一种重组蛋白Vo及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生物技术制药领域，涉及一种重组脑膜炎大肠杆菌K1疫苗蛋白Vo，本 发明进一步涉及该重组蛋白的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 细菌性脑膜炎是新生儿的常见感染性疾病，是新生儿死亡及远期致残的主要原 因。世界卫生组织数据显示，新生儿细菌性脑膜炎发生率位于新生儿感染性疾病的前5位， 其死亡率高达40%。由于早产儿的增多及其它原因，我国新生儿细菌性脑膜炎发病率逐渐 上升，其已成为新生儿住院三大病因之一。随着抗生素耐药性的泛滥，新生儿细菌性脑膜炎 的疗效和预后更加不容乐观。资料显示约有1%_40%的新生儿细菌性脑膜炎患者死亡，仅 30 %的患者能够治愈。患者治愈后通常出现神经系统后遗症，如脑积水、癫痫、智能低下等， 为家庭和社会造成严重的负担。
[0003] 大肠杆菌Kl(E.coli K1)是引发新生儿细菌性脑膜炎的主要病原体，约超过80% 病例的由该菌感染所致。外膜蛋白A(outer membrane A，0mpA)是E.coli K1的关键致病因 子，在E.coli K1引发的新生儿脑膜炎中发挥重要作用(Kim K.S.2008.Nat Rev Microbiol 6: 625-634.)。研究发现，E.coli K1引起新生儿脑膜炎必须通过以下4个病理过程：① E.coli Κ1感染宿主并定植新生儿肠道或泌尿道;②E.coli Κ1从感染定植部位入血并在血 液中繁殖，引起新生儿菌血症;③E.coli K1突破新生儿血脑屏障，进入中枢神经系统；④ E.coli K1在颅内释放促炎因子和毒素，引起白细胞的浸润和血脑屏障通透性增加，最终引 发新生儿脑膜炎等感染性疾病。在整个新生儿脑膜炎的发病过程中，E.coli K1能抵抗血液 免疫系统的杀伤并引发菌血症、入侵血脑屏障导致颅内感染是决定细菌感染的关键因素， 而外膜蛋白A(outer membrane protein A，0mpA)在此细菌致病的关键过程中都发挥决定 性的作用(Krishnan S.，and N.V.Prasadarao.2012.FEBS J·)，所以OmpA可以作为脑膜炎 大肠杆菌疫苗的重要候选疫苗分子。
[0004] OmpA为I型跨膜蛋白，其全长346个氨基酸，主要由2个domain组成，N端1-198氨基 酸为典型的beta-barrel的跨膜结构，C端domain为肽聚糖结合结构域。重组表达的全长 OmpA蛋白因为含有跨膜结构难溶于水，不能作为疫苗分子。OmpA的N端结构域是其主要功能 结构域，其暴露在胞外的Ιοορ?，1〇〇ρ2，1οορ3，1οορ4是其介导OmpA相关病理生理过程的关 键结构域。此外，通过Anti Jen，Bepipred和Epitome等表位软件预测发现OmpA的loop 1， 1〇〇ρ2，1〇〇ρ3，1〇〇ρ4具有很多的B细胞表位和T细胞表位。目前尚没有基于OmpA蛋白制备抗 体的报道。
【发明内容】
[0005] 针对脑膜炎大肠杆菌的严重危害，本发明提供一种脑膜炎大肠杆菌K1的重组蛋白 Vo，该重组蛋白由脑膜炎大肠杆菌KlOmpA的有效成分构成，其可应用于制备脑膜炎大肠杆 菌的亚单位疫苗以及相关的检测试剂盒。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：
[0007] 一种重组蛋白Vo,所述重组蛋白Vo由脑膜炎大肠杆菌K1的外膜蛋白A(0mpA)的膜 外片段通过连接肽融合而成;所述重组蛋白Vo具有以下通式：
[0008] l〇〇pl-(linker a)ni-loop2-(linker b)n2-loop3-(linker b)n3-loop4-(linker a)n4-loopl-(linker a)n5-loop2-(linker b)n6-loop3-(linker b)n7-loop4；
[0009] 其中，所述连接肽 1 inker a选自 G1 y SerG 1 yG 1 y Ser，G1 yGly SerG 1 yG 1 y， TyrAlaProValAspVal 中的一个，优选为 GlySerGlyGlySer;
[0010] 所述连接肽 linker b选自 GlySerGlyGlySerGly，GlyGlySerGlyGly， TyrAlaProValAspVal 中的一个，优选为 GlySerGlyGlySerGly;
[0011] 111、112、113、114、115、116、117各自独立地选自1、2、3或4，优选为1 ;
[0012] 优选地，所述loopl的氨基酸序列为SEQ ID N0:3;
[0013] 优选地，所述1οορ2的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
[0014] 优选地，所述1οορ3的氨基酸序列为SEQ ID N0:5;
[0015] 优选地，所述1οορ4的氨基酸序列为SEQ ID N0:6。
[0016] 在根据本发明的一个实施方案中，所述重组蛋白Vo的氨基酸序列为SEQ ID N0:2; 优选地，编码所述重组蛋白Vo的核苷酸序列为SEQ ID NO: 1。
[0017] 本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体由骨架质粒可修饰地连接编码上述 重组蛋白Vo的核苷酸序列形成。
[0018]在根据本发明的一个实施方案中，所述骨架质粒选自pGex系列载体、pET系列载体 或pQE系列载体;优选为pGex-6P-2。
[0019 ] 进一步地，本发明提供了上述重组蛋白Vo的制备方法，所述方法包括：
[0020] 1)构建如上所述的表达载体；
[0021] 2)将步骤1)得到的表达载体转化至宿主菌，得到含有表达载体的宿主菌；
[0022] 3)诱导步骤2)得到的含有表达载体的宿主菌表达重组蛋白Vo;
[0023] 4)提取并纯化得到重组蛋白Vo。
[0024] 在根据本发明的一个实施方案中，所述宿主菌选自大肠杆菌XLl_blue、BL21或 HMS174菌株中的一种，优选为大肠杆菌XLl-blue菌株。
[0025] 优选地，所述宿主菌为大肠杆菌XLl-blue菌株。
[0026] 进一步地，本发明提供了上述重组蛋白Vo在制备用于诊断、预防或治疗脑膜炎大 肠杆菌K1的药物中的应用。
[0027] 在根据本发明的一个实施方案中，所述药物为用于诊断脑膜炎大肠杆菌K1的试剂 盒。
[0028] 在根据本发明的一个实施方案中，所述药物为用于预防或治疗脑膜炎大肠杆菌K1 的亚单位疫苗。
[0029] 由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点：
[0030] 1)用于表达重组蛋白Vo的表达质粒可在原核表达系统-大肠杆菌中诱导表达。
[0031] 2)选择pGEX载体系列时，重组蛋白Vo以融合蛋白形式表达;表达载体上接有一个 分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此 标签就成为蛋白纯化的标记，使得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而纯 化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性;纯化出来的重组蛋白Vo的纯度大于 95%〇
[0032] 3)Vo重组蛋白能够诱导动物产生特异性的抗体和具有免疫保护效果。
[0033] 利用本发明的重组蛋白Vo制备的亚单位疫苗可通过皮下（肌肉）注射途径进行免 疫接种，激发机体产生高滴度IgG抗体。并经动物实验证实，所述基因工程重组蛋白疫苗具 有良好的抗E.coli K1感染的免疫保护效果。为进一步的联合疫苗和多亚单位融合疫苗研 究打下基础，同时为防治疫苗和诊断试剂盒的研制及应用具有重要的作用。
【附图说明】
[0034]图1:重组蛋白Vo的结构组成示意图。A为OmpA分子的结构示意图。B为重组蛋白Vo 的结构示意图。
[0035]图2为重组质粒pGex-6P-2-V〇的双酶切鉴定结果。其中，泳道1为核酸(DNA)分子量 标准(Marker)，从上到下大小分别为：4500、3000、2000、1200、800、500、200bp;泳道2&3:重 组表达质粒pGEX-6p-2-V 〇经酶切后的鉴定结果，酶切后分离的片段约4000bp和约500bp。 [0036]图3为蛋白Vo诱导鉴定结果；其中，泳道1:蛋白分子量标准(Marker)，从上到下大 小分别为：170Kd、130Kd、100Kd、70Kd、55Kd、40Kd、35Kd、25Kd、15Kd;泳道 2:结合诱导表达的 超声上清的GST填料;泳道3:经PP酶酶切后的上清;泳道4:经PP酶酶切后的GST填料。
[0037]图4为纯化后的蛋白Vo SDS-P