重组润滑素的制备

重组润滑素的制备
【专利摘要】公开了类人润滑素或PRG4糖蛋白的具有出色润滑性质和新糖基化模式的新型重组同种型，以及使其能够商业化生产的高水平制备方法。
【专利说明】重组润滑素的制备
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年10月22日提交的美国临时专利申请号61/894,366的优先权和 利益，其以整体援引加入本文。 发明领域
[0003] 本文所公开的发明涉及使用经转染的细胞生产商业量的物质组合物的方法，所述 物质组合物包含重组类人润滑素（lubricin)。更具体地，本发明涉及在商业规模生产新形 式的润滑素，其具有优越的润滑性质并且其可以配制并用于预防性地或治疗性地治疗各种 疾病，例如从关节疼痛到干眼病。
[0004] 发明背景
[0005] 蛋白聚糖4 (PRG4)基因编码高度糖基化的表面润滑蛋白叫做润滑素、巨核细胞刺 激因子(MSF)、或浅表层蛋白（SZP)。（参见 Jay，Curr · Op in · Orthop · 15，355 (2004);美国专利 号6，743，774;美国专利号6，960，562)。润滑素是从PRG4基因 （SEQ ID NO: 2)表达的，全长跨 12个外显子，但是也有报道过多种天然发生的截短的版本。940个氨基酸的大的"类粘液素" 中央结构域（由外显子6编码)包含一些70+类KEPAPTT序列并且是重度糖基化的。所述糖蛋 白包含2型核心糖基化残基和多样性的1型核心聚糖(0-连接i3(l-3)Gal-GalNAc寡糖），其中 至少后者已经显示出介导其主要的生理学功能，界面润滑（Jay等，Glycoconj J 18,807 (2001))41^4已被显示出存在于软骨、滑膜、腱、和半月板的表面，在泪液膜中以及在其它 的解剖部位。PRG4已被显示出有助于对接的关节软骨表面的界面润滑。PRG4已被显示出不 仅仅作为单体存在还可作为二聚体和多聚体(1111111:;[1]161')(通过1'1-末端和0末端处保守的富 半月光氨酸结构域的二硫键）（Schmidt等，Biochim Biophys Acta· 1790(5): 375-84(2009); Kooyman等，Paper No.255,56th Ann.Meet of 0rthop.Res.Soc.，2010)〇
[0006] 在滑膜关节的软骨交界面，有至少两种润滑的物理化学模式在起作用。这些被分 类为"流体薄膜"和"界面(boundary)"。运作的润滑模式取决于关节连接组织上的正向力和 切向力，取决于这些表面之间切向运动的相对速率，以及取决于载荷和运动随着时间的变 化。摩擦系数μ(无量纲单位，相对运动中的两个表面之间所测量的摩擦力与所应用的正向 力的比率），提供了润滑的定量量度。
[0007] -种类型的流体介导的润滑或者"流体薄膜"模式是流体静力的。在载荷开始时以 及通常延长的时间段里，软骨内的组织液会变得增压，由于此组织的双相性（biphasic nature)，液体也可以通过渗流机制(weeping mechanism)而被挤压至关节表面之间的微凸 体(asperities)。增压的组织液和捕集的润滑剂池(包含透明质酸）因而可以显著有助于正 常载荷的承受(具有很少的对剪力的抵抗），促进了很低的摩擦系数。另外，在载荷和/或运 动开始时，可以发生挤压膜、流体动力和流体弹性动力类型的流体薄膜润滑，且有增压、运 动、和变形作用来从相对运动中的两个表面之间的缺口推动各种润滑剂和/或推动各种润 滑剂穿过相对运动中的两个表面之间的缺口。
[0008] 在界面润滑(boundary lubrication)中，载荷得到了表面-与-表面的接触的支 持，并且相关联的摩擦性质由润滑剂表面分子(也即润滑素种类)所确定。此模式很重要，因 为相对接的软骨层通过互锁、扁平微凸体而在总面积的+/-10%实现接触，并且这很可能是 大部分的摩擦发生的地方。界面润滑本质上减缓"粘滑（Stick-slip )"（Meyer等， Nanoscience:Friction and Rheology on the Nanometer Scale,fforld Scientific Publishing Co .Pte.Ltd，River Edge，N.J·，（2002)，pp. 373)，也即，承载重量的交界软骨 表面彼此滑动时同时发生的猝动（jerking mot ion)，并因而表现为对稳定运动和起始运动 的降低的抵抗。软骨表面典型的磨损模式表明，关节软骨的界面润滑对于关节表面结构的 保护和保持是关键的。例如，润滑素空白小鼠显示出磨损但是新生小鼠（其不承载重量)却 未显不（Jay等，Arthritis and Rheumatism,56:3662-3669(2007)。
[0009] 随着载荷时间的增加以及流体静压的消失，相对于增压的流体，润滑剂涂敷的表 面承载越来越高的载荷，结果，μ越来越受到润滑的界面模式的支配。润滑的界面模式由稳 定滑动期间的摩擦系数所表示，其中影响流体薄膜形成的因素不变，如相对滑动速度和轴 向载荷。对于关节软骨，已经得到的结论是界面润滑必然会发生，但是要辅之以流体增压和 其它机制。眨眼期间眼角膜和眼睑交界面处的润滑机制并不涉及显著的载荷，因而减轻了 有效润滑的物理化学要求，因此其很可能与软骨润滑有很大不同。然而，据提议润滑的界面 模式可以在包含泪液膜时处于支配状态，如在干眼病中。
[0010] 被认为造成滑液出色润滑性质的两种机械成分是润滑素和透明质酸(或者透明质 酸盐(酯)或"ΗΑ"，下文可互换使用）。润滑素已经被显示出在关节连接滑膜关节中作为界面 润滑剂以及用于保护软骨的表面以防摩擦力、细胞粘连和蛋白沉积。例如，美国专利号6， 960，562和6，743，774公开了包含基本纯的PRG4同种型的润滑多肽，以及通过全身性或者直 接施用至组织而润滑滑膜关节或其它组织的方法。ΗΑ本身已经被显示出在界面模式润滑下 于软骨-软骨界面处相对于盐水而言降低μ(3.3mg/ml的ΗΑ中0.12对比roS中~0.24)，而仅 有润滑素将μ降低至更低的水平，但是包含HA以及润滑素的滑液可以将仅有润滑素或者HA 与润滑素的合成混合物所不能实现的摩擦系数赋予给界面表面。尚未有润滑素与ΗΑ的合成 混合物能够完全复制天然形式的滑液所赋予的低摩擦系数。来自各种来源的以及各种分子 量的ΗΑ已经与以下混合进行了测试:从滑膜细胞体外表达的润滑素，牛润滑素，从滑液提取 的并且在ΗΑ中"重构的"润滑素，以及在早期尝试用重组DNA技术制备时以毫克量表达的润 滑素。
[0011]此前在适于商业拓展的规模尝试重组生产全长润滑素还没有取得成功。从CH0细 胞表达的人类润滑素种类很低的（每升个位或者十位数毫克)生产率被认为过低而不能支 持商业产品。解决此问题的一种方法是截短外显子6中的重复数目，并由此降低糖基化侧链 的质量而又至少保留一些润滑能力（参见，例如美国专利号7,642,236和7,893,029)。此方 法据报道会导致截短的构建物每升300至400毫克的总生产力（纯化前）。
[0012] 发明概述
[0013]现在已发现人类PRG4基因可用于产生大的、商业量的新型的、高度糖基化的类人 类形式润滑素，下文简单称之为"润滑素"、多聚体润滑素、重组人润滑素、或rhPRG4。如本文 所公开的，这是通过以下来实现的：将人类PRG4基因（hPRG4)转染至某些经修饰的中国仓鼠 卵巢(CH0)细胞中，所述细胞已被发现有能力大规模地将表达的蛋白翻译后糖基化，并继而 在商业规模体积的培养基中培养所述细胞，例如，至少10升、更常见至少50升、优选至少100 升或至少500升、以及最优选1，000升或更多。
[0014] 本发明的润滑素包含多分散的润滑素单体单元形成二聚体和多聚体以及任选存 在的游离单体。每个单元均被高度地且可变地糖基化，其中糖苷残基侧链贡献了其分子量 的至少30%、常为35%或40%、以及可能高达45%或更高。
[0015] 在天然人类润滑素中，糖基化由1型核心〇-连接GalNAc-Gal(N_乙酰半乳糖胺-半 乳糖)二糖(其至少60%在末端有唾液酸取代）、以及还有2型核心糖基化组成，所述2型核心 糖基化在1型核心之外涉及在各种同分异构的构型中的GlcNac(N-乙酰葡萄糖胺)单糖(参 见，例如Estrella等，Biochem J. ,429(2) :359-67(2010))〇
[0016] 本文中公开的所产生的重组材料与天然形式的人类润滑素相比富含1型核心聚 糖。其糖基化包含至少95%的1型核心侧链，更可能是超过98%或99%。另外，所述侧链常常 会被硫酸化至天然人类润滑素中未曾见过的程度。这将本发明的rhPRG4与天然hPRG4区分 开。该提高的硫酸化含量被认为可以向粘液糖蛋白增加额外的负电荷，其可用于增强所述 粘液糖蛋白抵制附近生物分子并由此提高其润滑性的能力，并且使分子结构紧绷，从分子 角度使其更刚硬，这可以有助于发挥起降低纳米尺度和中尺度摩擦的能力。
[0017] 全长（非截短的）润滑素单体序列（SEQ ID NO: 1)在核心蛋白中包含1404个氨基 酸，或者说大约151kDa。人类润滑素的信号序列是SEQ ID NO: 1的残基1-24。因而，人类润滑 素的成熟形式是SEQ ID NO: 1的残基25-1404。如本文所公开的产生的重组产物的彻底还原 会产生大约300kDa-460kDa表观分子量的单体种类，这是通过在许多分子量确定技术(包括 SDS三羟甲基氨基甲烷醋酸盐3-8%聚丙烯酰胺凝胶电泳）中与分子量标准比较而评估的。 使用质谱技术分析糖基化以及组合了其它操作表明，糖基化的重组单体的真实分子量(而 不是从凝胶迀移率所推断）很可能是在220-280kDa的范围，且不太可能超过大约300kDa。在 润滑素单体的序列中可能存在的作为〇-连接糖基化位点的总共大约329个0-连接(其中284 个为苏氨酸）中，有大量的可变和未知数量的被取代（100至150个，或许高达200或220)。在 总的糖基化中，大约有一般包含两个糖单元（GalNAc-Gal)，以及一半包含三个糖单元 (GalNAc-Gal-唾液酸）。最丰富的形式是硫酸化的Gal-GalNac，次丰富的是唾液酸化的Gal-GalNac 〇
[0018] 所述润滑素表达产物能够抵抗(但却并不能免除）断裂成单体或者二聚体的润滑 素种类。彻底还原的结果表明单体单元之间和之内包含二硫交联。另外，用变性缓冲液处理 (没有还原)可导致较低分子量的产物，表明了较高级别的四级结构，其中通过疏水相互作 用、氢键、物理缠结和/或允许自我组装的其它非共价连结而将链保持在一起。所述二聚体 和多聚体是多分散的（polydisperse)。其中的分子种类通常具有大约450-600kDa的分子 量，以及多聚体种类常常是2,000kDa或更多。通常，非还原的复合物的一些种类在电泳实验 中基本上不进入3-8%的SDS-PAGE凝胶。复合物更大的种类被认为是包含3至5个(或许可高 达20个)单体单元。
[0019] 不受理论局限，认为此类较大的超分子成分是作为单体/二聚体浓度的函数而形 成的。目前，认为单体/二聚体至少大约〇.5mg/ml的浓度对于较大复合物的自然形成是最佳 的。比这低很多的浓度(例如低于大约〇.lmg/ml)则包含单体和二聚体，而只有很少的量的 复合物；比这高很多的浓度则可形成肉眼可见的聚集物成为雾状或絮状溶液。可以使用表 面活性剂或者赋形剂来在形成复合物时防止大聚集物(其总是与二聚体的种类一起出现） 的形成，所述表面活性剂优选一般认为是安全的生理学适用的非离子表面活性剂，例如基 于聚氧乙烯的表面活性剂。
[0020]使用包含本发明润滑素的制剂进行的测试显示出，其在载荷下的润滑和组织保护 性质可超过本领域内此前已知的重组润滑素。不受理论局限，本发明人推测，在未受润滑的 载荷下交界面组织运动时发生粘滑现象的时候，本发明润滑素的涂敷可以将切力从下面的 软骨表面转移至多分散的润滑素涂敷内的层。也即，本发明人认为，在载荷下和往复运动 时，下表面经受较少的切力，保持其完整性，因为涂敷中的润滑素分子彼此覆盖，而在载荷 去除后很可能会重新排列（参见，例如Lee等，PNAS，110(7):E567-574(2013))。该作者表明 了，滑膜关节磨损并不与摩擦系数直接相关，但是更直接地与粘滑滑动相关，并且滑膜关节 的不同分子成分协同作用来防止磨损。
[0021 ]在任何情况下，本发明的润滑素产物，在接受测试时，呈现出卓越的润滑性质，导 致摩擦系数(静态和动态的)常常位于纯化的天然牛润滑素的系数的150%、120%、110%之 内或者基本上与之相等(通过本文公开的软骨对软骨的润滑测试来测定）。在这些测试中， 本发明的类人糖蛋白实现了静态摩擦系数位于或低于0.5和低于0.2(取决于本文所公开的 测试条件），以及动态摩擦系数常常位于或低于大约〇. 1，二者都是通过在体外减压软骨对 软骨的载荷而进行测量(具有固定接触面积）。当与透明质酸(HA)组合时，这些值提高至对 于静态测量的低于大约0.3以及低于0.1(取决于保压时间（dwell time))以及对于动态测 量的低于0.1，很接近于滑液可接受的值。因而，此类组合物可以显著减少滑膜关节磨损。
[0022] 因此，本发明的一个方面包括用于润滑素的商业生产的方法。在一个实施方案中， 所述方法包括以下步骤：在培养基中培养中国仓鼠卵巢（CH0)细胞，所述中国仓鼠卵巢 (CH0)细胞转染有人类PRG4基因，并且其在足以产生润滑素糖蛋白的时间里和条件下表达 所述人类PRG4基因并对表达产物进行翻译后糖基化;和从所述培养基纯化润滑素糖蛋白。 例如，在一些实施方案中，将所述润滑素糖蛋白与细胞外液中的宿主细胞蛋白和其它杂质 分离，以至少部分地将其纯化。所述重组蛋白仅需要从培养基中富集，而不是纯化至均质 性，以便纯化用于本发明方法的目的。所述方法足以产生这样的润滑素糖蛋白，其具有至少 30%重量的糖苷残基在培养基中浓度为至少0.4g/L。
[0023] 在一些实施方案中，所述CH0细胞是包含编码人类PRG4基因的核酸的CH0-M细胞。 在其它实施方案中，所述CH0细胞转染有第一载体以及转染有第二载体，其中所述第一载体 包含编码染色质元件的核酸，而所述第二载体包含编码人类PRG4基因的核酸。所述染色质 元件可以是边界元件、基质附着区、基因座控制区、或通用染色质开放元件（universal chromatin opening element)。在优选的实施方案中，所述染色质元件是基质附着区。 [0024]在另外的实施方案中，所述CH0细胞转染有第一载体以及转染有第二载体，所述第 一载体包含编码染色质元件和编码人类PRG4基因的核酸，而所述第二载体包含编码染色质 元件和编码人类PRG4基因的核酸。在优选的实施方案中，所述第一和第二载体中的染色质 元件是基质附着区。
[0025]在一些实施方案中，所述二聚体或多聚体润滑素糖蛋白重量的至少30%、至少 35%、至少40%、或至少45%是糖苷残基的重量。在一些实施方案中，所述二聚体或多聚体 润滑素糖蛋白重量的超过30 %、超过35 %、超过40 %或、超过45 %是糖苷残基的重量。所述 糖苷残基可以与天然人类润滑素的那些不同，因为重组类人润滑素的糖基化至少90%、至 少95%、或至少99%的重量为1型核心糖基化。另外，在一些实施方案中，与天然人类润滑素 相比所述糖苷残基富含硫酸化的单糖。
[0026]所述方法出乎意料地能够产生具有商业效益的量的全长润滑素糖蛋白。例如，可 以在足以产生这样的润滑素糖蛋白的时间里和条件下培养所述细胞，所述润滑素糖蛋白在 培养基里的浓度为每升培养基至少约〇. 4克或0.5克重组润滑素、优选每升培养基至少0.8 克、以及最优选每升培养基至少1. 〇克的润滑素，例如，在至少约1 〇、50或100升的培养中。所 述方法经优化后可以在每升的培养基产生多达2.0、至少2.5、或至少3.0克的润滑素。基于 优化的纯化方案的开发，将可能会获得每升至少约200毫克的纯化重组润滑素、优选至少 300mg/L、更优选至少500mg/L、以及最优选可以获得更多。就
【申请人】所知，此前在任何类粘 液素蛋白（或者大小上与润滑素相当的蛋白）的重组表达中都从未实现这些水平的生产力， 并且表达PRG4的尝试也从未成功产生具有本文所述产品的性质的材料。
[0027]在优选的实施方案中，单体润滑素种类常常从培养基中与多聚体蛋白种类混杂在 一起被共同纯化出来。所述多聚体种类富含二聚体润滑素种类。例如，在一些实施方案中， 所述方法产生这样的重组润滑素的混合物，其包括单体、二聚体、和多聚体润滑素种类。在 一些实施方案中，所述润滑素糖蛋白包含至少5个经二硫键或者经非共价连结的个体糖基 化氨基酸链，并且具有至少1200kDa的分子量。
[0028]根据本发明的方法所产生的糖蛋白，在使用下文所述方案进行测试时，产生出接 近纯化天然哺乳动物润滑素所曾观测到的最低值的摩擦系数。例如，在一些实施方案中，所 述重组润滑素糖蛋白是这样的多聚体蛋白蛋白，其在软骨对软骨摩擦测试中测量的所产生 的静态摩擦系数不超过纯化的天然牛润滑素静态摩擦系数的150%。在其它实施方案中，所 述重组润滑素糖蛋白是这样的多聚体蛋白，其在软骨对软骨摩擦测试中测量的所产生的静 态摩擦系数不超过纯化的天然牛润滑素静态摩擦系数的120%。在另外的实施方案中，所述 重组润滑素糖蛋白是这样的多聚体蛋白，其在软骨对软骨摩擦测试中测量的所产生的静态 摩擦系数不超过纯化的天然牛润滑素静态摩擦系数的110 %。
[0029]本发明的另一方面涉及在宿主细胞培养中从人类PRG4基因表达的重组多聚体润 滑素糖蛋白的组合物。所述重组润滑素糖蛋白至少30%重量为糖苷残基，并且在软骨对软 骨摩擦测试中测量的所产生的动态摩擦系数不超过纯化的天然牛润滑素动态摩擦系数的 150%〇
[0030] 在一些实施方案中，所述重组润滑素糖蛋白重量的至少35%、至少40%、或至少 45 %为糖苷残基。
[0031] 在一些实施方案中，在软骨对软骨摩擦测试中，所述重组润滑素糖蛋白产生不超 过纯化的天然牛润滑素的动态摩擦系数的110 %或不超过其120 %的摩擦系数。
[0032] 在一些实施方案中，所述重组润滑素的糖苷残基与天然人类润滑素的糖苷残基的 不同在于，所述重组润滑素的糖基化重量的至少90%、至少95%、或至少99%为1型核心糖 基化。另外，在一些实施方案中，与天然人类润滑素相比所述重组润滑素的糖苷残基富含硫 酸化的单糖。
[0033] 在一些实施方案中，所述重组润滑素是单体、二聚体和多聚体种类的混合物。在一 些实施方案中，所述润滑素包括单体种类。在一些实施方案中，所述润滑素包括二聚体的种 类。在一些实施方案中，所述润滑素包括多聚体种类。在一些实施方案中，所述润滑素是多 聚体单体种类的混合物。
[0034] 在一些实施方案中，所述润滑素糖蛋白包含至少5个经二硫键或者经非共价连结 的个体糖基化氨基酸链，并且具有至少1200kDa的分子量。
[0035] 在一些实施方案中，重组润滑素糖蛋白的组合物还包含与所述润滑素糖蛋白混杂 的透明质酸或其盐。
[0036] 在另一实施方案中，本发明涉及包含溶液的组合物，所述溶液包含100克的人类润 滑素，其中所述润滑素的糖基化至少99%的重量为1型核心糖基化。在一个实施方案中，所 述润滑素是重组人类润滑素。在另外的实施方案中，所述溶液中润滑素的浓度为至少〇.5g/ L。在另外的实施方案中，所述溶液是细胞培养基。
[0037]本发明的组合物可用于制备药物，所述药物用于任何已知的或此后发现的PRG4糖 蛋白的医疗或其它用途，包括作为用于与身体接触的各种设备的涂层(参见，例如美国专利 申请号2009/0068247和2011/0142908);用于通过滑膜关节润滑的增强而在人类或动物中 治疗滑膜关节（美国专利申请号2004/0229804)或者粘弹性物补充疗法(美国专利申请号 2008/0287369);用于局部应用于组织表面，例如，在手术期间抑制粘连或纤维性结缔组织 的随后形成（美国专利申请号2004/0229804);用于治疗干眼病（美国专利申请号2011/ 0059902);用于治疗口干症(美国专利申请号2013/0039865);用于治疗间质性膀胱炎（美国 专利申请号2012/0321693);作为阴道润滑剂(美国专利申请号2012/0052077);用于隐形眼 镜护理和储存溶液(美国专利申请号2012/0321611)或者用于全身注射以便，例如抑制细 胞-细胞粘连或者在脉管内的运动（参见，例如2013年11月26日提交的美国临时申请61/ 908,959)〇 [0038] 附图简述
[0039]图1和2是用于开发表达润滑素的CH0-M克隆（用于本发明的方法并编码hPRG4全长 序列）的载体的质粒图谱。
[0040] 图3和4描绘了可用于评估本发明的重组人润滑素结构的聚丙烯酰胺凝胶。
[0041] 图5是一次润滑素生产过程的生产力的图示，该生产过程测量每升转染的CH0-M细 胞培养物随时间所产生的润滑素毫克数。在每个收获日期有三个柱状图。左侧的柱状图为 "标准曲线24Jun 14"，中间的柱状图为"标准曲线24Jul 14"，而右侧的柱状图为"标准曲线 25Jul 14"。
[0042] 图6是显示本发明重组人润滑素的1型核心聚糖的示意图。
[0043]图7是色谱图，其中峰被标记，显示出从本发明的重组人润滑素中的SER和THR残基 上垂下的各种二糖和三糖的相对丰度。
[0044] 图8是示意图，其显示了扩展至从人类滑液提取的天然润滑素上的2型核心结构的 更大范围的聚糖。
[0045] 图9是色谱图，其中峰被标记，显示出天然人类润滑素中各种糖残基的相对丰度。 [0046] 图10A、10B、和10C是表面张力对比rhPRG4和/或聚氧乙烯表面活性剂浓度的制图， 显示出随着rhPRG4浓度的升高表面张力的降低。
[0047]图11A和11B示出数据，将rhPRG4溶液的静态（图11A)和动态（图11B)摩擦系数与纯 化的天然牛PRG4、盐水(PBS)、和牛滑液比较，其中两种PRG4制剂均为450yg/mL。标注a、b、和 c表示结果中统计学显著的差异(？〈〇.〇5)，11 = 7。在^1-?1?4(重组的）和1^1出4(天然的）的结 果中没有统计学显著的差异，由图11B中每个柱状图上存在的"b"所表明。
[0048] 图12A-B示出数据，将HA加上rhPRG4溶液的静态(FIG.12A)和动态（图12B)摩擦系 数与盐水、仅有rhPRG4、和牛滑液比较，其中rhPRG4为450yg/mL而HA (1.5MDa)为3.3 3mg/mL。 图12B中每个柱状图上的标注a、b、c、和d表示结果中统计学显著的差异(p〈0.05)，n = 4。
[0049] 图13示出数据，显示在消化天然牛PRG4并应用rhPRG4之后于交界面牛组织表面的 润滑性重建。
[0050] 图14A-D示出数据，显示盐水中300μg/ml的天然牛PRG4和rhPRG4、和仅有盐水时， rhPRG4在人类眼角膜-眼睑交界面（图14A-静态，图14B-动态)和人类眼角膜-PDMS (图14C-静态，图14D-动态)交界面处对界面润滑的作用。数值为均值±SEM(n = 6)，其中眼角膜-目艮 睑(AB)和眼角膜-PDMS(O))交界面的平均正向应力（normal stress)分别为14.1 ± 2.2和 16.9 ± 5.3 (均值土 SD)。这些数据表明了 rhPRG4与纯化的天然PRG4在低载荷润滑任务中几 乎相同的润滑性质。
[0051] 图15是全长人类润滑素的氨基酸序列，其长度为1404个氨基酸。信号序列残基（1-24)以粗体显示。
[0052] 图16是编码全长人类润滑素的核酸序列。
[0053] 发明详述
[0054]本发明人研究了使用重组DNA技术生产已知人类润滑素糖蛋白的选择，目标在于 产生这样的生产方法，其中涉及在无血清生长培养基中运用哺乳动物细胞进行的悬浮培 养。与
【申请人】熟知的使用重组DNA技术产生蛋白的之前的尝试不同，挑战在于产生商业量的 这样的复杂的、大的生物聚合物，其价值在于其纳米尺度的机械性质，而不是其生化性质， 并且这些物理性质依赖于翻译后糖基化以此前从未在改造的细胞中观测到的尺度成功进 行。
[0055]此前重组产生全长润滑素的尝试每升的量仅仅曾产出低数量的毫克，而需要的是 每升产生至少约1-2克的方法。对文献的综述表明尚无成功在商业规模重组产生全长的适 当糖基化的润滑素的报道，也没有商业规模表达任何粘液素或类粘液素蛋白的报道。检索 确实显示有报道提出此类高度糖基化的糖蛋白作为润滑素很难表达。参见，例如美国专利 号7，642，236，其中提到："为了优化表达参数并研究所有大约76-78个类似KEPAPTT的序列 的功能必要性，设计了润滑素表达构建物，其使得能够合成具有变化程度的〇-连接寡糖取 代的重组润滑素蛋白"。表达截短的润滑素构建物的重组细胞系的生产力数据在该专利中 没有公开。
[0056] 本发明人寻找并最终获得了瑞士日内瓦的Selexis S.A.来产生表达润滑素的克 隆培养物，这部分地基于报道的Selexis技术的能力（涉及表观遗传调节因子的表达，以增 强难以表达的蛋白的生产）（参见Selexis美国专利号7，129,062和8,252,917以及美国专利 申请公开号2011/0061117、2012/0231449和2013/0143264,其公开内容援引加入本文； Girod等，Nat Methods 4(9) :747-53(2007) ;Harraghy等，Curr Gene Ther.8(5) :353-66 (2008))〇
[0057] Selexis技术的应用导致了成功表达润滑素的克隆的开发。分析之后，进行规模扩 大和纯化，发现了新开发的重组生产过程导致了此前从未有描述过的、多聚体的、高度和差 异糖基化的类人润滑素形式，并且产量对于此类高度糖基化的、高分子量的类粘液素糖蛋 白而言也是出乎意料的水平。对于富含新的重组润滑素形式的制剂所进行的测试证明了出 乎意料的性质，并且使得可以产生具有改善的生理学适应性的组织润滑组合物。
[0058] 重组人润滑素(rhlubricin)制备过程
[0059] 宿主细胞
[0060] 产生Selexis克隆的工作是使用其专有的CH0-M细胞系来完成的，该细胞系含有基 于DNA的元件控制染色质的动态组织，所谓的基质附着区。所述CH0-M细胞系是中国仓鼠卵 巢细胞系衍生自CH0-K1细胞(ATCC，Cat. #CCL-61，Lot. 4765275)，其适应无血清培养条件并 用于产生重组蛋白。参见Girod等，Nat Methods 4(9) :747-53(2007)和上文提到的Selexis 的美国专利和出版物，其涉及使用基质附着区(MAR)的MAR方法用于开发稳定高表达的原核 细胞系如CH0、以及涉及经转染表达蛋白的细胞所述蛋白参与表达产物穿过ER膜的移位和/ 或穿过细胞质膜的分泌。CH0-M被用于产生治疗性重组蛋白并且允许更高的和更稳定的表 达。其使用使得可以分离出展现期望的、高水平表达(用于产生重组蛋白）的克隆。
[0061 ]基质附着区（"MAR"）是以高亲和力结合分离的核骨架或核基质的DNA序列（Hart 等，Curr Opin Genet Dev,8(5):519-25(1998)。由此，它们可以定义独立染色质结构域的 边界，从而只有所涵盖的顺式调控元件控制结构域内的基因的表达。已经有显示MAR序列与 增强子相互作用以提高局部的染色质可接近性（Jenuwein等，Nature，385 : 269-272 (1997))，并且可以在细胞培养系里增强异源基因的表达。携带有鸡溶菌酶5'MAR元件的质 粒与一或多个表达载体的共转染会导致提升的稳定转基因表达(显示出产生与对照构建物 相比提高20-倍的表达）。
[0062] MAR是本文引用的Selexis申请和出版物中公开的一种类型的"染色质元件"（本文 中也称作Selexis遗传元件或SGE)。染色质元件或SGE用于防止围绕着异源基因整合至宿主 染色体位点的染色质影响所整合的基因的表达水平。染色质元件包括边界元件或者隔离元 件（BE)、基质附着区（MAR)、基因座控制区（LCR)、以及通用或者遍在的染色质开放元件 (UC0E)。一旦表达载体整合至宿主细胞染色体中，则SGE使染色质成型并因而使转基因保持 在高度转录活性状态。
[0063] 所述CH0-M宿主细胞在SFM4CH0培养基(HyClone)中培养，其中补加了 8mM的L-谷氨 酰胺、次黄嘌呤和胸苷（lx HT，Invitr〇gen)。细胞在潮湿的温育器中于37°C和5%的C02下 保持搅动（120rpm，25mm滑动（stroke))。
[0064] 载体构建
[0065] 将编码全长1404AA人类润滑素蛋白的PRG4基因（SEQIDN0:2)插入到了商业可购 买的质粒载体中（Selexis S.A.专有）（Geneva, Switzer land)以用于在哺乳动物细胞中增 强的基因表达。编码全长人类润滑素的另一个序列可以从GenBank登录号NM_005807.3获 得。
[0066]构建了两个表达载体。润滑素基因被克隆至携带有嘌呤霉素抗性的载体以及另一 个携带有潮霉素抗性的载体中。包括嘌呤霉素抗性的载体命名为pSVpuro_C+_EFlalpha (K0ZAK-ext9)EGFP_BGH pA>X_S29(2*HindIII，SalI填充）（Mw = 9861)。包括潮霉素抗性的 载体被命名为pSVhygro_C+_EFlalpha(K0ZAK-ext9)EGFP_BGH pA>X_29(2*HindIII，SalI填 充(Mw=10299)。所述表达载体含有来自转座子Tn3(AmpR)的细菌β-内酰胺酶基因（赋予了 氨节青霉素抗性），以及细菌ColEl复制原点。作为pGL3Control(Promega)的衍生物，表达载 体的终止子区域含有SV40增强子(位于多腺苷酸化信号的下游）。每个载体还在表达盒的下 游包括一个人类X_29SGE以及在SV40启动子控制之下的整合的嘌呤霉素或潮霉素抗性基 因。X_29SGE是指Selexis遗传元件（"SGE"），在此情形中是基质附着区(MAR)，其在本文引用 的Selexis申请和出版物中公开。两种表达载体均编码在hEF-1-alpha启动子结合CMV增强 子的控制下的感兴趣的基因（PRG4)。质粒通过测序验证。
[0067] 携带有嘌呤霉素抗性基因和携带有潮霉素抗性基因的载体的质粒图谱分别在图1 和图2中示出。
[0068] 11?
[0069] 使用定义为CH0-M细胞脉冲条件（ 1250V，20ms和3脉冲）的MicroPorator? (NanoEnTek Inc.，Korea)来通过微穿孔而转染所述细胞。使用了并行的GFP表达载体来控 制转染效率，并显示出转染效率在50-70%之间。首先用嘌呤霉素 PRG4表达载体转染所述 CH0-M细胞，并通过在含有嘌呤霉素的培养基上的培养来筛选经稳定转染的细胞。更具体而 言，将稀释液分配至96-孔平板上，在接下来的一周通过向所有孔添加100yL的新鲜培养基 (SFM4CH0培养基，补加有8mM的L-谷氨酰胺、lx HT包括5yg/mL的嘌呤霉素)来进行给料。通 过将完全的细胞悬液从相应的96-孔转移至24-孔平板(用相同培养基预处理）的一个孔，而 在铺板后的15天将27个小汇集(mini汇集)重置于24-孔平板。在4天之内分析了 24-孔的悬 液并且将14个小汇集转移至6-孔平板（lmL细胞悬液+2mL新鲜培养基(包括筛选））。3天后通 过悬液以及在离心管(5mL工作容积）中收集而将8个表达最好的小汇集进行了扩展，并在3 天后在搖瓶(20mL工作容积）中进行培养。在保存前进行了随后的一次传代。
[0070] 在搖瓶中扩展了抗性细胞的汇集，以产生初步研究所需的材料(总管l-2mg).通过 将细胞培养物在800g离心5min而获得了无细胞培养基样品。通过斑点印记分析而测定了重 组PRG4的表达。将10微升的无细胞培养基(浓缩的样品）应用于PVDF膜(Millipore)上并使 样品干燥成斑点。通过将PRG4从80μg/ml系列稀释至2.5μg/ml而创建了 PRG4标准物。通过针 对PRG4的润滑素合成肽的单克隆抗体(Pierce)的措施来检测重组PRG4。
[0071] 接下来用来自性能最佳的小汇集的细胞进行了超转染(对已经过筛选的小汇集群 体进行额外的转染），其中施用第二种筛选标记，所述潮霉素抗性盒。使用了上文所述的相 同转染方案。在此第二次转染后1天，在SFM4CH0培养基中开始了筛选，也补加了 8mM的L-谷 氨酰胺和lx HT，但还包括lOOOyg/mL的潮霉素。在更换培养基后，4天内将3个汇集转移至6-孔平板；4天后将全部3个（3)汇集扩展至离心管（5mL工作容积）并在三天内扩展至摇瓶 (20mL工作容积）。
[0072] 克隆生成
[0073]继而在多个以及系列的实验中将超转染的汇集进行培养并分析生长潜力，以尝试 将细胞性质最大化。
[0074]在第一个实验中，在100细胞/mL的浓度更换培养基之后，将三个超转染的汇集(命 名为P01ST、P05ST、和P14ST)转移至6-孔平板（每个汇集两个平板），于半固态培养基（2x SFM4CH0培养基(HyClone)和CloneMatrix(Genetics)中，包括8mM的L-谷氨酰胺，lx HT和细 胞Boost 5TM(HyCl〇ne)，（无筛选）。16天之后对铺板的细胞进行了筛选，（ClonePix?系统 (Molecular Devices))，且挑选了22个候选并转移至96-孔平板(具有上文所述的生长培养 基(但是无筛选））。6天后将全部18个生长的候选重置至24-孔平板，其中是通过将完全的细 胞悬液从相应的96-孔转移至24-孔平板的一个孔(经lmL的培养基预处理）。在3天内分析了 24-孔上清，并将12个候选转移至6-孔平板（lmL细胞悬液+2mL新鲜生长培养基（包括筛 选））。5天后将7个最佳表达的候选扩展至离心管(5mL工作容积）内培养基(无筛选）中的悬 液培养中，并在5天内扩展至摇瓶(20mL工作容积）中。
[0075]所有的细胞系都被保存起来。在摇瓶(接种3xl05细胞/mL，20mL培养容积）内于分 批给料培养(给料策略-16%的原始体积的CB5溶液(HyClone)，52mg/mL，在第0、3、4、5、6、7 天给料）中比较了3个最佳候选的性能。在第8天，所述培养物含有4.22x 106至4.95x 106细 胞/mL以及94%至96%的活力。对这些汇集的细胞群体进行了计数并稀释用于单一细胞铺 板(浓度1细胞/孔，2个平板）。在11天后通过向每孔添加 100μΙ的生长培养基来对单一细胞 群(single colony)进行给料(无筛选）。在17天后，将99个克隆重置于24-孔平板中，其中是 通过将完全的细胞悬液从相应的96-孔转移至24-孔平板的一个孔(经lmL的培养基预处 理）。在4天内，24个被转移至6-孔平板(3mL的新鲜生长培养基包括筛选）。4天后8个克隆被 扩展至离心管(5mL工作容积）中的悬液培养，并且在一次培养基更换(SFM4CH0培养基，补加 有8mM的L-谷氨酰胺和lx HT)之后所有8个克隆都被扩展至摇瓶(20mL工作容积）。在保存所 有候选前进行了随后的一次传代。
[0076]使用分批给料培养(给料策略16%的原始容量CB5溶液(HyCl〇ne)，52mg/mL，在第 0、3、4、5、6、7天给料），在摇瓶(接种3x 105细胞/mL，20mL培养容积）中对5个最佳候选的性 能进行了比较。在第3天各个培养物中的细胞数目范围在1.61x 106至3.46x 106细胞/mL，翻 倍时间范围在19.8至30.7小时）。在第8天，细胞的浓度范围在4.02x 106至9.48x 106细胞/ mL，其中细胞活力范围是88.6%至97.7%。
[0077]在第二个实验中，将3个不同的超转染的汇集（命名为P14STcp08、P05STll和 P14ST33)用上文所述的相同的程序处理。这导致了 4个克隆细胞系。再次，这些克隆的性能 在摇瓶中进行了比较，导致在第8天细胞浓度的范围是3.5x 106至9.48x 106细胞/mL并且活 力为 75.3%至 88.1%。
[0078] 来自上文所述的ClonePix?系统筛选的第一轮的克隆(P14ST15)(其在第8天展现 出6.03x 106细胞/mL以及95.5 %的活力）在摇瓶(20mL工作容积）中进行了解冻。在一次随 后的传代之后，该候选被转移至单一平板（以200细胞/mL的浓度（1个平板）），于上文所述的 半固态培养基外加 CloneMatrix中，包括8mM的L-谷氨酰胺，lx HT和细胞Boost 5?，无筛选。 12天后使用ClonePix?系统对铺板的细胞进行了筛选，挑选了 84个克隆并转移至96-孔平板 (无筛选）。通过向每孔添加1〇〇μ1的生长培养基来对单一细胞群进行了给料。96-孔上清的 筛选在铺板后18天进行。最佳的24个生长的克隆被重置于24-孔平板，其中是通过将完全的 细胞悬液从相应的96-孔转移至24-孔平板的一个孔(经lmL的培养基预处理(无筛选）。在3 天内，分析了 24-孔上清，并将12个克隆转移至6-孔平板（lmL细胞悬液+2mL新鲜的生长培养 基(包括筛选））。4天后将6个最佳表达的克隆扩展至离心管(5mL工作容积）中的悬液培养， 以及在4天内扩展至摇瓶(20mL工作容积）。在保存前进行了随后的两次传代。保存了 6个克 隆细胞系。
[0079] 如上文在摇瓶中比较了6个最佳候选的性能。在第8天，细胞密度范围在9.04x 106 至6 · 40x 106细胞/mL之间，并且活力在74 · 6%至93 · 1 %之间。
[0080] 冷冻保存和测试
[0081] 在所述克隆汇集的多次传代后（从6至31)，以6xl06细胞/小管来将所述汇集冷冻 保存在小管中并储存于液氮中。通过使用Veno^Gem支原体检测试剂盒（ Minerva Biolabs)确认了所有细胞系都没有支原体。根据厂商方案接种并温育无菌性测试(Heipha， Caso-Bouillon TSB)。确认了所有小汇集和超转染的小汇集的无菌性。
[0082] 放大培养
[0083] 选择了命名为P05STll-cp05的细胞系用于放大。对于200升的运行，使用了如下条 件和方案：
[0084]
[0085] 在200升的培养中从第1天至第8天，rhPRG4的表达与存活细胞密度(V⑶)一起提 高。VCD在第8天进入平台期，继而开始下降，这在一旦条件对于密集细胞培养系统的代谢需 求不再是最佳时是通常可见的。尽管如此，rhPRG4的表达依然不减退，并且其表达在VCDS 12-14x 106细胞/ml的培养系统中于培养的第13天达到了最大浓度。图5显示了重组润滑素 随着时间的累积量，其是使用HPLC作图的曲线下面积测量的，并通过与样品系列稀释的 HPLC纯化(认为至少99%的纯润滑素)所制成的三个不同的标准曲线比较而进行解读。如所 示，此过程估计重组润滑素的生产接近2.5g/ml。另外的生产运行在由各种技术测量时其表 现产量有变化。由竞争性ELISA测量的一个运行产生了 1.5g/升水平的润滑素。另一个产生 了 1.4g/升的读数。
[0086] 重组PRG4的纯化
[0087]开发纯化方案的目的是要在与杂质分离时保留所表达的润滑素产物及其多聚体 复合物的润滑功能、避免聚积、以及保持高产量。这由于如下原因而成为挑战：润滑素的重 度糖基化、其高分子量、其抗粘连和表面润滑性质、以及其随着纯度提高而形成复合物和聚 集形成不可溶微粒的倾向。早前的实验表明，由于所收获的培养基中润滑素滴度很高，因而 可能必需要流通模式的色谱来避免纯化损失。开发了一种策略，通过色谱吸附提取杂质而 将润滑素产物保留在流通物中。在开发过程中，发现产量对于所使用的非离子表面活性剂 成分很敏感，如例如，失水山梨醇月桂酸酯的聚氧乙烯衍生物。润滑素汇集中此种表面活性 剂的缺失导致在色谱分离步骤后的超滤/渗滤以及〇.2μπι过滤期间产物的显著损失。只要使 用0.1%重量的表面活性剂即可大大提高产量。通过试错，发现较低浓度的表面活性剂成功 保留了功能并改善了产量。
[0088]在纯化过程中所使用的非离子表面活性剂之外，生理学相容形式的赋形剂，如 [(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)和/或赖氨酸，可以与本发明润滑素的溶 液混合并且可以对稳定溶液有益处，例如，避免或者减少含有超过〇. 4或0.6mg/ml浓度的溶 液中润滑素的聚积。
[0089] 迭代测试导致了下文所示的纯化过程的开发。
[0090] 通过沉降所澄清的培养基（10〇11^)用511^的20〇111]\11^8、4〇111]\11%(：124!18.2来稀 释，并与400单位的1^112〇仙86(2501111；^8/^1，1'1〇￥38611)混合来去除可溶的多核苷酸。该溶液 在室温混合4小时，继而与37.8g的尿素混合以将尿素的浓度调节至6M，并导致120mL的溶 液。为此加入了 1N的NaOH以将pH调节至11以及0.01 %的Tween 20(失水山梨醇月桂酸酯， Sigma)〇
[0091] 经Benzonase处理后的材料接着用GE Q Big Beads?的阴离子交换树脂(pH 11)处 理，其中存在6M的Urea和0.01 %的Tween 20并且以流通(FT)模式运行，其中杂质结合至树 脂而产物却不结合。该柱首先用0.1N的NaOH来清洁;接着充入100mM的NaP〇4、1.5M的NaCl、 pH 7.2;并用200mM的Tris-Borate、6M的尿素 、pH 10再平衡。30ml容积的（XK 26x 6cm)柱接 着装载120ml溶液（4ml/ml树脂20ml/min的流速（240cm/hr)，随后用平衡缓冲液-100mM Tris-Borate、100mM NaCl、6M尿素、0.01%Tween 20、pH 11 来洗涤。装载之后一会儿，通过 洗涤收集产物（290mL总体积)直至加入脱离溶液(strip solution)0.1N Na0H+lM NaCl〇
[0092] 用1M的柠檬酸将此种部分纯化的流通物润滑素汇集进行pH调节至pH = 7.5,并穿 过轻磷灰石柱(BioRad CHT)，柱体积-14ml(XK 16x 7cm)，柱载荷-21ml装载/ml树脂，流速 = 10ml/min(300cm/hr)。该柱首先用0.1N NaOH的 1M NaCl清洁，充入500mM NaP〇4，pH 6.5; 用500mM NaP(k/6M尿素 ，pH 7.4再平衡；并载入来自上述步骤的29〇11^流通物。这之后是用 平衡缓冲液洗涤（15禮似?04,61尿素，0.01%了￥661120，？!17.4)，以产生3051111的含有产物 的流通物(f 1 〇w-through)。
[0093] 用1M的柠檬酸将来自羟磷灰石柱的流通物调节至pH 4.8并用水稀释，继而穿过GE SP Big Bead树脂，柱容积-6ml(XK 1·6χ 3cm)，柱载荷-58ml载荷/ml树脂，流速= 6.7ml/ min(200cm/hr)。该柱首先用0.5N NaOH清洁，充入lOOmM NaP〇4，1.5M NaCl，pH 7.4;用50mM 柠檬酸钠/6M尿素，0.01%TWeen 20，pH 4.8;并载入来自上述步骤的35〇11^的流通物。随后 是用平衡缓冲液、501^柠檬酸钠/61尿素、0.01%1^?^1120、？!14.8洗涤，以产生3781111的含 有产物的流通物。继而用10N Na0H(pH 7.2)将所述流通物中和。
[0094] 为了浓缩以及更换缓冲液，使用50kDa分子量截断值的TangenX 0.01m2平片膜 (TangenX技术Corporation)、LP筛选通道来过滤阳离子交换后的流通产物汇集。渗滤缓冲 液为 10mM NaP〇4、150mM NaCl、pH 7.2(PBS)和0.1%Tween 20。在用0.1N NaOH清洁后；用 MilliQ水清洗;并用 10mM NaP〇4、150mM NaCl、pH 7.2平衡，该膜以15,00〇1111/1112进行载荷;穿 流(Cross-flow)70ml/min;跨膜压= 6_7psi ;渗透流= 5_6ml/min以将溶液浓缩至50ml。
[0095] 最后，经耶0?后的产物汇集通过3&1'1:〇1'；[118 3&1'1：(^0代2、150-0.0151112的膜而经 受0.2μπι的过滤，其中膜载荷为~17,000ml/m 2,以及流速为45-50ml/min。所述膜首先用 1011^的似?04、15011^的似(：1、？!17.4来准备好，继而对产物进行过滤，随后是用~401111的缓 冲液的追踪过滤器(chase fi 1 ter)并且最后该过滤器被排干。
[0096]目前正在检验另外的赋形剂，以改进从UFDF和0.2um的过滤处回收最终纯化的产 物。此过程可以从每升收获的培养基产生大量的产物(至少96%的纯度）。另外的纯化策略 是本领域技术人员了解的。
[0097]润滑素产物的表征
[0098] 电泳
[0099] 全长润滑素氨基酸骨架的分子量为150,918道尔顿。分子和分子间的糖基化程度 和类型不同。本文中作为二聚体的种类制备的重组PRG4被认为是具有超过大约450kDa的平 均分子量。单体应具有220-280kDa的分子量，且不超过大约300kDa。
[0100] 图3示出了rhPRG4的考马斯亮蓝染色凝胶(Tris-Ac 3-8%NuPAGE:l< SDS-PAGE聚 丙烯酰胺凝胶电泳系统，Invitrogen)，非还原的（作为纯化的）和还原的和烷基化的。所有 编号的条带都通过MS/MS确认为润滑素，具有匹配人类PRG4的氨基酸序列（UniProt登录号 Q92954:SEQ ID N0:1)。如所示，如上文所述产生的重组润滑素(NR)含有具有~460kDa的大 约分子量(通过与分子量标准比较而估计）的主要条带，一个条带稍稍在之上，以及一个条 带在凝胶的顶端未能迀移进入该凝胶。
[0101] 翻译后加工成分的鉴别是用神经氨酸苷酶(NaNase 1)和0-糖苷酶DS同时消化 rhPRG4来完成的，其暴露出rhPRG4的氨基酸核心的分子量(如图4中标记为L-N0的泳道内所 示）。该核心的预测分子量为151kDa，其通过此4-12%的SDS-PAGE而实验确认。仅用神经氨 酸苷酶消化对分子量有降低作用，说明糖基化对神经氨酸是不完全覆盖。用〇-糖苷酶DS(其 去除0-连接f3(l-3)GalNAc-Gal残基)和神经氨酸苷酶消化表明该批蛋白大致上30%的重量 被糖基化。仅用〇-糖苷酶消化可能仅在去除一些未覆盖的GalNAC-Gal残基时有作用。
[0102] 糖基化分析
[0103]为了进一步表征此蛋白，对来自重组润滑素和正常滑膜润滑素的0-聚糖进行了质 谱分析和比较。简言之，使用DEAE色谱从滑液分离了滑膜润滑素。在转移至PVDF膜之前，使 用3-8%三羟甲基氨基甲烷醋酸盐凝胶通过SDS-PAGE来分离重组和滑膜润滑素。继而通过 还原性β-消除随后清除而从所述润滑素斑点释放0-聚糖用于LC-MS/MS分析。在MS/MS分析 前0-聚糖通过多孔石墨化碳色谱来分离，其中是在线性捕获质谱上以负离子模式使用依赖 于数据的方法(LTQ(Thermo Scientific)) 〇
[0104]重组润滑素样品的分析仅鉴别出1型核心0-聚糖结构（图6)。展示所鉴别的聚糖的 提取的离子色谱在图7中示出。唾液酸化的结构，[M-H]_675,显示为两个主要的峰。它们是 相同的异构体，滞留时间21.4min的第二个峰是β-消除过程中创建的化学衍生物。鉴别出了 3个硫酸化结构（[M-H]-464)的异构体。还鉴别出了单硫酸化单唾液酸化结构的几个异构 体。二唾液酸化的结构的丰度很低且不能在色谱中观察到。对所鉴别的每种聚糖的比例的 估计在表1中示出(对于糖结构的关键，参见图6)。此分析组合了表1中每种结构的所有的异 构体、衍生物和加合物。
[0105]表1.在重组润滑素上所鉴别的每种聚糖的百分比。该数据包括表中所列的每种结 构的所有异构体、衍生物和加合物。
[0107]正常人类滑膜润滑素具有较大范围的聚糖延伸至2型核心结构中（图8)。这些结构 中最富集的在图9中示出（提取离子色谱上）。
[0108] 重组人润滑素的糖基化模式与天然人类糖蛋白有很大差异，这可以容易理解，例 如，从图7与图9的比较。在天然滑膜润滑素上，唾液酸化的1型核心结构是最富集的聚糖，但 是存在各种类型的显著量的2型核心糖基化，以及仅仅少量的硫酸化的多糖。在重组糖蛋白 上，唾液酸化的和未修饰的1型核心构成了聚糖的超过半数，而硫酸化的1型核心结构构成 所鉴别的〇-聚糖的大约三分之一，其中鉴别出了所有三种可能的异构体。
[0109] 重组人润滑素的物理化学性质 [0110] 类表面活性剂(两亲性)性质
[0111] rhPRG4的一种重要贡献是其通过物理化学吸附而涂敷生物和非生物表面的能力。 天然PRG4是表面活性的，并且掺入了由大的类粘液素结构域分隔的末端球状结构域。这些 可以在其结构中分为极性和非极性结构域。中心粘液素结构域(如人类滑液润滑素的表面 力仪器研究所显示的），可以折叠回其自身，表明在实现了此种取向时糖基化是朝外的。整 体而言，粘液素结构域变得比其N或C末端都更加亲水。其重要性通过了解糖基化的消化回 去除润滑能力而得以确认(Jay等，J Glycobiol 2001)。此种两性分子特性也存在于rhPRG4 中。这可以通过对脂和水交界面之间界面张力降低的评估来进行测量。
[0112] 在使用本发明的方法而设计用于测试重组人润滑素的表面活性剂性质的实验中， 在PBS溶液中存在浓度增加的rhPRG4(其由未稀释的、疏水的环己烷所覆盖）。将置于含有 rhPRG4的水亚相的Du NoUy环向上拉，并记录了该环突破交界面的临界张力(fi)。在 Attension Sigma 702ET张力计中对每个浓度收集5次测量。针对fi将rhPRG4浓度的剂量反 应曲线作图，参见图10A。如所示，随着含PBS的水亚相中rhPRG4浓度的提高，界面张力降低。 [0113]因为重组人润滑素溶液含有残留的非离子表面活性剂(Tween 20)，重复了该实验 以研究这是否是造成添加重组产物后所诱导的表面张力大幅下降的原因，首先仅使用各种 浓度的表面活性剂，继而使用很低浓度的本发明的rhPRG4。将微升量的表面活性剂和PRG4 添加至15mL的水亚相。结果显示于图10B和图10C中。如所示，仅用PRG4(图10C)降低表面张 力比仅用商业表面活性剂要好〇 . 1 % (图10B)。因而，含有0.1 % Tween和不含有Tween的 rhPRG4降低的PBS和环己烷的界面张力比仅用0.1 %的Tween更多（所有的都具有相同量的 添加的感兴趣溶液）。
[0114] 这些数据显示，即便是在很低的浓度，rhPRG4优先位于水脂交界面，降低界面张 力。此现象概括了在减少摩擦以及模拟天然润滑素行为时所需的表面结合相互作用。另外， 减少界面张力的活性可以用作rhPRG4生产的质量控制程序。
[0115] 润滑性质
[0116] 软骨润滑
[0117] 从骨骼成熟的牛后膝滑膜关节的髌股沟，准备了新鲜的软骨样品（n=16)用于摩 擦测试（如此前所述的）。简言之，从软骨区块收获了内核（半径= 6mm)和外环（外半径= 3.2mm以及内半径=1.5mm)，二者均具有中央孔(半径=0.5mm)使得流体可以泄压。在PBS中 于4°C将样品严格清洗过夜以去除关节表面的残余滑液，并通过测试润滑的存在而对其进 行了确认。继而将样品在具有蛋白酶抑制剂的中于-80 °C冷冻，解冻，再在roS中摇动过 夜以进一步清除表面处的任何残余PRG4。继而在第二天的测试前，将样品于4°C完全浸入大 约0.3ml的各个测试润滑剂(下文所述)过夜，并在下次测试润滑剂中温育前，于每次测试后 再用PBS清洗。
[0118] 使用了BoseElectroforce'、的测试仪器（ELF 3200，Eden Prairie,Minnesota)来 分析每种PRG4形式以及对照的界面润滑能力，其中使用已经确立的软骨-对-软骨摩擦测 试。简言之，将所有样品以0.002mm/s的恒定速率压至18 %的总软骨厚度，并允许其应力松 弛40分钟以使组织液泄压。继而将样品以已知的有效速度旋转以在泄压的软骨-软骨交界 面保持界面模式润滑(〇.3mm/s)( ±2运转(revolutions))。在留在预滑动的1200、120、12和 1.2秒的静止期之后，在每个随后的静止期之后旋转样品，+/-2运转。以相反的旋转方向重 复测试顺序，_/+2运转。
[0119] 两个测试顺序评估了 rhPRG4的软骨界面润滑能力（单独以及与HA组合）。在两个测 试顺序中，PBS都用作阴性对照润滑剂而牛滑液用作阳性对照润滑剂。rhPRG4和纯化的天然 牛PRG4都在PBS中以450yg/mL的浓度制备，而HA( 1 · 5MDA Lif ecore Biomedical，Chaska， 丽)也在1?S中以3 · 3 3mg/mL的生理浓度制备。润滑剂以推测的润滑能力次序（摩擦系数降 序）来进行了测试。在测试顺序1中，rhPRG4vs. nbPRG4，顺序为PBS、rhPRG4、nbPRG4、滑液(η =7);在顺序2 中，rhPRG4vs · rhPRG4+HA，顺序为PBS、rhPRG4、rhPRG4+HA、滑液(η = 4)。
[0120] 对于此前所描述的每个润滑剂，计算了两个摩擦系数;静态的(μ觀?,ΝμΚ从静止状 起始运动的阻力)和动态的施，Neq>)(稳定滑动的阻力）。结果在图11和12中示出。数据以 均值土 SEM给出。使用了 AN0VA来评估润滑剂的作用以及预滑动静止期作为μ縮、Neq和<μ5施， Neq>的重复因素，其中在1.2s的预滑动静止期对<μ5施，Neq>进行Tukey事后测试。用Systatl2 (Systat Software, Inc.，Richmond，CA)进行了统计学分析。
[0121] 如图11中所示，所测量的重组PRG4的润滑性质、动态摩擦系数，与天然牛PRG4稍低 的值之间没有统计学显著性。如图12中所示，与仅有rhPRG4相比，rhPRG4与HA组合改善了静 态（图12A)和动态（图12B)润滑性。所有的测定都在PBS中最高而在牛滑液中最低，且rh-PRG4与rhPRG4+HA为中等。rhPRG4+HA的混合溶液趋向于比仅有rhPRG4显著更低的摩擦系数 (p = 0.075)并且在统计学上与牛滑液类似(0.021 ±0.001，p = 0.20)。
[0122] 也尝试了使用2小时的透明质酸酶消化来确保从要用作轴承(bearings)的牛软骨 去除天然润滑素。透明质酸酶消化是要用于从软骨外植体的浅表层去除天然PRG4(P〈 0.050)。此种处理去除了表面PRG4而未显著影响关节软骨的机械特征。将rhPRG4应用于这 些表面并比较对BSF和PBS对照的摩擦反应，这显示出使用本发明的rhPRG4可以重建低COF。 图13显示经透明质酸酶处理的牛内髁软骨外植体(具有rhPRG4)的COF值，BSF和PBS作为居 间润滑剂。根据上文所述的方案依照前述润滑剂测试了软骨外植体。如所示，重组类人PRG4 重建了低C0F(rhPRG4N = 18 ;BSF N=6 ;PBS(N=8)。
[0123] 眼睛表面润滑
[0124] 具有3mm的巩膜的正常人类眼角膜得自Southern Alberta Lions Eye Bank。人类 眼睑从来自卡尔加里大学的遗体捐赠项目的新鲜尸体获得。这些组织的使用许可以及批准 从Health Research Ethics Board获得。将眼角膜(n = 6)储存在4°C的基于硫酸软骨素的 眼角膜储存介质(Optisol-GS)中并在两周内使用。眼睑(n = 6)被冷冻并在使用时解冻。
[0125] 通过3-8%的三羟甲基氨基甲烷醋酸盐NUPAGE十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电 泳评估所述rhPRG4种类的纯度为50%。对富集的rhPRG4制品的浓度进行了测定并调整为将 纯度水平纳入考量。
[0126] 将组织样品装载于具有轴向和旋转执行器、以及轴向载荷和扭矩传感器的Bose ELF3200上。通过向巩膜应用腈基丙烯酸酯粘合剂(强力胶），而将切片的眼角膜固定在半球 形硅橡胶塞(半径= 6mm)的末端。在眼角膜-塞装置周围安置硅橡胶管套，其用于保持住润 滑剂流体。继而将此装置附着至所述Bose ELF3200的旋转执行器，由此形成底部关节连接 表面。从模型]^MS材料（~0.4mm厚的UntrSylgard 184，Dow Corning,)或者人眼睑组织钻 出了外环(外半径=3.2_，内半径=1.5mm)，并粘合至外环支持物。继而将此外环支持物附 着至线性执行器，由此形成上部关节连接表面。
[0127] 在装载完样品之后，将0.3ml的测试润滑剂置于眼角膜上以形成润滑剂浴，并且用 测试润滑剂将关节连接表面平衡至少5分钟。将所述组织样品于三个人工确定的轴向位置 与相应的0.3±0.02、0.5±0.03、和0.7±0.03_勺轴向载荷接触，导致轴向压力范围在12.2 至28.5kPa(基于24.6mm 2的接触面积。一旦在给定轴向位置接触，所述样品在两个方向都以 4个不同的有效速度(veff = 30、10、l .0、0.3mm/s)进行4次运转，其中veff= ω · reff以及reff = 2/3[0-03-η3)/0-02-η2)]。在旋转期间于20Hz收集了轴向载荷以及力矩。每次运转之间 有12秒的保压时间。每个测试顺序(下文所述)包括了预处理步骤，其中所述组织在盐水浴 中进行所述的测试方案。
[0128] 为了确定rhPRG4制品在人类眼角膜-眼睑（测试1)和在人类眼角膜-聚二甲硅氧烷 (PDMS，测试2)的交界面处的界面润滑能力，使用了如下测试顺序:盐水中300yg/mL的PRG4， 盐水中300yg/mL的rhPRG4,接着盐水（Sensitive Eyes Saline Plus,Bausch&Lomb)〇
[0129] 为了评估测试润滑剂在该两个交界面处的效力，计算了静态和动态的摩擦系数。 如图14中所示，PRG4和PRG4,二者都显著地且类似地，在人类眼角膜-PDMS交界面处(参见图 14C和14D)和在眼角膜眼睑交界面处（图14A和14B)降低了摩擦。
【主权项】
1. 制备重组润滑素糖蛋白的方法，包括以下步骤： 在培养基中培养中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，所述中国仓鼠卵巢(CHO)细胞转染有人类 PRG4基因，并且其在足以产生润滑素糖蛋白的时间里和培养条件下表达所述人类PRG4基因 并对表达产物进行翻译后糖基化，其中所产生的润滑素糖蛋白包含至少30%重量的糖苷残 基，在培养基中浓度为至少〇. 4g/升，和 从所述培养基纯化润滑素糖蛋白。2. 权利要求1的方法，其中所述CHO细胞是包含编码人类PRG4基因的核酸的CHO-M细胞。3. 权利要求1或2的方法，其中所述CHO细胞转染有第一载体和第二载体，其中所述第一 载体包含编码染色质元件的核酸，而所述第二载体包含编码人类PRG4基因的核酸。4. 权利要求3的方法，其中所述染色质元件是边界元件、基质附着区、基因座控制区或 通用染色质开放元件。5. 权利要求4的方法，其中所述染色质元件是基质附着区。6. 权利要求1-5任一项的方法，其中在足以产生这样的润滑素糖蛋白的时间里和培养 条件下培养所述细胞，所述润滑素糖蛋白在培养基中浓度为至少〇. 5g/升。7. 权利要求1-5任一项的方法，其中在足以产生这样的润滑素糖蛋白的时间里和培养 条件下培养所述细胞，所述润滑素糖蛋白在培养基中浓度为至少〇. Sg/升。8. 权利要求1-5任一项的方法，其中在足以产生这样的润滑素糖蛋白的时间里和培养 条件下培养所述细胞，所述润滑素糖蛋白在培养基中浓度为至少1.0 g/升。9. 权利要求1-5任一项的方法，其中在足以产生这样的润滑素糖蛋白的时间里和培养 条件下培养所述细胞，所述润滑素糖蛋白在培养基中浓度为至少2. Og/升。10. 权利要求1-9任一项的方法，其中至少95%重量的所述润滑素糖蛋白的糖基化是1 型核心糖基化。11. 权利要求1-9任一项的方法，其中至少99%重量的所述润滑素糖蛋白的糖基化是1 型核心糖基化。12. 权利要求1-11任一项的方法，其中与天然人类润滑素相比，所述糖苷残基富含硫酸 化的糖侧链。13. 权利要求1-12任一项的方法，其中所述润滑素糖蛋白包含这样的多聚体蛋白，其所 产生的在软骨对软骨摩擦测试中测量的静态摩擦系数不超过纯化的天然牛润滑素静态摩 擦系数的150 %。14. 权利要求1-12任一项的方法，其中所述润滑素糖蛋白包含这样的多聚体蛋白，其所 产生的在软骨对软骨摩擦测试中测量的静态摩擦系数不超过纯化的天然牛润滑素静态摩 擦系数的120 %。15. 权利要求1-12任一项的方法，其中所述润滑素糖蛋白包含这样的多聚体蛋白，其所 产生的在软骨对软骨摩擦测试中测量的静态摩擦系数不超过纯化的天然牛润滑素静态摩 擦系数的110 %。16. 权利要求1-15任一项的方法，其中所述润滑素糖蛋白包含从所述培养基中共纯化 的并且混杂有多聚体润滑素种类的单体润滑素种类。17. 权利要求13-15任一项的方法，其中所述润滑素糖蛋白包含二聚体润滑素种类。18. 权利要求1-17任一项的方法，其中所述润滑素糖蛋白包含至少5个经二硫键或者经 非共价连结的个体糖基化氨基酸链，并且具有至少1200kDa的分子量。19. 权利要求1-18任一项的方法，其中所述细胞在至少10、50、或100升的培养基中培 养。20. 权利要求1-19任一项的方法，其中所述润滑素糖蛋白包含至少35 %重量的糖苷残 基。21. 由权利要求1-20任一项的方法所生产的润滑素糖蛋白。22. 物质的组合物，其包含： 在宿主细胞培养中从人类PRG4基因表达的重组多聚体润滑素糖蛋白，其包含至少30% 重量的糖苷残基，并且其所产生的在软骨对软骨摩擦测试中测量的动态摩擦系数不超过纯 化的天然牛润滑素的动态摩擦系数的150%。23. 权利要求22的组合物，其中所述润滑素糖蛋白特征在于，其所产生的在软骨对软骨 摩擦测试中测量的动态摩擦系数不超过纯化的天然牛润滑素的动态摩擦系数的120%。24. 权利要求22的组合物，其中所述润滑素糖蛋白特征在于，其所产生的在软骨对软骨 摩擦测试中测量的动态摩擦系数不超过纯化的天然牛润滑素的动态摩擦系数的110%。25. 权利要求22-24任一项的组合物，其中所述润滑素糖蛋白包含至少35%重量的糖苷 残基。26. 权利要求22-24任一项的组合物，其中所述润滑素糖蛋白包含至少40 %重量的糖苷 残基。27. 权利要求22-26任一项的组合物，其中所述润滑素糖蛋白的至少99%重量的糖基化 为1型核心糖基化。28. 权利要求22-27任一项的组合物，其中与天然人类润滑素相比，所述糖苷残基富含 硫酸化的糖侧链。29. 权利要求22-28任一项的组合物，还包含混杂有多聚体润滑素种类的单体润滑素种 类。30. 权利要求22-29任一项的组合物，包含二聚体润滑素种类。31. 权利要求22-30任一项的组合物，其包含这样的润滑素种类，所述润滑素种类包含 至少5个经二硫键或者经非共价连结的个体糖基化氨基酸链，具有至少1200kDa的分子量。32. 权利要求22-31任一项的组合物，还包含与所述润滑素糖蛋白混杂的透明质酸或其 盐。33. 权利要求22-32任一项的组合物，用于制备药物，所述药物用于通过粘弹性物补充 疗法治疗滑膜关节。34. 权利要求22-32任一项的组合物，用于制备局部应用于组织表面的药物。35. 权利要求22-32任一项的组合物，用于制备治疗干眼病的药物。36. 权利要求22-32任一项的组合物，用于制备药物，所述药物用于在手术期间应用于 体表以抑制随后形成粘连或纤维性结缔组织。37. 权利要求22-32任一项的组合物，用于制备药物，所述药物用于全身性注射以抑制 细胞-细胞粘连或者在脉管内的运动。38. 包含溶液的组合物，所述溶液包含100g的人类润滑素，其中所述润滑素包含糖基 化，所述糖基化的至少99 %重量为1型核心糖基化。39. 权利要求38的组合物，其中所述人类润滑素是重组人类润滑素。40. 权利要求38或39的组合物，其中所述溶液中润滑素的浓度为至少0.5g/L。
【文档编号】C07K14/47GK105899527SQ201480065482
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年10月22日
【发明人】T·施密特, G·D·杰伊
【申请人】卢布里斯有限责任公司