三维石墨烯-细胞因子复合体系、其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种三维石墨烯?细胞因子复合体系、其制备方法及应用。该复合体系包括三维石墨烯基体以及化学修饰于该基体上的细胞因子；其制备方法包括：将三维石墨烯材料以混合强酸溶液氧化处理后，再将细胞因子通过化学偶联方法修饰到三维石墨烯表面，即得三维石墨烯?细胞因子复合体系。本发明三维石墨烯?细胞因子复合体系的制备工艺简单、易于操作且可控性好，同时既保持了三维多孔立体结构，又提高了细胞因子的负载率，具有促进神经干细胞生长、增殖和分化的特点，还可实现生物学上的活性分子的缓慢释放。
【专利说明】
三维石墨烯-细胞因子复合体系、其制备方法和应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种神经干细胞培养体系，特别是三维石墨烯-细胞因子复合体系及其制备方法和应用。【背景技术】
[0002]神经系统损伤或病变，是当前严重危害人类健康的疾病之一。神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的发现是神经系统疾病治疗的一个里程碑，近年来已成为治疗神经退行性疾病和中枢神经系统损伤的热点(Brain Research, 2006, 1091:258-264)。由于神经干细胞具有自我更新、多分化潜能、能诱导分化成神经元，这使得其能作为优良的种子细胞替代神经损伤或病变中丢失的细胞，以促进神经再生及修复(Nat Neurosci，1998, 1:290-295)。 但神经系统疾病的治疗需要有大量的神经元，因此如何得到大量的神经干细胞、并控制其定向分化为神经元显得极其重要。
[0003]石墨烯具有优良的物理化学性质和良好的生物相容性，它能够支持神经干细胞很好地迀移，形成较完善的功能化神经网络(B1materials，2013, 34:6402-6411)， 也能促进神经干细胞向神经元细胞和星形胶质细胞分化，尤其是向神经元分化(Sci Rep,2013,3:1604)〇[〇〇〇4]细胞因子是免疫细胞产生的一大类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽，其成员包括白细胞介素(IL)、干扰素(IFN)、转化生长因子家族(TGF-0)、生长因子如表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-l)等。神经营养因子是一类特殊的蛋白质，它对神经元的发育、存活和凋亡起着至关重要的作用，其成员包括神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子3(NT-3)、神经营养因子4(NT-4)等。以上这些蛋白质是支持神经元生长和发展的重要因子，是治疗神经损伤等疾病的潜在药物标靶。
[0005]但现有的技术基本都是单方面从材料属性上或从培养基配方上分析神经干细胞培养情况，或者只是将细胞因子与材料结合使用分析其对神经干细胞的培养情况，这些材料有包括石墨烯，这些细胞因子也有包括前述因子。但目前仍未有将细胞因子先修饰到石墨烯材料上，即将石墨烯和细胞因子组合成一个复合体系，然后来分析其对神经干细胞的增殖和分化情况。
【发明内容】
[0006]本发明的主要目的在于提供一种三维石墨烯-细胞因子复合体系及其制备方法， 以克服现有技术中的不足。
[0007]为实现前述发明目的，本发明采用了如下技术方案:
[0008]—种三维石墨烯-细胞因子复合体系，包括三维石墨烯基体以及连接在所述基体上的细胞因子，所述基体具有多孔结构，其中孔的孔径为50?500 ym、孔隙率多95%。
[0009]进一步的，所述细胞因子包括白细胞介素(IL)，干扰素(IFN)，转化生长因子-0家族(TGF-0)，生长因子如表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-l)等，神经营养因子如神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子3(NT-3)和神经营养因子4(NT-4)等。
[0010]进一步的，所述细胞因子系通过化学修饰方式结合在所述基体上。
[0011]所述三维石墨烯-细胞因子复合体系的制备方法包括:将三维石墨烯材料在混合强酸溶液中氧化处理后，在三维石墨烯材料表面通过化学偶联方法修饰偶联基团，以及通过所述偶联基团时细胞因子结合到三维石墨烯材料上，形成所述三维石墨烯-细胞因子复合体系。
[0012]进一步的，该制备方法包括:将三维石墨烯材料在混合强酸溶液中浸泡2h以上， 完成对三维石墨烯材料的氧化处理，其中所述混合强酸采用1^03和112304的混合溶液，优选的，所述混合强酸包含体积比为1:3-5的HNOjP H2S04。
[0013]进一步的，该制备方法包括:将经氧化处理后的三维石墨烯材料清洗后，以含有浓度在50mM以上的EDC和浓度在50mM以上的NHS溶液浸渍30min以上，从而在三维石墨烯材料表面修饰上偶联基团。
[0014]进一步的，该制备方法包括:将修饰有偶联基团的二维石墨稀材料与浓度为 20ng/mL?10mg/mL的细胞因子溶液反应2h以上，形成所述三维石墨稀-细胞因子复合体系。
[0015]所述三维石墨烯-细胞因子复合体系在培养神经干细胞中的应用。
[0016]前述三维石墨烯材料可利用业界已知的多种途径获取，特别是可以通过CVD方式制备。
[0017]作为较为具体的实施方案之一，该制备方法可以包括如下步骤:
[0018](a)石墨烯预处理:用体积比为1:3的HNOjP 112304的混合溶液处理三维石墨烯材料，处理时间为2h以上，之后清洗、干燥后密封保存备用；
[0019](b)向步骤a处理过的石墨烯加入浓度均为50mM的EDC和NHS试剂，室温条件下反应30min，之后清洗干净，密封保存备用；
[0020](C)向步骤b所得的混合物中加入不同浓度的脑源性神经营养因子BDNF，37°C条件下孵育过夜，之后清洗干净，即得三维石墨烯-BDNF复合体系。
[0021]进一步的，在一应用方案之中，可于该复合体系中培养神经干细胞，观察细胞的增殖或分化情况。
[0022]例如，一种神经干细胞的培养方法，包括:提供所述的三维石墨烯-细胞因子复合体系，以及以所述三维石墨烯-细胞因子复合体系作为培养基培养神经干细胞，传代2?10次。
[0023]更为具体的，该培养方法可以包括:至少以多聚鸟氨酸和/或层粘连蛋白孵育所述三维石墨烯-细胞因子复合体系内的小孔，并在所述小孔内接种神经干细胞，接种密度为1万个/孔以上，传代2?10次，并使用包含有B27、P/S、表皮生长因子EGF和碱性成纤维生长因子bFGF中一种或两种以上的培养基，培养3天以上。
[0024]该神经干细胞(neural stem cells，NSCs)可来自于初生1_2天小鼠的海马神经J L 〇
[0025]与现有技术相比，本发明的优点至少在于:该三维石墨烯_细胞因子复合体系的制备工艺简单、易于操作且可控性好，同时既保持了三维多孔立体结构，又提高了细胞因子的负载率，可有效促进神经干细胞生长、增殖和分化，还可实现生物学上的活性分子的缓慢释放。【附图说明】
[0026]图1为实施例1中三维石墨烯的扫描电子显微镜(SEM)照片；
[0027]图2为实施例1中三维石墨烯经氧化试剂处理后所得的拉曼图谱；
[0028]图3为实施例1中BDNF化学修饰与物理吸附于三维石墨烯表面的吸附量对比图；
[0029]图4为实施例1中BDNF蛋白修饰在三维石墨烯表面的X射线光电子能谱图；
[0030]图5为实施例1中神经干细胞在三维石墨烯-BDNF复合体系中增殖情况的图谱；
[0031]图6为实施例2中神经干细胞在三维石墨烯-NGF复合体系中增殖情况的图谱。【具体实施方式】
[0032]下面结合附图和若干实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0033]实施例1:
[0034]将CVD法制备的三维石墨烯泡沫(孔径为50?500 y m、孔隙率彡95 %， 参考 Three-dimens1nal flexible and conductive interconnected graphene networks grown by chemical vapour deposit1n.Nat Mater.2011 ；advance online publicat1n.)完全浸泡于HN03:H2S04= 1:3的混合溶液中2h以上，之后用去离子水反复清洗至pH呈中性，置于烘箱中烘干；将石墨烯置入细胞培养皿小孔中并粘胶，等胶水干燥后，先后用清水和75%乙醇浸泡处理，之后置于超净台中通风干燥和紫外灭菌。
[0035]将浓度均为50mM的EDC和NHS溶液加入经预处理过的三维石墨烯泡沫的小孔内， 与石墨稀室温条件下反应30min ;反应结束后清洗所述小孔，向其中加入浓度为100ng/mL 的BDNF溶液100 y 1，37°C条件下孵育过夜，之后吸走上液，并用PBS缓冲液清洗干净，形成三维石墨烯-细胞因子复合体系。
[0036]先后用多聚鸟氨酸(PL0)和层粘连蛋白(LN)孵育所述小孔，最后在该孔内接种神经干细胞(传代2?10次均可，接种密度为1万个/孔)，使用包含有B27、P/S以及表皮生长因子EGF和碱性成纤维生长因子bFGF的培养基，培养3天，观察三维石墨烯-BDNF复合体系对神经干细胞的增殖情况。
[0037]实施例2:
[0038]将CVD法三维石墨烯泡沫(同实施例1)完全浸泡于HN03:H2S04= 1:3的混合溶液中2h以上，之后用去离子水反复清洗至pH呈中性，置于烘箱中烘干；将石墨烯置入细胞培养皿小孔中并粘胶，等胶水干燥后，先后用清水和75%乙醇浸泡处理，之后置于超净台中通风干燥和紫外灭菌。
[0039]将浓度均为50mM的EDC和NHS溶液加入小孔内，与石墨烯室温条件下反应30min ; 反应结束后清洗小孔，向其中加入浓度为100ng/mL的NGF溶液100 y 1，37°C条件下孵育过夜，之后吸走上液，并用PBS缓冲液清洗干净。
[0040]先后用多聚鸟氨酸(PL0)和层粘连蛋白(LN)孵育小孔，最后在该孔内接种神经干细胞(传代2?10次均可，接种密度为1万个/孔)，使用包含有B27、P/S以及胎牛血清的培养基，观察三维石墨烯-NGF复合体系对神经干细胞的分化情况。
[0041]对照例1:取Hummers法制取的氧化石墨稀加入浓度为100ng/mL的NGF溶液，37°C 条件下孵育过夜，之后吸走上液，并用PBS缓冲液清洗干净，形成了石墨烯-细胞因子复合体系。取该石墨烯-细胞因子复合体系参照实施例1-2条件进行神经干细胞的培养，并观察神经干细胞的分化情况。
[0042]对照例2:本对照例与实施例1-2基本相同，但以Hummers法制取的氧化石墨稀替代了其中的三维石墨烯泡沫，形成了石墨烯-细胞因子复合体系。取该石墨烯-细胞因子复合体系参照实施例1-2条件进行神经干细胞的培养，并观察神经干细胞的分化情况。
[0043]请参照图5、图6可以看到，本发明的三维石墨烯-BDNF复合体系、三维石墨烯-NGF复合体系与对照例1中的BDNF、NGF单纯物理吸附石墨烯比较，有明显的促进神经干细胞增殖效应。而通过相同的测试发现，对照例2的BDNF-石墨烯复合体系、NGF-石墨烯复合体系对于神经干细胞的培养效果与对照例1的体系基本相同。由此可以说明，本发明的三维石墨烯-细胞因子复合体系对于神经干细胞有更为优异的促进增殖效果。
[0044]应当理解，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。 因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
【主权项】
1.一种三维石墨烯-细胞因子复合体系，其特征在于包括三维石墨烯基体以及连接 在所述基体上的细胞因子，所述基体具有多孔结构，其中孔的孔径为50~500 ym、孔隙率^ 95%〇2.根据权利要求1所述的三维石墨烯-细胞因子复合体系，其特征在于所述细胞因子 包括白细胞介素、干扰素、转化生长因子-P家族、生长因子或神经营养因子；其中所述生 长因子包括表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1， 所述神经营养因子包括神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养因子3或神经营养 因子4。3.根据权利要求1或2所述的三维石墨烯-细胞因子复合体系，其特征在于所述细胞 因子通过化学修饰方式结合在所述基体上。4.如权利要求1-3中任一项所述的三维石墨烯-细胞因子复合体系的制备方法，其特 征在于包括:将三维石墨烯材料在混合强酸溶液中氧化处理后，在三维石墨烯材料表面通 过化学偶联方法修饰偶联基团，以及通过所述偶联基团时细胞因子结合到三维石墨烯材料 上，形成所述三维石墨烯-细胞因子复合体系。5.根据权利要求4所述所述的三维石墨烯-细胞因子复合体系的制备方法，其特征在 于包括:将三维石墨烯材料在混合强酸溶液中浸泡2 h以上，完成对三维石墨烯材料的氧 化处理，其中所述混合强酸采用HNOjP H #04的混合溶液。6.根据权利要求5所述所述的三维石墨烯-细胞因子复合体系的制备方法，其特征在 于所述混合强酸采用体积比为1:3_5的HNOjP H2S04形成的混合溶液。7.根据权利要求4所述所述的三维石墨烯-细胞因子复合体系的制备方法，其特征在 于包括:将经氧化处理后的三维石墨烯材料清洗后，以含有浓度在50 mM以上的EDC和浓度 在50 mM以上的NHS溶液浸渍30min以上，从而在三维石墨烯材料表面修饰上偶联基团。8.根据权利要求4或7所述所述的三维石墨烯-细胞因子复合体系的制备方法，其特 征在于包括:将修饰有偶联基团的三维石墨稀材料与浓度为20 ng/mL~10 mg/mL的细胞因 子溶液反应2 h以上，形成所述三维石墨烯-细胞因子复合体系。9.一种神经干细胞的培养方法，其特征在于包括:提供权利要求1-3中任一项所述的 三维石墨烯-细胞因子复合体系，以及于所述三维石墨烯-细胞因子复合体系内接种神经 干细胞，传代2~10次。10.如权利要求9所述的神经干细胞的培养方法，其特征在于包括:至少以多聚鸟氨 酸和/或层粘连蛋白孵育所述三维石墨烯_细胞因子复合体系内的小孔，最后在所述小孔 内接种神经干细胞，接种密度为1万个/孔以上，传代2~10次，并使用包含有B27、P/S、表 皮生长因子EGF和碱性成纤维生长因子bFGF中一种或两种以上的培养基培养3天以上。
【文档编号】C07K17/14GK105985440SQ201510064414
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月6日
【发明人】程琳, 程一琳, 程国胜, 王炜, 宋琴
【申请人】中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所