AGE电泳结果；其中，泳道1 :蛋白分子量标准 (Marker)，从上到下大小分别为：170Kd、130Kd、100Kd、70Kd、55Kd、40Kd、35Kd、25Kd、15Kd; 泳道2:纯化的Vo蛋白。
【具体实施方式】
[0038]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进一步详细说明。应当理解，此处说描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0039] 实施例1基因的合成和亚克隆
[0040] 1 ·按照图1的设计思路，设计含有Loop 1、Loop2、Loop3、Loop4和蛋白连接子的重组 蛋白Vo，编码Vo的DNA的合成和序列与pGEX-6p-2的连接由上海生工生物工程有限公司合 成。
[0041 ] 2.重组质粒的转化
[0042]从_80°C冰箱取3管大肠杆菌XLlblue感受态细胞(上海超研生物科技有限公司）， 第一管加入pGEX_6P_2质粒(GE Healthcare Life Sciences)，作阳性对照；第二管加入lul Vo合成质粒;第三管不加外源DNA，作阴性对照。冰浴50min，42 °C金属浴中热击90s，迅速冰 浴2min。加入600μ1 LB空白培养基，混匀，置于37°C摇床中220rp振摇lh。
[0043] 各管以5000rpm室温离心3min.，弃去300μ1上清，再重悬菌体，取200μ1涂布于，Amp 抗性LB平板。平板倒置于37 °C培养箱中培养24h。
[0044] 阴性对照平板没有菌落出现；阳性对照平板长满菌落，说明感受态细胞制作正确， 结果可信。挑取转化平板上分隔良好的菌落，接种于Amp抗性LB培养基中，37°C振荡培养过 夜。
[0045] 2.双酶切鉴定
[0046] 取37 °C摇床培养过夜的阳性质粒，按照说明书的步骤，通过快速质粒小提试剂盒 (天根生化科技有限公司)提取阳性克隆的质粒。使用BamHI(Takara公司）和Xhol(Takara公 司)进行酶切，37°C水浴半小时。体系如下：
[0047]
[0048]灌制1.0%琼脂糖凝胶，其中含EB(上海俊晟生物科技有限公司）0.5ug/ml，将上述 酶切反应体系中各加入lyl 6XLoading 131^€61'，通过凝胶80￥电泳2〇111；[11后，群扫描仪观察 酶切的结果。结果过发现阳性克隆的质粒被切成2个片段，大片段约4000bp为表达载体 PGEX-6P-2部分，小片段约500bp，为插入的编码Vo的片段(图2)。
[0049] 实施例2重组融合蛋白Vo在原核表达系统-大肠杆菌中诱导表达、纯化及表达形式 的鉴定
[0050] 1. Vo诱导表达
[0051 ] 1)取过夜培养的pGEX-6P-2-Vo/XL-lblue菌液100yL加入10mL Amp+抗性的LB培养 基中，180rpm 37°C过夜培养，分别取过夜培养的菌液400yL加入20mL Amp+抗性的LB培养基 中（余下的菌液保存在4 °C冰箱中备用），37 °C培养2~3h，转速200rpm，二次活化至0D600为 0.8-1.0时，加入IPTG4yL，使其终浓度为200μΜ，再置于摇床诱导表达30°C诱导表达3h。
[0052] 2)将诱导表达后的菌液取出，以12000rpm离心5min，弃去上清，加入lmL lysis buffer(20mM PB，pH 7.2,250mM Nacl)混匀，超声裂解3min(超声6次30s/次），再4°C 14000rpm离心15min，分离上清和沉淀。
[0053] 2.处理上清
[0054] 取Glutathione Sepharose 4B 20μ1，用PBS洗涤3次后，将准备好的上清加入 Glutathione Sepharose 4Β中，室温结合lh。在4°C下以 14000rpm离心3min后，使用PBS-0.25%吐温20洗涤2次，PBS洗涤一次。向结合后的Glutathione Sepharose 4B加入20yL 2 X蛋白质上样buffer，煮沸5min，14000rpm离心3min〇 [0055] 3 ·处理沉淀
[0056] 在沉淀中加入500yL PBS重悬菌体，取80yL重悬菌液加入20yL5X蛋白质上样 buffer，煮沸 5min，14000rpm 离心 3min。
[0057] 4.SDS-PAGE 电泳
[0058] 将5%浓缩胶灌入制胶版中，在加入蒸馏水将胶压平，室温放置30min使其凝固，将 上层的蒸馏水倒干，再灌入10%分离胶，立即插上梳子，室温放置30min使其凝固备用。将处 理好的上清和沉淀分别取10yL上样，进行SDS-PAGE电泳。电压先80v电泳30min，再调至 180v，电泳1~2h后，将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱 色后，在呈像系统下观察结果，PGEX-6P-2-Vo/XL-lblue在30°C为可溶性蛋白（图3)。
[0059] 实施例3Vo抗原的制备
[0060] 1.放大培养获取蛋白
[0061 ] 取保存在4°C冰箱中备用的pGEX-6P-2-Vo/XL-lblue菌液400yL加入到20mL含Amp 抗性的LB培养基中进行一次活化，200rpm 37°C培养5~6h后，取8mL-次活化的菌液加入到 400mL含Amp抗性的LB培养基中进行二次活化，37°C培养3~4h至0D600为1.0时，加入80yL IPTG(终浓度为200μΜ)置于16°C摇床中过夜诱导后，12000rpm离心15min收集菌体，再加 20mL lysis buffer(同实施例2)重悬菌体后，将菌液进行超声裂解3min(200V)，收集上清 与800yL用于结合GST融合蛋白的Glutathione Sepharose 4B(GE公司）凝胶珠(beads)结合 处理;再进行SDS-PAGE凝胶电泳。
[0062] 2.使用酶切方法，将目的蛋白和GST标签分开，获取目的蛋白Vo
[0063] 向余下约800yL已结合蛋白的Glutathione Sepharose 4B中加入800yL PBS和120 yL PreScission protease(PP酶，GE公司），室温垂直旋转酶切5h后，离心吸取上清后，分别 用800yL PBS洗涤3次，各后取10yL样品变性处理后，上样5yL进行蛋白电泳(方法同上），在 呈相系统下观察结果，酶切下来的Vo蛋白分子量在15-25kDa之间，与预期蛋白分子量大小 相符合，见图4。
[0064]实施例4大肠杆菌K1感染小鼠模型的构建 [0065] 1.大肠杆菌K1菌液的制备
[0066] 取冻存的大肠杆菌K1菌株RS218(ATCC 700973)，采用LB营养琼脂平板复苏，37°C 需氧培养过夜。挑取单个菌落接种20mL LB液体培养基，37°C需氧180rpm振荡培养15h后，取 0.2mL接种于20mL LB液体培养基中，37°C需氧230rpm振荡培养611。60008离心收集菌体，生 理盐水洗涤两次后用生理盐水重悬浮菌体。采用分光光度计测定菌液的OD600值，并按照10D =1.0 X 109CFU/ml将其换算成细菌浓度。
[0067] 2.感染剂量的确定
[0068]采用生理盐水将实施例1获得的E.coli K1菌液调节至五种不同浓度，将实验动物 6~8周德雌性BALB/c小鼠随机分为5组，每只小鼠通过腹腔注射E. coli K1菌液250yL，采用 同样剂量的生理盐水(NS)作为空白对照。动物的分组和感染情况如表1所示。感染结束后每 隔1天观察小鼠死亡情况，观察周期为7天，观察期结束后剩余动物以C02吸入法安乐处死。 [0069] 表l:E.coli K1菌感染剂量的确定 [0070]
[0071] 采用不同浓度的E.coli K1菌株ATCC700973感染BALB/c小鼠时，经过7天的观察， 结果发现:感染量为1.0 x l〇6CFU时小鼠死亡率为Ο，；感染量为1.0 X 107CFU时小鼠死亡率为 20 %，感染量为0.5 X 108CFU时小鼠死亡率为80 %，感染量达到1.0 X 108CFU时小鼠死亡率 100%。确定小鼠感染的优选剂量为0.5 X 108CFU。
[0072]实施例5动物的免疫
[0073] 1)首次免疫，用roS稀释Vo抗原，加入浓度为lmg/mL的A1 (0H)3;用5号半型针头，双 侧腹股沟、足底及背部皮下对点注射，每只BALB/C小鼠注射量为100yL，并设置阳性对照组、 阴性对照组和空白对照组；
[0074] 2)第二次免疫，第7天进行第二次免疫