CCAAACCCTGGTGGTTGGTGTCGTGGGCGGCCTGCTGGGCAG CCTGGTGCTGCTAGTCTGGGTCCTGGCCGTCATCTGCTCCCGGGCCGCAAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACA GTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGAC TTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCT CTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGG GGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCC TACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGC CACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAGTCGAC(SEQ ID NO：2)
[0048] 其中，上述序列中的下划线部分，为酶切位点序列。上述序列全长1044nt(加终止 密码和酶切位点1059nt)，经全基因合成后亚克隆到酶切好的载体，命名为pIres2-EGFP-ClonePD-1-28ZT〇
[0049] 实施例3 PD-L1跨膜和胞内信号肽片段的构建
[0050] 从5'端Bgl II开始，设计一个Kozak序列(GCCACC)，起始密码ATG和编码15个氨基 酸的连接肽的核酸序列。连接肽核酸序列3 '下游依次连接：PD-L1 (Un iPr〇tKB: Q9NZQ7， 55nt-792nt)，CD28(UniProtKB:P10747-1，538nt-660nt)，CD3zeta〇JniProtKB:P20963-1， 154nt-495nt)，最后是Sal頂每切位点序列。该段序列标记为ro-Ll-28ZT，序列具体如下：
[0051] AGATCTGCCACCATGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGCTCCGGCGGTGGCGGTTCGTTTACTGTCACGGTTCC CAAGGACCTATATGTGGTAGAGTATGGTAGCAATATGACAATTGAATGCAAATTCCCAGTAGAAAAACAATTAGACC TGGCTGCACTAATTGTCTATTGGGAAATGGAGGATAAGAACATTATTCAATTTGTGCATGGAGAGGAAGACCTGAAG GTTCAGCATAGTAGCTACAGACAGAGGGCCCGGCTGTTGAAGGACCAGCTCTCCCTGGGAAATGCTGCACTTCAGAT CACAGATGTGAAATTGCAGGATGCAGGGGTGTACCGCTGCATGATCAGCTATGGTGGTGCCGACTACAAGCGAATTA CTGTGAAAGTCAATGCCCCATACAACAAAATCAACCAAAGAATTTTGGTTGTGGATCCAGTCACCTCTGAACATGAA CTGACATGTCAGGCTGAGGGCTACCCCAAGGCCGAAGTCATCTGGACAAGCAGTGACCATCAAGTCCTGAGTGGTAA GACCACCACCACCAATTCCAAGAGAGAGGAGAAGCTTTTCAATGTGACCAGCACACTGAGAATCAACACAACAACTA ATGAGATTTTCTACTGCACTTTTAGGAGATTAGATCCTGAGGAAAACCATACAGCTGAATTGGTCATCCCAGAACTA CCTCTGGCACATCCTCCAAATGAAAGGACTCACTTGGTAATTCTGGGAGCCATCTTATTATGCCTTGGTGTAGCACT GACATTCATCTTCCGTTTAAGAAAAGGGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTC CCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGA GTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGG ACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGA AGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAA GGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGC CCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAGTCGAC(SEQ ID NO：3)
[0052] 其中，上述序列中的下划线部分，为酶切位点序列。上述序列全长1254nt(加终止 密码子和酶切位点1269nt)，经全基因合成后亚克隆到酶切好的载体，称为pIres2-EGFP-ClonePD-Ll-28ZT〇
[0053] 实施例4单链抗体anti-⑶44scFv-CAR及分泌引导信号肽片段的构建
[0054] 根据申请号为2007/0237761/A1的美国专利，选择和修改anti-CD44单链抗体序 列，将文献中轻链、重链可变区分别缩短为339nt和363nt。以⑶8a信号肽+重链+连接肽+轻 链的顺序合成Anti-〇)44-scFv，序列具体如下：
[0055] GCTAGCATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGCAGGTTCA GCTGCAGCAGTCTGGGGATGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATGCAT TCAGTAGGTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGA GATGGTGATACTAACTACAATGGAAAGTTCAAGGGTAAAGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTA CATGCAGCTCAACAGCCTAACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGACGGCGATGGTCCGATTACTTTG GTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGATCC GGCGGTGGCGGTTCCGATGTTGTGATGACTCAGACCCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCAT CTCTTGCAAATCAAGTCAGAGCCTCTTACATAGTAATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCC AGTCTCCAAAGCTCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGAATCTGGAGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCA GGGACAGAATTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTCGGGAGTTTATTACTGCTTGCAAGCTACACA TTTTCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAACTGGAGCTGAAACGGAGATCT(SEQ ID NO：4)
[0056]其中，上述序列中的下划线部分，为酶切位点序列。CD8a分泌引导信号肽的核酸序 列如SEQ ID N0:14所示。在信号肽核酸序列5'端设置内切酶位点Nhe I，轻链3'端酶切位点 为Bgl II。如图3所示，质粒pIres2-EGFP-anti-CD44scFv用限制性内切酶Nhe I和Bgl II作 酶切实验的结果，图中Lane Μ为DNA分子大小标志，Lane 1为Nhe I和Bgl Π 酶切消化的质 粒，插入基因810nt ;Lane 2为质粒pIres2-EGFP-anti-〇)44scFv，插入片段与理论值相似。 重链和轻链之间的连接肽为15个氨基酸(SEQ ID N0:15)。全基因合成后的Anti-CD44-SCFV 经酶切处理，分别亚克隆至：1)质粒Plres2-EGFP-28ZT; 2)质粒pIres2-EGFP-PD-1-28ZT;和 3)质粒 pIres2-EGFP-PD-Ll-28ZT。上述三种 Anti-CD44-scFv-CAR 的组合序列0六1?1化1代82-EGFP-anti-CD44scFv-