一种多基因重组嵌合抗原受体分子的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种多基因重组嵌合抗原受体分子。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是一种严重威胁人类生命的疾病。恶性肿瘤或癌症的发病机理多种多 样，其共同的表现在于变异的肿瘤细胞不受机体免疫系统的清除，能够无限制的繁殖和扩 散，破坏周围组织的正常细胞和功能。长期以来，医药学界在尝试医治和控制肿瘤疾病的病 程方面做了大量的努力，但收效甚微。目前，在恶性肿瘤的治疗上，除根除手术外，主流医学 界的临床辅助治疗手段仍然是放射线治疗、化学药物治疗和抗体治疗。现有的治疗手段，对 于肿瘤的复发几乎无效。
[0003] 1985年，美国科学家尝试分离病人的单个核细胞，并在体外用各种细胞因子诱导、 激活、产生杀伤性T细胞(Cytokine-induced killer cells，CIK)，继而发现这些细胞通过 静脉滴注回输给病人后，对肿瘤的生长有杀伤作用。经过近三十年的临床应用和技术发展， 用免疫杀伤细胞治疗肿瘤已经成为第四种公认的恶性肿瘤辅助治疗手段。常见的用于临床 治疗的免疫杀伤细胞：自然杀伤细胞(Natural killer cells，NK)、γδΤ细胞、细胞毒性T淋 巴细胞（Cytotoxic T lymphocytes，CTL)、NK样Τ淋巴细胞（Natural killer-like Τ cells，NKT)、Thl效应细胞(Effector cells)等。抗原提呈细胞之一树突状细胞(Dentritic cells，DC)也常用于免疫细胞治疗的应用，DC可以提高免疫杀伤细胞的特异性、加强免疫杀 伤细胞的活力。
[0004] 免疫活性细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤效果，取决于肿瘤细胞膜表面的受体分子 表达。例如，γ δτ细胞、细胞毒性T淋巴细胞、Thl效应细胞等是通过T细胞受体(TCR)识别肿 瘤细胞表达的组织相容性复合物(MHC)或白细胞抗原(HLA)结合的"抗原"肽片段序列而实 施杀伤的；对于不表达MHC或HLA的肿瘤细胞无杀伤作用。而NKT、NK和γ δΤ细胞的杀伤作用 通过其他受体(CDld、KAR等)结合机制，不依赖于肿瘤细胞MHC的表达。与大部分正常组织细 胞相似，很多种肿瘤细胞并不表达或弱表达MHC分子，因此肿瘤细胞膜表面MHC分子表达的 多样性是免疫细胞治疗疗效及临床应用推广受限的原因之一。
[0005] 为了克服免疫杀伤细胞特异性低下的缺点，美国科学家发明一种转基因的方法： 将识别肿瘤表面特异性抗原的单克隆抗体高变区序列在体外重组、亚克隆为单链抗体片段 (Single chain antibody fragment of variable regions，scFv)，再与其他基因的跨膜 蛋白片段和胞内信号肽融合形成人造的嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor， CAR)，转染至T细胞内而形成嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor，CAR-T)。早 期CAR-Τ的信号肽是⑶3受体的Zeta亚基，后来发现嵌合⑶28、CD137等蛋白的胞内信号肽后 能加强Zeta的作用并显著延长CAR-Τ细胞的体内生存时间。临床研究结果表明，不同单抗制 备的转基因 CAR-Τ细胞对不同肿瘤有不同程度的疗效，明显高于非特异性的免疫杀伤细胞； 其中"抗⑶19单抗-CAR-Τ"细胞对急、慢性淋巴性白血病的疗效达到93%。这是恶性肿瘤治 疗领域的一项重大突破。
[0006] CAR-T细胞在临床对其他实体瘤的治疗效果明显低于"抗⑶19单抗-CAR-T"细胞对 急、慢性淋巴性白血病的疗效。原因之一是淋巴性白血病癌细胞中95 %都表达B细胞抗原 CD19,而其他实体瘤细胞的特异性抗原表达在40-70%之间；所以在实体瘤的治疗中，单一 的单抗CAR-T细胞不可能杀伤表达其他肿瘤特异性抗原的癌细胞。原因之二是免疫杀伤细 胞通过血液/淋巴液循环浸润到实体肿瘤的速度和数目。原因之三是肿瘤组织细胞对免疫 活性细胞的负调节作用。
[0007] 在正常情况下，人体的血液循环中存在少量的活性杀伤细胞，如ΝΚ，γ δτ细胞等， 其作用在于清除衰老、变异的组织细胞或抵御病毒入侵。免疫细胞的活性主要受到Τ调节细 胞(Regulatory T cel Is，Treg)的控制，当Τ调节细胞的控制减弱时，会造成免疫功能充进 或产生自身免疫性疾病；当控制增强时，会使免疫功能低下，滋生肿瘤或其他病毒性皮肤 病。目前确认的参与负调节的蛋白因子有细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(Cyt 〇t〇Xic T lymphocyte-associated antigen_4，CTLA4)和程序性死亡蛋白1/程序性死亡蛋白1配基1 (Programmed cell death protein 1/Programmed cell death protein 1 ligand 1，PD_ 1/ro-Ll)等分子。抑制性T调节细胞表达CTLA4，可以与免疫细胞DC和T细胞表面的B7族蛋白 亚基相互作用，抑制免疫细胞功能。B7蛋白家族成员有B7-H1(PD-L1)，B7-H2(PD-1L2)等。 B7-Hi(ro-Li)也可以通过结合淋巴细胞ro-i分子，进一步抑制靶细胞的活性功能。PD-1和 PD-L1相互作用对T细胞功能的抑制是免疫细胞治疗肿瘤的一个主要障碍。在大多数实体瘤 组织中，癌细胞表达ro-Li/PD-i的水平增高，对浸润到癌组织的活化淋巴细胞产生直接的 抑制，这也是肿瘤逃逸机体免疫监管的机制之一;活化T细胞表面PD-1的表达增加，更容易 受到负调节的抑制。最新的抗体药物CTLA4单抗、PD-1单抗以及H)-L 1单抗已被美国FDA批准 临床治疗恶性肿瘤，其作用原理是阻断CTLA4/B7以及PD-1/PD-L1的相互结合，从而解除体 内T调节细胞或癌细胞对活性T杀伤细胞的抑制，让体内免疫活性细胞对肿瘤细胞进行杀 伤、清除。有研究表明，体外活化的免疫杀伤细胞与体内自然存在的组织浸润性T淋巴细胞 (Tissue infiltration lymphocytes，TIL)不同，是高水平表达]^-1分子，这也许是阻碍循 环免疫杀伤细胞杀伤实体瘤组织癌细胞的原因。在临床应用中，如果免疫细胞治疗联合使 用抗CTLA和ro-1/PD-Ll的单抗药物，可以明显提高免疫细胞治疗的疗效。
【发明内容】
[0008] 为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种具有完整表达、保持识别、结合功 能的特异性，同时具有活化T细胞作用和生存能力延长功能多基因重组嵌合抗原受体分子。
[0009] 本发明第一方面提供一种多基因重组嵌合抗原受体分子，包括：
[0010] 1)两个通过连接肽相连的、结合肿瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面的免疫抑 制分子的肽段的胞外区和跨膜区；以及
[0011 ] 2)共刺激信号分子胞内结构域肽段。
[0012] 进一步的，所述免疫抑制分子选自肿瘤细胞或肿瘤基质细胞膜蛋白，所述结合肿 瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面的免疫抑制分子的肽段为相应免疫抑制分子的配体/ 受体天然肽段、或者单链抗体。
[0013] 进一步的，所述配体/受体天然肽段包括PD-1和PD-L1，所述单链抗体包括Anti-CD44-scFv〇
[0014] 进一步的，所述多基因重组嵌合抗原受体分子的跨膜区选自ro-i或PD-L1或ro-L2 的跨膜区。
[0015] 进一步的，所述共刺激信号分子胞内结构域肽段选自⑶28、CD3zeta、CD137的胞内 结构域肽段中的一种或多种。
[0016] 进一步的，所述多基因重组嵌合抗原受体分子还包括信号肽。信号肽可以提高多 基因重组嵌合抗原受体分子这种融合蛋白分泌的效果，在信号肽与融合蛋白其它氨基酸序 列一起被表达后，最终被蛋白酶切除。蛋白酶具有一定的识别序列，而信号肽与其后面的肽 段融合后构成新的氨基酸序列，所以如果选择的信号肽不当，可能会导致蛋白酶的误切，蛋 白失活。
[0017] 进一步的，所述多基因重组嵌合抗原受体分子的氨基酸序列包含或为SEQ ID N0: 11、SEQ ID N0:12或SEQ ID N0:13的氨基酸序列。
[0018] 本发明第二方面提供一种多核苷酸，其编码本发明第一方面提供的多基因重组嵌 合抗原受体分子。
[0019] 进一步的，包含或为SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8或SEQ ID N0:9所示的核苷酸序 列。
[0020] 本发明第三方面提供一种重组载体，其包含本发明第二方面提供的多核苷酸。
[0021] 本发明第四方面提供一种重组细胞，其包含本发明第三方面提供的重组载体。 [0022] 在本发明中：
[0023] 术语"肿瘤基质细胞"是指肿瘤微环境内一些支撑肿瘤细胞的恶性增殖、抗凋亡、 侵袭、转移，逃脱免疫监控等生命活动的细胞，主要包括成纤维细胞、肿瘤相关巨噬细胞 (TAMs)、调节性T细胞(Treg)、未分化的骨髓细胞、内皮细胞、周细胞和血小板、内皮细胞等。
[0024] 术语"免疫抑制分子"是指由肿瘤细胞或肿瘤基质细胞产生，起抑制