前列腺癌特异性pap-gm-csf-il-6基因重组融合蛋白及其制备方法
【专利说明】前列腺癌特异性PAP-GM-CSF-1L-6基因重组融合蛋白及其制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种基因重组蛋白的制备，特别涉及前列腺癌特异性PAP-GM-CSF-1L-6基因重组融合蛋白的制备方法。
【背景技术】
[0002]前列腺癌在西方国家男性高发的恶性肿瘤中，其死亡率高居癌症死亡率的第二位，仅次于肺癌。自20世纪90年代起，前列腺癌的实验研究在我国受到了重视并迅速开展，然而晚期前列腺癌和雄激素非依赖阶段的列腺癌，对其相关的发病机制知之甚少，尚无有效的治疗方法，当前的研究仍然处于摸索阶段，还需要通过大量的体内外实验进一步深入的探索。2008年12月，美国FDA正式批准DC诱导的肿瘤免疫治疗应用于临床，目前应用的肿瘤抗原有多种，包括肿瘤细胞裂解物、肿瘤相关全抗原、蛋白多肽、蛋白单肽等，现有的DC疫苗制备方法中大多数采用肿瘤组织块或癌相关蛋白作为靶向物质，负载效率低，靶向性较低，特异性较差。
[0003]前列腺特异性酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase，PAP)是酸性磷酸酶同工酶，由前列腺上皮细胞溶酶体产生，是一种由两个相同亚单位组成的糖蛋白，其分子量为100kD。在前列腺癌时，血清中PAP水平明显升高，且其升高程度与前列腺癌的病情基本呈平行关系。当病情好转，PAP水平降低，常提示癌症有复发、转移及预后不良。研究还发现，应用抗PAP抗体，能够有效检测出循环血中游离的癌细胞(Circulating tumor cells, CTC)，并且对腹腔广泛转移和种植所致腹水，具有良好的疗效。因而，PAP可作为前列腺肿瘤极好的靶标和抗原，应用于肿瘤检测及肿瘤特异性细胞免疫治疗。
[0004]粒细胞-巨卩蜜细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor, GM-CSF)是一种多小性的细胞因子，可促进DC等APCs的分化、成熟和活化，也可增加DC表面的主要组织相容复合物Π，促进肿瘤抗原的有效递呈。GM-CSF对于红细胞和巨核细胞的增值和分化也起到促进作用，在DC的培养过程中，GM-CSF是不可或缺的细胞因子，促进DC的活化能力，从而增强DC疫苗的抗原提成能力，从而促进抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(Cytotoxicity T lymphocytes, CTL)的杀伤功能。
[0005]白细胞介素-6(Interluekin-6，IL-6)，是一种具有多功能的生物活性多肤物质，主要来源于单核巨噬细胞，部分来自于T、B淋巴细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞，某些肿瘤细胞也能产生IL-6<JL-6在促进机体免疫应答、增强骨髓造血、提高自身免疫和机体防御能力等方面均具有重要作用。它的作用主要体现在ThZ型免疫反应中，对多种细胞的增殖都具有促进作用，如刺激杂交瘤、浆细胞瘤和骨髓瘤生长;刺激T细胞生长;促进EBV转化的B细胞生长;促进造血干细胞生长及刺激肾小球系膜生长等。它对髓样白血病细胞系的生长具有抑制作用；还能抑制黑素瘤、乳腺癌细胞等的生长增殖。并可作为某些中性细胞的催化剂，与其他细胞因子协同作用从而促进骨髓干细胞的成熟。因此IL-6在人类疾病的治疗上，常用于治疗由放疗、化疗所引起的血小板减少症、癌症等疾病或者作为疫苗的强效佐剂应用于临床试验。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于应用基因重组技术，将前列腺癌特异性PAP、GM-CSF及IL-6重组偶联，制备成高纯度的PAP-GM-CSF-1L-6融合蛋白，为细胞免疫治疗提供一种能促进DC疫苗抗原递呈功能的前列腺癌特异性重组蛋白抗原，从而显著提高细胞免疫治疗的临床疗效。
[0007]本发明提供一种前列腺癌特异性PAP-GM-CSF-1L-6基因重组融合蛋白，三种蛋白的氨基酸序列均为已知序列。
[0008]本发明所采用的技术方案是:提供前列腺癌特异性PAP-GM-CSF-1L-6基因重组融合蛋白的制备方法，所述的重组蛋白的连接顺序为PAP-1 inkerl-GM-CSF-1 inker2-1L_6，所述方法步骤如下:
(1)引物的设计与合成；
(2)基因扩增和测序；
(3 )重组载体pcDNA3.1-PAP-GM-CSF-1L-6 的构建；
(4)重组载体pcDNA3.1-PAP-GM-CSF-1L-6 的筛选、鉴定；
(5)重组质粒pcDNA3.1-PAP-GM-CSF-1L-6 转染 HEK293 细胞株；
(6)重组PAP-GM-CSF-1L-6融合蛋白在HEK293细胞株内表达；
(7)重组PAP-GM-CSF-1L-6融合蛋白的纯化；
(8 )纯化的PAP-GM-CSF-1L-6融合蛋白渗透浓缩。
[0009]在所述(I)引物的设计与合成，如下所述:
PAP上游引物序列为:
57 CTAGCTAGCCGGCTCTCCTCAACATGAG 37 (见序列表 I);
下游引物序列为:
57 GCCGCTCGAGATCTGTACTGTCCTCAGT 37 (见序列表2);
其上下游引物分别引入了限制性内切酶NheI和XhoI的酶切位点。
[0010]Linkerl的氨基酸序列(见序列表3);
GM-CSF的氨基酸序列(见序列表4);
其GM-CSF氨基酸序列前后加入限制性内切酶Xho I和BamHI酶切位点。
[0011]Linker2的氨基酸序列(见学列表5);
IL-6上游引物序列为:
S7AtatggatccggtggctctggatctccagtacccccaggagS7 (见序列表 6)；
下游引物序列为:
57 TGGGGTACCCATTTGCCGAAGAGCCCTCA37 (见序列表7)；
其上下游引物分别引入了限制性内切酶BamHI和KpnI的酶切位点。
[0012]在所述(2)基因扩增和测序的步骤，从前列腺癌细胞株PC-3M中提取RNA，然后反转ScDNA，以cDNA为模板，PCR扩增PAP基因，切胶回收目的片段，将该片段连接至T载体，转化DH5a，PCR扩增鉴定阳性斑，提取阳性斑的质粒并测序。GM-CSF序列为生工生物工程(上海)股份有限公司合成基因。人外周血单核细胞中提取RNA，反转为cDNA，以cDNA为模板，PCR扩增IL-6基因，切胶回收目的片段，将该片段连接至T载体，转化DH5a，PCR扩增鉴定阳性斑，提取阳性斑的质粒并测序。
[0013]在所述(3)重组载体pcDNA3.1-PAP-GM-CSF-1L-6的构建的方法，用限制性内切酶NheI和XhoI酶切测序正确、连有PAP的T载体，切胶回收PAP片段；用限制性内切酶BamHI和kpnl酶切测序正确、连有IL-6的T载体，切胶回收IL-6片段;载体pcDNA3.1用限制性内切酶NheI和kpnl，切胶回收载体;然后把PAP片段、GM-CSF片段、IL-6片段以及载体用T4连接酶进行连接。
[0014]在所述(4)重组载体pcDNA3.1-PAP-GM-CSF-1L-6的筛选、鉴定步骤中，CaCl2法制备大肠杆菌感受态DH5a，然后将以上连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a，PCR方法扩增筛选阳性重组载体，对阳性斑进行质粒提取，并进行酶切鉴定。
[0015]在所述(5)重组质粒pcDNA3.1-PAP-GM-CSF-1L-6转染HEK293细胞株中方法，将阳性重组载体和Lipofectamine?2000(Invitrogen)加入HEK293细胞中，37°C，5%C02培养箱培养。
[0016]在所述(6)重组PAP-GM-CSF-1L-6融合蛋白在HEK293细胞株内表达，将重组载体转入HEK293细胞内培养48h，收集细胞加入蛋白抽提试剂，冰上孵育20分钟，让细胞充分裂解，于4°C，17000g离心lOmin，转移上清至新管中。
[0017]在所述(7)重组PAP-GM-CSF-1L-6融合蛋白的纯化方法，将收集的细胞全蛋白用镍柱纯化。Ni Sepharose? 6 Fast Flow上柱，用Wash buffer洗柱5次，用Elut1n buffer(50mM PBS PH 8.0，0.3Μ NaCl，150mM咪唑)洗脱目的蛋白。
[0018]在所述纯化(8)PAP-GM-CSF-1L-6融合蛋白渗透浓缩步骤中，将洗脱下的、纯化的融合蛋白溶液装入已经处理好的透析袋，放入透析缓冲液(50mM PBS PH 8.0,0.15M NaCl)中4°C过夜，以去除纯化蛋白中含有的咪唑。次日，将透析后的蛋白过浓缩柱进行浓缩，4°C，4000g离心lOmin，测量浓缩后的融合蛋白的浓度。
[0019]本发明PAP-GM-CSF-1L-6重组蛋白，进行了western blot鉴定实验，鉴定结果的准确性，方法如下:
分别取重组蛋白20μ1，加入等体积的2 X