一种新型重组穿孔素蛋白及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种新型重组穿孔素蛋白及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]七鲍暢(Lampetra japonicum)属于圆口纲、脊索动物门，是现存的一种古老生物，近年来，对于七鳃鳗独特生理机制的研究引起广泛重视。
[0003]穿孔素蛋白是七鲍暢特有的免疫效应分子，具有一个凝集素(Lectin)结构域与细胞成孔毒素(toxin)结构域，能锚定在细胞膜上，通过自身聚合形成一个环状复合体，该复合体在细胞膜上形成亲水性的穿膜通道，进而引起细胞内容物外流，达到杀灭异源细胞的目的，有着广泛的潜在应用前景，有待进一步的开发研究。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是克服现有穿孔素蛋白的相关研究和应用的不足，提供一种新型重组的七鳃鳗穿孔素蛋白及其制备方法，制备得到的穿孔素蛋白能够在细菌表面形成孔道，引起细菌内容物外流，可作为一种非抗生素的新型抗菌物质，有着巨大的应用前景；而且可在真核细胞表面打孔，可使细胞进行膜质分离，是提取分离细胞器的有效新方法，在细胞实验研究中也有广阔的应用价值。
[0005]本发明的目的是提供一种新型重组穿孔素蛋白以及编码表达该蛋白的核苷酸序列。
[0006]本发明的另一目的是提供上述重组穿孔素蛋白的制备方法。
[0007]本发明的再一目的是提供上述重组穿孔素蛋白的应用，包括该重组穿孔蛋白及其核苷酸序列在细胞穿孔领域的应用和用途。
[0008]本发明上述目的通过以下技术方案实现:
一种新型重组穿孔素蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。该蛋白为七鳃鳗免疫系统的重要效应分子，其结构域分为凝集素结构域和细胞毒素结构域两个部分。
[0009]同时，编码上述重组穿孔素蛋白的核苷酸序列也在本发明的保护范围之内。
[0010]进一步地，上述编码重组穿孔素蛋白的核苷酸序列如SEQID N0.1所示，或所述核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示序列进行一个或几个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的核苷酸序列。
[0011]—种包含编码重组穿孔素蛋白的核苷酸序列，或由编码重组穿孔素蛋白的核苷酸序列与表达载体经重组得到的重组表达载体，也在本发明的保护范围之内。
[0012]优选地，上述重组表达载体包含SEQ ID N0.1所示核苷酸序列。
[0013]优选地，上述表达载体为含有转录和翻译插入的编码序列所需的元件的空载体。
[0014]更优选地，上述表达载体为pGEX_6pl等。
[0015]更优选地，上述重组表达载体可由SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列插入pGEX-6p-l等表达载体经重组得到。
[0016]另外，上述重组穿孔素蛋白的制备方法包括如下步骤:
51.克隆编码重组穿孔素蛋白的核苷酸序列；
52.将步骤SI获得的核苷酸序列构建入表达载体，得到重组表达载体；
53.步骤S2获得的重组表达载体经转化、菌液培养，收集培养液，纯化提取重组穿孔素蛋白O
[0017]进一步优选地，上述重组穿孔素蛋白的制备方法步骤如下:
51.以七鳃鳗cDNA为基础，克隆得到目标基因序列(SEQID N0.1所示序列)；
52.通过引物Pl和P2将步骤SI获得的序列克隆到原核融合表达载体pGEX-6pl上，得到重组表达载体pGEX-6p 1-LPFP ；
53.将重组表达载体pGEX-6pl-LPFP转化大肠杆菌Rosetta(DE3)；
54.转化后的大肠杆菌Rosetta(DE3)经过培养后，进行超声裂解，收集上清，利用GST标签亲和层析的方法进行蛋白纯化；
或者步骤S4的操作为:转化后的大肠杆菌Rosetta(DE3)经过培养后，7000rpm离心1min，将菌体置于缓冲液下重悬，使用机械高压破碎机在4°C温度下将菌体破碎，利用GST标签亲和层析的方法进行蛋白纯化；
所述缓冲液为20mMTri s-HCl、50mMNaCl，pH7.5。
[0018]上述重组穿孔素蛋白在细胞穿孔领域中的应用也在本发明的保护范围之内，具体是在制备细胞溶解制剂中的应用。
[0019]因此，在针对细菌或真菌时，该重组穿孔素蛋白可作为非抗生素的新型抗菌物质或制备抗菌药物。所述抗菌物质或抗菌药物能够在细菌表面形成孔道，引起细菌内容物外流，从而起到抗菌的作用。
[0020]而在针对癌细胞时，所述该重组穿孔素蛋白可使癌细胞出现明显的穿孔溶解现象，进而杀伤癌细胞，起到治疗癌症的目的，因此，可应用于制备癌症治疗药物。
[0021 ] 进一步优选地，上述细菌为大肠杆菌。优选地，上述癌细胞为HeLa细胞。
[0022]另外，所述重组穿孔素蛋白可在真核细胞表面打孔，可使细胞进行膜质分离，是提取分离细胞器的有效新方法，在细胞实验研究中也有广阔的应用价值。
[0023]在穿孔素蛋白的研究中，我们发现，穿孔素蛋白能在革兰氏阴性菌的细胞壁上形成孔道，导致细胞的内容物流出，细胞裂解死亡，达到抗菌抑菌效果。由于抗生素的滥用，病原菌的耐药性普遍增强，穿孔素蛋白的抗菌机制与抗生素不同，病菌对其并无耐受性，且代谢产物为氨基酸，对环境和人体安全无害，作为一种新型的抗菌药具有广阔的应用前景。穿孔蛋白的另一功能在于，能够在红细胞，HeLa细胞等真核细胞上形成孔道，为生物化学实验中提取细胞内容物提供一种安全无毒的新手段。
[0024]本发明采用现代基因工程技术，设计并合成出穿孔素蛋白序列，并将其连接到表达载体上再转化宿主菌，载体带有GST标签，能采用亲和层析的方法对蛋白进行洗脱纯化，制备出大量经纯化的重组穿孔素蛋白。该蛋白能够在革兰氏阴性细菌和真核细胞上形成穿孔环，产生溶膜效应。且本发明方法得到的重组穿孔蛋白还克服了天然提取的蛋白的各种缺点，便于穿孔素蛋白的批量生产，且能有效控制批间差别有利于以穿孔素蛋白为核心原料的各种试剂的制备及穿孔素蛋白的工业化应用。
[0025]本发明具有以下有益效果:
本发明通过对七鳃鳗穿孔素蛋白基因的克隆重组，成功地在原核细胞内表达出具有活性的穿孔素蛋白，并通过摸索和优化得到一套简单有效的蛋白表达纯化方法。本发明制备得到的穿孔素蛋白能够在细菌表面形成孔道，引起细菌内容物外流，作为一种非抗生素的新型抗菌物质，有着巨大的应用前景；而且可在真核细胞表面打孔，可使细胞进行膜质分离，是提取分离细胞器的有效新方法，在细胞实验研究中也有广阔的应用价值。
[0026]另外，本发明的原核蛋白纯化表达方法收获得到重组蛋白稳定性好，纯度高，活性高。而且该方法工艺简单，耗时短，成本低，设备要求不高，便于大规模生产。
【附图说明】
[0027]图1为重组穿孔素蛋白对HeLa细胞的穿孔及杀伤作用。
[0028]图2为重组穿孔素蛋白浓度与HeLa细胞的细胞穿孔率的关系。
[0029]图3为穿孔素蛋白对大肠杆菌的穿孔作用和大肠杆菌溶破过程。
【具体实施方式】
[0030]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0031 ]除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0032]实施例1重组穿孔素蛋白表达质粒的构建 1、七鳃鳗总RNA的提取
取七鳃鳗肝脏组织，用Trizol试剂裂解，氯仿抽提，异丙醇沉淀获得RNA。
[0033]2、穿孔素蛋白的片段的扩增
(1)按照Clontech公司的SMARTerRACE 5’/3’试剂盒，将上述RNA逆转录合成第一链，再进行PCR扩增。
[0034]所述PCR扩增所使用的引物为:P1和P2，是依据穿