申请中国专利并获得授权，专利号ZL00100695.9，专利名称“表达载体pBVIL1及其构建方法和用途”，并已经进行保藏，保藏号CGMCC No0437；宿主菌大肠杆菌JM109、HB101均为市购，本室保存；高保真PyrobestTMDNA聚合酶，DNA限制性内切酶Xho I、Xba I、Nde I和HindIII，DNA相对分子质量标准DL2000、DL 15000购自大连宝生物公司；克隆载体pGEM-T Easy，DNA限制性内切酶EcoR I和BamHI、T4DNA连接酶为Promega公司产品；普通Taq DNA聚合酶为BBI公司产品；PCR产物纯化试剂盒和质粒提取试剂盒购自博大生物公司；GeneAmp PCR System2400PCR扩增仪为PE公司产品。
二.方法结果1.多表位的确定与组装选取肝癌高表达的AFP和MAGE-1作为模式肿瘤抗原，选中6个CTL表位(如表1所示)，考虑到表位间的连接对表位加工和递呈的重要性，参照Livingston的报道，以-NG-为连接臂对各表位加以连接。
选取HIVTat蛋白的47-57位氨基酸作为融合肽TatPTD序列。
多CTL表位(简称T)的氨基酸序列NYKHCFPEINGKVLEYVIKVNGYLEYRQVPVNGVALQTMKQNGFMNKFIYEINGLSPNLNRFLNGEYVIKVSARVRF(如序列表中序列11所示)TatPTD与通用PADRE表位(简称Tat)的氨基酸序列RHMGYGRKKRRQRRRGEFRGGSAKFVAAWTLKAAAKLR(如序列表中序列12所示)2.引物设计与合成将以上多表位和TatPTD的氨基酸序列根据大肠杆菌优势表达密码子反推出DNA序列，采用核心模板法的方式分步合成基因。设计如下PCR引物Tat1-Tat4为合成Tat的引物

其中Tat3引入NdeI酶切位点，Tat4引入HindIII酶切位点。
P1-P10为合成多表位T的引物

其中P7引入EcoR I酶切位点，P8引入BamH I酶切位点，P9引入Nde I酶切位点，P10引入HindIII酶切位点。引物由三博公司合成、纯化。
3.PCR法合成基因将合成的引物按照核心模板法进行分步PCR(图1)，具体合成方法是
第1次PCR(反应体系为50μl)去离子水32μl，10×PCR Buffer5μl，第1对引物Tat1、Tat2(P1、P2)各1μl，2.5mmol/L dNTPs 4μl，Mgcl25μl，2.5U/μl Taq DNA聚合酶1μl。PCR反应条件95℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共5个循环；72℃延伸7min；第2次以上PCR(反应体系为50μl)去离子水32μl，10×PCRBuffer 5μl，相应引物(Tat3与Tat4，P3与P4，P5，P6，依次类推)各1μl，2.5mmol/LdNTPs 4μl，Mgcl25μl，PCR产物(1/50稀释)1μl为模板，Taq DNA聚合酶1μl。PCR反应条件95℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30个循环；最后72℃延伸7min。1.2％琼脂糖DNA凝胶电泳分析PCR产物。
Tat基因的由2步PCR获得，Tat12，Tat34PCR产物的大小分别为88bp和114bp(图2)；T基因采用4步PCR合成，各步PCR反应的产物大小分别为T12 88bp，T34 155bp，T56 225bp，T78(T910)249bp(图3)。
PCR产物的纯化使用PCR产物回收试剂盒(博大公司)按说明书方法纯化。
4.表达质粒的构建小量提取原核表达载体pET22b的质粒DNA与PCR产物用Nde I和HindIII进行双酶切。将表达载体与目的片段按1∶3比例于16℃过夜连接，转化大肠杆菌JM109，氨苄青霉素抗性筛选克隆，构建pET/T和pET/Tat表达载体。将测序正确的pET/Tat重组载体和PCR(P7，P8)产物用EcoR I和BamH I限制性内切酶双酶切，将回收的载体与PCR产物按1∶3比例于16℃过夜连接，转化大肠杆菌JM109，氨苄青霉素抗性筛选克隆，构建pET/Tat+T表达质粒。
根据pET/Tat+T序列设计合成引物，将多表位和含Tat融合肽的基因重组于原核表达载体pBVIL I中，引物设计如下I1如序列表中序列27所示；I2如序列表中序列28所示；I3如序列表中序列29所示其中I1、I3引入Xho I酶切位点，I2引入Xba I酶切位点，6个His及终止密码子。
引物由三博公司合成、纯化。引物I1、I2扩增Tat+T基因片段，引物I3、I2扩增T基因。反应体系(50μl)中加入10×Pyrobest Buffer 5μl，dNTP(2.5mM)4μl，引物F(10μM)1μl，引物R(10μM)1μl，pET/Tat+T模板1μl，Pyrobest DNA聚合酶(5u/μl)0.5μl，去离子水至50μl。扩增参数如下95℃预变性3min；94℃30s，55℃30s、72℃30s，扩增30个循环；最后72℃延伸7min。1.2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
将PCR(I1、I2和I3、I2)产物和原核表达载体pBVIL I用Xho I和XbaI限制性内切酶双酶切，将回收的载体与PCR产物于室温连接3h，转化大肠杆菌HB101，氨苄青霉素抗性筛选克隆，进行pBVIL1/T、pBVIL1/Tat+T的酶切(图4，图5)及DNA序列鉴定(图6，图7)。Tat+T抗原的氨基酸序列及其基因序列如序列表中序列2和序列30所示。
实施例二肝癌复合表位抗原的表达与纯化一.材料SDS-PAGE低分子量标准蛋白为上海生化所产品；层析介质SephadexG-50、Q-Sepharose Fast Flow、S-Sepharose Fast Flow为Pharmacia公司产品；Kodak自动凝胶成像系统；BIO-RAD蛋白电泳仪。余同上。
二.方法结果1.抗原的表达与纯化1.1表达菌株的培养挑取单个克隆于37℃振荡培养过夜，次日按1％接种量接种于LB(Amp+)培养基中，37℃活化至A值达0.4-0.6时，42℃水浴摇床继续培养5h，收集菌体。取1ml诱导后的菌体沉淀，重悬于1×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5min，1000r/min离心3min，取10μl裂解液进行15％SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色，再用脱色液脱色后观察重组蛋白的表达，选取表达量最高的作为蛋白纯化的工程菌。
取-70℃保存的工程菌株20μl接种于LB培养基中(100ml LB/500ml三角瓶)，30℃空气摇床培养过夜，次日按5％的比例转种于LB培养基(同上)，30℃空气摇床培养约3小时，当A600值达到0.5时，立即将培养瓶转到42℃水浴摇床中，诱导培养4小时。收集菌体，6000r/min离心20分钟，弃上清，收集沉淀部分。
1.2提取包涵体将沉淀称湿重，用10倍体积的20mmol/L pH8.0TE缓冲液将沉淀悬起，加入溶菌酶(1mg/ml悬液)，室温下磁力搅拌10分钟。于冰浴中超声破碎菌，每次超30秒钟，间隔30秒钟，共超10次。8℃12000r/min离心20分钟，弃上清，沉淀用1mol/LNaCl(用TE配制)洗一次，再用TE洗2次，收集沉淀。沉淀用8M脲(用pH8.0TE配制)溶解，加1％β-巯基乙醇。再于20℃12000r/min离心10分钟，去沉淀取上清。
1.3纯化将上述溶解的包涵体溶液过Q-Sepharose FF阴离子交换柱，用平衡液(pH8.0，20mmol/L TE含6mol/L脲，0.1％β-巯基乙醇)洗，收集未结合部分，再过S-Sepharose FF阳离子交换柱，用平衡液清洗后，用不同浓度的NaCl(用平衡液配制)洗脱，收集各洗脱峰，经SDS-PAGE鉴定，收集0.1mol/L NaCl洗脱峰。再过Sephardex G-50凝胶过滤柱，收集第一洗脱峰，得到Tat+T的纯化蛋白(图8)。
实施例三肝癌复合表位抗原的体外转导活性检测一.材料Tat+T、T纯化蛋白实施例二中制备；金黄地鼠肾BHK细胞、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0市购，本室保存；RPMI 1640培养基和DMEM培养基为GibcoBRL公司产品；精制胎牛血清购自黑龙江同江市江海生物高新技术开发责任有限公司；BIO-RAD蛋白电泳仪；HRP标记的羊抗鼠IgG、FITC标记的羊抗鼠IgG购自中山公司；抗His单克隆抗体为Invitrogen公司产品；Western印迹用PVDF膜为Pharmacia公司产品；ECL系统购自Pierce公司。余同上。
二.方法结果将Tat+T融合蛋白加入含BHK、SP2/0细胞的6孔板，37℃孵育2h，收集并洗涤细胞，分别制样进行间接免疫荧光法和Western印迹检测，同时设立不含Tat的T融合蛋白作为对照。结果表明Tat+T融合蛋白均能进入BHK、SP2/0细胞，主要分布于细胞质，且SP2/0细胞的荧光强度与转导效率略高于BHK细胞，而不含Tat的T融合蛋白在BHK、SP2/0细胞中均未发现荧光(图9)。
将收获的细胞裂解后进行常规SDS-PAGE电泳，Western印迹检测Tat融合蛋白的转导活性，同时设立不含TatPTD的T融合蛋白作为阴性对照，设立原核表达载体pBVIL1/Tat+T诱导表达的全菌体作为阳性对照。结果Tat+T融合蛋白组出现与阳性对照分子量大小一致的反应条带，不含Tat的T融合蛋白组未出现此条带(图10)。上述结果表明，Tat融合蛋白具有蛋白转导作用，可使Tat+T融合蛋白进入细胞浆，而不含TatPTD的T融合蛋白则不具有蛋白转导作用。
序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所<120>一种重组肝癌复合表位抗原，其制备方法及在制备肝癌特异免疫治疗药物中的应用<130>
<160>30<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>92<212>PRT<213>
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1.一种重组肝癌复合表位抗原，其特征在于具有序列表中序列1所示的氨基酸序列或序列1所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有与序列1的氨基酸序列相同活性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的重组肝癌复合表位抗原，其特征在于具有序列表中序列1所示的氨基酸序列。
3.一种具有转导活性的重组肝癌复合表位抗原，其特征在于具有序列表中序列2所示的氨基酸序列或序列2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有与序列2的氨基酸序列相同活性的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的具有转导活性的重组肝癌复合表位抗原，其特征在于具有序列表中序列2所示的氨基酸序列。
5.编码权利要求4所述具有转导活性的重组肝癌复合表位抗原的基因，其特征在于具有序列表中序列30所示的核苷酸序列。
6.权利要求1或3所述重组肝癌复合表位抗原的制备方法，包括如下步骤(1)引物设计与合成；(2)PCR合成基因；(3)表达质粒构建并转化大肠杆菌；(4)重组肝癌复合表位抗原的表达与纯化。
7.根据权利要求6所述的方法，其中PCR合成基因采用的是核心模板法，通过分步PCR合成。
8.权利要求1或3所述重组肝癌复合表位抗原在制备肿瘤特异性免疫治疗药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种重组肝癌复合表位抗原，还公开了其制备方法及在制备肝癌特异免疫治疗药物中的应用。本发明的重组肝癌复合表位抗原具有转导活性，含有多个肿瘤抗原T细胞表位，应用基因合成和分子克隆技术获得，具有安全稳定，减少免疫逃避等优点，在肝癌特异性免疫治疗中具有广阔的应用前景。
文档编号A61P37/02GK1958606SQ20051011683
公开日2007年5月9日 申请日期2005年10月31日 优先权日2005年10月31日
发明者何竞, 凌世淦, 张贺秋, 宋晓国, 王国华 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所