28ZT)、CAR2(pIres2-EGFP-anti-CD44scFv-PD-1-28ZT)、CAR3 (pIres2-EGFP-anti-CD44scFv-PD-Ll-28ZT)分别为 1479nt、1860nt、2070nt。未经修饰的 CAR1、CAR2、CAR3嵌合受体蛋白的表观分子量分别为59，160道尔顿、74，400道尔顿和82，800 道尔顿。
[0057]上述CAR中，⑶8a的分泌引导信号肽的核酸序列为：
[0058] ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG(SEQ ID NO：14)
[0059] 上述CAR中，连接肽的氨基酸为：
[0060] GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：15)
[0061] 实施例5多基因 CAR分子及分泌引导信号肽片段的构建
[0062]采用与实施例4中相同的方法，将CD8a信号肽与PD-L2膜外免疫球蛋白的V片段 (UniProtKB-Q9BQ51，核酸序列58nt-375nt)合成连接，称为PD-L2IGV(SEQ ID N0:5)。亚克 隆至质粒 pIres2-EGFP-PD-1-28ZT，得到质粒 pIres2-EGFP-ro-L2-PD-1-28ZT，该组合序列 称为CAR4JD-L2IGV具体序列如下：
[0063] GCTAGCGCCACCATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGTT ATTCACAGTGACAGTCCCTAAGGAACTGTACATAATAGAGCATGGCAGCAATGTGACCCTGGAATGCAACTTTGACA CTGGAAGTCATGTGAACCTTGGAGCAATAACAGCCAGTTTGCAAAAGGTGGAAAATGATACATCCCCACACCGTGAA AGAGCCACTTTGCTGGAGGAGCAGCTGCCCCTAGGGAAGGCCTCGTTCCACATACCTCAAGTCCAAGTGAGGGACGA AGGACAGTACCAATGCATAATCATCTATGGGGTCGCCTGGGACTACAAGTACCTGACTCTGAAAGTCAAAGCTTCCT ACAGGAAAAGATCT(SEQ ID NO：5)
[0064] 其中，上述序列中的下划线部分，为酶切位点序列。上述CAR 1、CAR2、CAR3和CAR4 中，CAR2和CAR3具有如图1A所示的相似结构，CAR4具有如图1B的相似结构，四种CAR分子具 体的构建示意图分别如图4A、4B、4C和4D所示。编码上述CAR1、CAR2、CAR3和CAR4的核苷酸序 列分别如SEQIDN0 :6-9所示，上述CAR1、CAR2、CAR3和CAR4的氨基酸序列分别如SEQID N0:10-13所示。
[0065] 实施例6 CAR1、CAR2、CAR3和CAR4的真核细胞内蛋白表达
[0066] 基于单链抗体anti-CD44-scFv构建的CAR1以及插入PD-1/PD-L1/PD-L2的多基因 CAR2、CAR3、CAR4，所得质粒经工程菌培养、放大和制备后，用于真核细胞的表达检测。将 HEK293细胞接种于6孔板，等到70-80%饱和度时，用1^2000转染上述质粒至293细胞，24小 时-48小时之间观察细胞绿色荧光。如图5所示，显示单链抗体anti-⑶44-scFv按常规方式 构建的CAR1 (图5A)与插入ro-1/PD-Ll的多基因 CAR2(图5B)、CAR3(图5C)和CAR4(图5D)均能 在转染细胞中有效地短暂表达，根据荧光分布目测转染率在20%左右，不同的CAR转染细胞 之间没有明显差别。
[0067]将六孔板内转染细胞经胰酶处理后收集，超声破碎制备细胞蛋白溶液，在SDS电泳 后做Western Blot，用过氧化物酶标兔抗鼠 IgG直接染色，在不同分子量区域六万（CAR1)、 七万(CAR2)和八万(CAR3)都可看到相应染色条带，但非特异染色的条带也比较多。用兔抗 人Η)-1多克隆抗体(货号 ：10377448,3丨11〇1^〇1(^化&1)或兔抗人?0-1^1多克隆抗体(货号 ： 10084-T24，Sinobiological)做一抗，然后用辣根过氧化物酶标羊抗兔IgG多克隆抗体 (Jackson Immuno Research公司）染色，可以大大减少背景干扰。以CAR1蛋白组作为对照， 如图6所示，CAR2蛋白组显示特异性ro-i条带;CAR3蛋白组显示ro-Li条带;含ro-i和ro-Li 片段的CAR条带均在分子量7万-10万道尔顿之间，说明CAR2和CAR3分子的完整表达，未见明 显降解。
[0068] 实施例7多基因重组CAR分子在CIK细胞膜上表达
[0069] CIK先后使用γ干扰素、anti_CD3单抗、ILla和IL2诱导、培养和扩增12天。分别取 质粒 pIres-EGFP-anti-CD44scFv-28ZT(CARl)、pIres-EGFP-anti-CD44scFv-PD-1-28ZT (CAR2)、pIres-EGFP-anti-CD44scFv-PD-Ll-28ZT(CAR3)各 5ug 电转至 CIK 细胞。24 小时后收 集细胞，PBS洗涤细胞两次，每管加300ul PBS重悬细胞。先加10ul⑶3-FITC流式抗体(天津 协科生物技术有限公司）染色15min，再加1 Oul TRITC标记山羊抗小鼠 IgG(H+L)抗体(上海 康成)染色l〇min，上机检测。图7结果显示TRITC标记山羊抗小鼠 IgG(H+L)抗体与各种CAR分 子中的Anti-CD44scFv结合反应阳性，说明多基因重组CAR2 (图7B)和CAR3 (图7C)分子和常 规结构的CAR1 (图7A)-样在CD3+CIK细胞中的正常表达和跨膜存在，具有潜在的肿瘤杀伤 功能。
[0070]以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技 术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和 变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种多基因重组嵌合抗原受体分子，其特征在于:包括： 1) 两个通过连接肽相连的、结合肿瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面抗原和/或免疫 抑制分子(PD-l/ro-Ll/ro-L2)的肽段的胞外区和跨膜区；以及 2) 分泌信号肽；以及 3) 共刺激信号分子胞内结构域肽段。2. 根据权利要求1所述的多基因重组嵌合抗原受体分子，其特征在于:所述结合肿瘤细 胞表面和/或肿瘤基质细胞表面的抗原和/或免疫抑制分子的肽段为相应免疫抑制分子的 配体/受体天然肽段，或者为应免疫抑制分子的配体和肿瘤细胞表面抗原的单链抗体。3. 根据权利要求2所述的多基因重组嵌合抗原受体分子，其特征在于:所述配体/受体 天然肽段包括PD-1、PD-L1或PD-L2，所述单链抗体包括Ant i-CD44-scFv。4. 根据权利要求3所述的多基因重组嵌合抗原受体分子，其特征在于:所述多基因重组 嵌合抗原受体分子的跨膜区选自ro-ι或ro-Li或ro-L2的跨膜区。5. 根据权利要求1所述的多基因重组嵌合抗原受体分子，其特征在于:所述共刺激信号 分子胞内结构域肽段选自⑶28、⑶3zeta、⑶137的胞内结构域肽段中的一种或多种。6. 根据权利要求1所述的多基因重组嵌合抗原受体分子，其特征在于:所述多基因重组 嵌合抗原受体分子还包括信号肽。7. 根据权利要求1所述的多基因重组嵌合抗原受体分子，其特征在于:所述多基因重组 嵌合抗原受体分子的氨基酸序列包含或为SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13所 示的氨基酸序列。8. -种多核苷酸，其特征在于：其编码根据权利要求1至7任一项所述的多基因重组嵌 合抗原受体分子。9. 根据权利要求8所述的多核苷酸，其特征在于:包含或为SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8 或SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。10. -种重组载体，其特征在于:其包含根据权利要求7所述的多核苷酸。
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种多基因重组嵌合抗原受体分子；本发明的多基因重组嵌合抗原受体分子，包括：1)两个通过连接肽相连的、结合肿瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面的免疫抑制分子的肽段的胞外区和跨膜区结构域；以及2)共刺激信号分子胞内结构域肽段；本发明的多基因重组嵌合抗原受体分子，具有完整表达、保持识别、结合功能的特异性，同时具有活化T细胞作用和生存能力延长功能。
【IPC分类】C07K19/00, C12N15/63, C12N15/62
【公开号】CN105601752
【申请号】CN201610071667
【发明人】郝晓勇, 黄招琴
【申请人】长沙郝怡雅医药科技有限公司
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年2月1日