一种基于丝素蛋白的三维细胞支架的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于丝素蛋白的三维细胞支架的制备方法，所述三维细胞支架是一种内部含有均一的孔隙的丝素蛋白网络结构；其使用微流控装置制备尺寸均一的单分散微球，然后利用单分散微球的自组装功能制备蛋白质结构的模板，再将丝素蛋白溶液灌注到模板中，冷冻干燥后去除模板得到这种内部具有均一孔隙的网络状丝素蛋白三维细胞支架。本发明提供的三维细胞支架构建方法，操作简单，成本低廉，制备的三维细胞支架具有优异的机械性能，生物相容性，生物可降解性。
【专利说明】
一种基于丝素蛋白的三维细胞支架的制备方法
技术领域
[0001]本发明属于三维细胞支架材料研究技术领域，具体涉及一种基于丝素蛋白的三维细胞支架的制备方法。
【背景技术】
[0002]在再生、替换、维持或修复受损组织的功能方面，寻找和开发合适的生物是组织工程中一种非常有前景的方法，而这其中所涉及到的各种课题中，细胞支架的研究则具有重要的意义。
[0003]细胞支架的结构和性质已经在材料科学和生物医学工程背景下得到广泛的研究，对于支架的要求包括:(I)用于制备细胞支架的材料必须具有生物相容行和生物可降解性，同时对于连同接种的细胞存在阳性反应;(2)该细胞支架应该包括空腔的网络结构，并且最后能够在三维上形成相互连接的体系；(3)该细胞支架应该具有一定的机械性能以适应特定的应用，包括在生成软骨、骨头、人造血管等方面的应用要求。
[0004]为了得到一个优良的三维细胞支架，研究者们提出了很多的方法，包括冷冻干燥、高温高压、相分离、静电纺丝等。然而大多数的方法都有一定的局限性，比如静电纺丝得到的材料难以扩展到真正的三维支架上，其他的方法还有尺寸不规则，空腔不均一，连通性差等诸多缺点。
[0005]细胞支架的孔径和结构关系到细胞的粘附、迀移和分布，以及营养物质和代谢产物的交换，所以其对于细胞的培养具有非常重要的意义。目前针对支架中空腔的直径和结构，研究者们做出了大量的努力和尝试，然而空腔的均一性和空腔间的相互连通性还是亟待解决的难点。基于这一问题，反蛋白石结构被认为是一种理想的模型，因为反蛋白石结构具有非常一致的空腔，并且内部具有非常规则的三维网络结构。尽管已经有一些基于反蛋白石结构的三维细胞支架被发明出来，但是他们所使用的材料都不是具有生物可降解性的，这就限制了其在临床中的应用。
[0006]蚕丝是最早被利用的天然蛋白质之一，人类利用蚕丝作为织物的历史已有五千多年.近年来蚕丝因其优异的力学性能和良好的生物相容性使它在生物医药等高新技术领域日益受到重视，蚕丝由两种蛋白组成，内层为丝素蛋白，外层被丝胶蛋白包覆。其中丝素蛋白含量约为70%-80%。丝素蛋白含有18种氨基酸，其中甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸的含量约占87 %，多以-甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸-丝氨酸-的多肽形式存在。丝素蛋白具有两性荷电的特殊性能、无毒、良好的人体亲和性、生物降解性和生物相容性等优良性能，可制备成多种形态，如多孔状，膜状和管状等，是一种开发医用材料比较理想的素材。
[0007]作为生物医药材料，其生物降解性是一项很重要的性能指标。例如，组织工程中的支架材料，不仅要求生物相容性好，更希望其降解速度与组织的再长速度相匹配，方可达到良好的修复效果。因此，如何能够控制丝素蛋白材料在体内的降解速度是许多研究者关心的问题。由于天然蚕丝在植入人体内60 d以后仍保留50%以上的力学性能，根据通常人们对“可降解”材料的定义，蚕丝不属于可生物降解的材料。但随后的研究证明，蚕丝作为一种蛋白质，是可以被某些酶降解，并且植入人体内也会最终被吸收，只是所需要的时间比一般意义上的可降解材料要长。影响材料降解性能的因素有很多，如材料的结构、形态、降解条件、生理化学环境等，只有对降解的过程、机理、影响因素等有充分的了解，才能达到有效控制材料降解行为和降解速度的目的。
【发明内容】
[0008]本发明目的在于提供了一种基于丝素蛋白的三维细胞支架的制备方法，解决目前的技术难以实现具有一致直径空腔的网络结构三维细胞支架，同时满足对细胞支架在生物相容性和生物可降解性方面的要求。
[0009]为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是:
一种基于丝素蛋白的三维细胞支架的制备方法，所述三维细胞支架是一种内部含有均一孔隙的丝素蛋白网络结构;其特征在于所述方法包括以下步骤:
(I)丝素蛋白溶液的提取:
对生蚕茧进行清洗，利用盐析、透析、浓缩等方法从生蚕茧中提取从3%到15%不同浓度梯度的丝素蛋白水溶液。
[0010](2)微米级单分散性微球的制备步骤:
选择合适的材料分别作为微流控过程中的连续相和非连续相，利用微流控装置(图1a所示)制备粒径可控的单分散微球。对制备的单分散微球进行清洗并收集。
[0011 ] (3)单分散微球的模板制备和复制:
利用化学气相沉积法，将单分散的微球自然沉降，经缓慢挥发溶液等步骤(2)中制备的单分散微球自组装成蛋白石结构模板，再将步骤(I)中提取的丝素蛋白溶液灌注到蛋白石结构的模板中，最后通过超声凝胶或冷冻干燥等方式将其固化。
[0012](4)三维细胞支架的收集处理:
将固化后的丝素蛋白收集并清洗，去除模板中的单分散微球，并最终形成内部含相通空腔的网络状三维结构支架。
[0013]优选的，所述方法步骤(2)中微流控装置非连续相包括二氧化硅、聚苯乙烯、聚己内酯、氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、苯、二氯甲烷中的一种或两种以上的材料。
[0014]优选的，所述方法步骤(2)中微流控装置连续相包括甲基硅油、正十六烷、聚乙烯醇中的一种或两种以上的材料。
[0015]优选的，所述方法步骤(4)中去除模板中单分散微球的去除剂选自氢氟酸、氢氧化钠、丙酮、正己烷或二氯甲烷。
[0016]优选的，所述方法步骤(I)中丝素蛋白溶液浓度在3%?15%之间。
[0017]优选的，所述方法中步骤(2)中单分散性微球粒径在30μπι-300μπι之间。
[0018]本发明所述的三维细胞支架相比较于其他材料，优点在于将在内部具有尺寸一致的空腔，空腔的直径在30-300μπι之间可控，适宜不同类型的细胞的培养。同时空腔之间相互连通形成网络状结构，能够有助于细胞在培养过程中的粘附、迀移、已经营养物质和代谢产物的运输。
[0019]本发明所述的三维细胞支架基于丝素蛋白材料，能够具有良好的机械性能，在应用与生物体中能够维持一定的稳定性，并且在具有优异的生物相容性和生物可降解性，实用性非常广泛。其具体制备方法包括以下步骤:
①丝素蛋白溶液的提取:
对生蚕茧进行清洗，通过加热煮沸去除丝胶。然后利用LiBr (0.9-1.1 mol/L)的盐溶液将丝素进行溶解，装入透析袋中于去离子水中透析、透析之后得到的溶液需要去除杂质，然后根据不同的需要浓缩成从3%到15%的不同浓度的丝素蛋白水溶液。
[0020]②微米级单分散性微球的制备步骤:
选择合适的材料分别作为微流控过程中的连续相和非连续相，连续相和非连续性分别由油相或者水相构成。这样在微流控装置中不同分散相在交汇是形成剪切力，连续相将非连续相切割成尺寸均一的乳液。利用自制微流控芯片及装置的尺寸均一的乳液在经过固化可以形成微球，通过精确的计算，乳液在固化成微球后直径可以按照需要控制在30-300μπι之间的单分散性微球。对制备的单分散微球进行清洗并收集。其中所述的非连续相包括二氧化硅、聚苯乙烯、聚己内酯、氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、苯、二氯甲烷中的一种或两种以上的材料;所述的连续相包括甲基硅油、正十六烷、聚乙烯醇中的一种或两种以上的材料。[0021 ]③单分散微球的模板制备和复制:
利用化学气相沉积法等将步骤②中制备的单分散微球自组装成蛋白石结构模板，再将步骤①中提取的丝素蛋白溶液灌注到蛋白石结构的模板中，最后通过超声凝胶或冷冻干燥等方式将丝素蛋白成形。
[0022]④三维细胞支架的收集处理:
将成形后的丝素蛋白收集并清洗，去除模板中的单分散微球，并最终形成内部含相通空腔的网络状三维结构支架。去除模板中单分散微球的去除剂选自氢氟酸、氢氧化钠、丙酮、正己烷或二氯甲烷。
【附图说明】
[0023]图1.一种基于丝素蛋白的三维细胞支架的制备方法示意图(a)和实物图(b):1)利用微流控装置制备摸版微球，2)将微球自组装形成蛋白石结构，3)将丝素蛋白填充到蛋白石结构中，4)将摸版中的微球去除，得到反蛋白石结构三维细胞支架。
[0024]具体实施方法
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
[0025]实施例1一种基于丝素蛋白的三维细胞支架制备方法
(1)单分散聚苯乙烯乳液的制备:
我们制备微米级聚苯乙烯(PS，Sigma)乳液的微流控装置(图1a所示)内相选择的是PS/苯/二氯乙烷，质量体积比为0.8 g: 10 mL: 10 mL.外相为聚乙烯醇(PVA，Sigma)的水溶液，质量体积比为5%。利用稳定的液体流速(内向流速0.5 mL/h )和剪切力(外向流速5 mL/h)，PVA的水相将PS的油相切成直径一致的水包油单乳液结构，然后乳液通过收集管进入装满PVA水相的收集池中。作为表面活性剂，PVA的存在可以有效的防止在收集的过程中乳液相互融合的现象；
(2)聚苯乙烯乳液的固化: 将制得的乳液滴转移至旋转蒸发仪的烧瓶上，从室温开始，每5分钟升高5°C，直至600C，旋转速度控制为40 rpm;温度到达60°C后，升温速度降为每30分钟2°C，至70°C后停止升温;温度超过64°C后，转速增至SOrpm;停止升温后I小时检查是否固化。将固化的PS微米球用超纯水反复清洗，60 0C烘箱干燥；
(3)复制并去除模板微球得到细胞支架
将聚苯乙烯微球置于离心管底部，加入纯水后在60°C烘箱中干燥，可以在离心管底部得到规则排列的聚苯乙烯模板。将丝素蛋白溶液(15%)加入其中并进行冷冻干燥，即得到成形后的细胞支架，最后使用丙酮去除聚苯乙烯；
所述的丝素蛋白溶液由如下步骤制得:
对生蚕茧进行清洗，通过加热煮沸去除丝胶。然后利用LiBr (0.9-1.1 mol/L)的盐溶液将丝素进行溶解，装入透析袋中于去离子水中透析、透析之后得到的溶液需要去除杂质，然后根据不同的需要浓缩成从3%到15%的不同浓度的丝素蛋白水溶液。
实施例2 —种基于丝素蛋白的三维细胞支架制备方法
(1)单分散聚己内酯(PCL)乳液的制备
我们制备微米级PCL乳液的微流控装置内相选择的是PCL/二氯甲烷，PCL的质量分数为5%wt。外相为PVA的水溶液，质量体积比为5%。利用稳定的液体流速(内向流速0.8 mL/h)和剪切力(外向流速8 mL/h)，PVA的水相将PCL的油相切成直径一致的水包油单乳液结构，然后乳液通过收集管进入装满PVA水相的收集池中。作为表面活性剂，PVA的存在可以有效的防止在收集的过程中乳液相互融合的现象；
(2)PCL乳液滴的固化
使用I OOml装满PVA溶液的蓝口瓶对PCL进行收集，然后在通风橱中并保持30 V恒温加热过夜，使二氯甲烷能够充分挥发，最后将固化的PCL溶液用大量超纯水清洗，即可得到PCL微球；
(3)复制并去除模板微球得到细胞支架
将聚己内酯微球置于离心管底部，加入纯水后在摇床上以80rpm振荡过夜，随着水分的挥发可以在离心管底部得到规则排列的聚己内脂模板，然后将其在50°C烘箱中加入lh，出去水分的同时使得聚己内酯模板固定下来。最后将丝素蛋白溶液加入其中并进行冷冻干燥，即得到成形后的细胞支架，最后使用二氯甲烷去除聚己内酯，然后在通风橱中让二氯甲烷充分挥发得到所要的细胞支架。
【主权项】
1.一种基于丝素蛋白的三维细胞支架的制备方法，其特征在于所述方法按以下步骤实现: (1)丝素蛋白溶液的提取: 对生蚕茧进行清洗，利用盐析、透析、浓缩，从生蚕茧中提取从3wt%-15wt%的丝素蛋白水溶液； (2)微米级单分散性微球的制备步骤: 利用微流控装置、非连续相和连续相制备粒径可控的单分散微球，对制备的单分散微球进行清洗并收集； (3)单分散微球的模板制备和复制: 利用化学气相沉积法将步骤(2)中制备的单分散微球自组装成蛋白石结构模板，再将步骤(I)中提取的丝素蛋白溶液灌注到蛋白石结构的模板中，最后通过超声凝胶或冷冻干燥将其固化； (4)三维细胞支架的收集处理: 将固化后的丝素蛋白收集并清洗，利用去除剂去除模板中的单分散微球，并最终形成内部含相通空腔的网络状三维细胞支架。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法步骤(2)中非连续相为二氧化硅、聚苯乙烯、聚己内酯、氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、苯、二氯甲烷中的一种或两种以上的材料。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法步骤(2)中微流控装置连续相为甲基硅油、正十六烷、聚乙烯醇中的一种或两种以上的材料。4.据据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法步骤(4)中去除模板中单分散微球的去除剂为氢氟酸、氢氧化钠、丙酮、正己烷或二氯甲烷。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中步骤(2)中单分散性微球粒径在30μηι-300μηι 之间。
【文档编号】A61L27/56GK105879113SQ201610438113
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月17日
【发明人】赵远锦, 付繁繁, 陈卓玥, 汤栋梁, 顾忠泽
【申请人】东南大学