重组rsv抗原的制作方法

专利名称：：重组rsv抗原的制作方法重组RSV抗原相关申请的交叉引用本申请要求2010年5月13日提交的美国临时申请61/334，568和2009年6月M日提交的61/219，964的较早申请日的权利，所述申请的公开内容通过引用并入本文。依照37C.F.R.§1.71(E)的版权通告本专利文件的部分公开内容含有受到版权保护的材料。版权所有者不反对专利文件或专利公开中使用的提交到IntentandTrademarkOffice的专利文件或记录中出现的任何复制件，但除此之外保留所有版权利。背景本公开涉及免疫学领域。更具体地说，本公开涉及用于引发对呼吸道合胞病毒(RSV)的特异免疫反应的组合物和方法。人呼吸道合胞病毒(RSV)是全球6个月以下婴儿和妊娠期短于或等于35周的早产儿中下呼吸道感染(LRI)的最常见病因。RSV疾病的谱系包括多种呼吸道症状，从鼻炎和中耳炎到肺炎及毛细支气管炎，后两种疾病引起相当高的发病率和死亡率。人类是唯一已知的RSV贮主。被污染的鼻分泌物中的病毒通过大的呼吸道飞沫进行传播，因此传播需要与被感染个体或被污染表面的紧密接触。RSV可以在玩具或其它物品上存活几个小时，这就解释了特别是在儿科病房中医院源性RSV感染的高发生率。每年全球RSV感染和死亡的数字据估计分别是Mmillion和160，000。仅在美国，估计RSV即造成每年18，000到75，000例住院和90到1900例死亡。在温带气候，大量记录表明RSV是造成每年冬天急性LRI流行病，包括毛细支气管炎和肺炎的原因。在美国，几乎所有儿童到两岁时均感染过RSV。RSV相关LRI在除此以外健康的儿童中的发生率据计算是两岁前每1000个儿童年龄有37例(小于6个月的婴儿中是每1000个儿童年龄有45例)，住院风险是每1000个儿童年龄有6个(每1000个6个月以下儿童年龄)。在患有心肺疾病和早产的儿童中发生率更高，这些儿童构成了美国RSV相关入院的几乎一半。经历过RSV引起的更严重LRI的儿童以后发生儿童期哮喘的几率增加。这些研究展示了在工业化国家，由于对患有严重LRI及其后遗症的患者的护理成本极高，对RSV疫苗及其使用的广泛需求。RSV还逐渐被认为是造成老年人中流感样疾病的重要原因。已尝试了各种方法希望产生安全有效的RSV疫苗，能够在健康和有风险的群体中引发持久和保护性的免疫反应。但是目前为止，评估过的候选物中没有一个被证明作为预防RSV感染和/或减少或预防RSV疾病，包括下呼吸道感染(LRIs)的疫苗是安全有效的。发明概述本公开涉及重组呼吸道合胞病毒(RSV)抗原。更具体地说，本公开涉及包含重组F蛋白的抗原，其中所述F蛋白经过修饰以便稳定三聚体融合前构象。公开的重组抗原表现出极佳的免疫原性，尤其适合作为抗RSV感染和/或疾病的免疫原性组合物(例如疫苗)的成分。还公开了编码所述重组抗原的核酸、含有抗原的免疫原性组合物，以及制备和使用抗原的方法。附图简述图IA是突出RSVF蛋白结构特点的示意图。图IB是示范性RSVPrefusionF(PreF)抗原的示意图。图2的线状图显示了PreF的非对称场流分离(asymmetricalfieldflowfractionation)(AFF-MALS)分析的代表性结果。图3的条形图显示了I^reF抗原对人血清的中和抑制。图4A和B的条形图显示了小鼠应答I^reF抗原引发的血清IgG效价。图5A和B的条形图显示了I^reF抗原引发的RSV特异中和抗体的效价。图6A和B显示了RSVPreF抗原给小鼠提供的抗攻击保护作用。图7评估了免疫和攻击后的BAL白细胞。图8的条形图展示了用和水包油乳剂(AS03)稀释液一起成剂的I^reF免疫后，弓丨发的血清IgG。图9的条形图展示了用和水包油乳剂(AS03)稀释液一起成剂的I^reF免疫后，中和抗体的效价。图10的条形图展示了用和水包油乳剂(AS03)稀释液一起成剂的I^reF免疫后，抗攻击的保护作用。发明详述Mit在RSV感染的发病机制中，宿主免疫反应似乎参与其中，这一事实使得开发预防RSV感染的疫苗复杂化。1960年代的研究显示接种过福尔马林灭活的RSV疫苗的儿童在以后接触到病毒时比未接种的对照个体病情更严重。这些早期试验导致80%接种儿童入院和两例死亡。在动物模型中也发生疾病严重程度增加的现象，被认为是由于血清中和抗体水平不够、缺乏局部免疫，以及肺嗜酸粒细胞增多症(pulmonaryeosinophilia)过度诱发2型辅助T细胞样(TM)免疫反应和IL-4和IL-5细胞因子的产生增加。相反，抗RSV感染的成功疫苗诱发的是Thl型免疫反应，其特点在于产生IL-2和Y-干扰素(IFN)。本公开涉及重组呼吸道合胞病毒(RSV)抗原，所述重组抗原解决了以前疫苗中使用的RSV抗原遇到的问题，改善了抗原的免疫学和制备性能。本文公开的重组RSV抗原涉及包含可溶性F蛋白多肽的Fusion(F)蛋白类似物，其中所述F蛋白多肽经过改造以便稳定G蛋白的融合前构象，即在与宿主细胞膜融合前，成熟组织的F蛋白的构象。为了清楚简洁起见，这些F蛋白类似物被命名为“I^reF”或“PreF抗原”。本文公开的抗原是根据这样一个意外发现而预测的，即经过引入异源三聚化结构域而被改造的可溶性F蛋白类似物表现出改进的免疫学特性，并且体内给予受试对象时是安全并有极高保护性的。参照本领域广泛接受的术语和命名，文中提供了RSVF蛋白的结构细节，并在图IA中进行了图示。图IB提供了示范性抗原的示意图。本领域技术人员理解，根据本文提供的教导，可以将任何RSVF蛋白通过修饰来稳定其融合前构象。因此，为了促进对指导I^reF抗原产生原理的理解，根据示范性F蛋白来说明各个结构成分，SEQIDNOs1和2分别给出了示范性F蛋白的多核苷酸和氨基酸序列。类似地，适用的情况下，参考示范性G蛋白来描述G蛋白抗原，SEQIDNOs:3和4分别提供了示范性G蛋白的多核苷酸和氨基酸序列。参考F蛋白多肽的一级氨基酸序列(图1A)，使用以下名词描述抗原的结构特征。名词FO是指全长翻译出来的F蛋白前体。FO多肽可以划分为被中间的称为ρ印27的肽分隔开的F2结构域和Fl结构域。在成熟过程中，FO多肽在位于F2和Fl之间并侧接pep27的两个弗林蛋白酶位点发生蛋白水解切割。为了以下讨论，F2结构域包括F蛋白中氨基酸1-109的至少一部分和甚至全部，Fl结构域的可溶性部分包括氨基酸137-526的至少一部分和甚至全部。正如以上指出的，这些氨基酸位点(和文中之后指定的所有氨基酸位点)是参考SEQIDNO2所示的示范性F蛋白前体多肽(FO)给出的。融合前F(或“PreF”)抗原是可溶性的(即不是膜结合的)F蛋白类似物，其包含至少一个能够稳定F蛋白融合前构象的修饰，这样RSV抗原可以保持F蛋白融合前构象的至少一个免疫优势表位。可溶性F蛋白多肽包含RSVF蛋白的F2结构域和Fl结构域(但不包含RSVF蛋白的跨膜结构域)。在示范性实施方案中，F2结构域包括F蛋白的氨基酸26-105,Fl结构域包括氨基酸137-516。但也可以使用较小的部分，只要能够维持稳定I^reF抗原的三维构象。类似地，也可以用包含其他结构成分的多肽(例如，融合多肽)来代替示范性F2和Fl结构域，只要所述其他成分不会破坏三维构象，或者以其他方式对抗原的稳定性、生产或加工有负面影响、或者降低免疫原性。F2和Fl结构域处于N-端到C-端的方向，这种设计是为了使F蛋白类似物折叠和组装成熟融合前构象。为了增加产量，F2结构域前面可以添加分泌信号肽，比如天然F蛋白信号肽或者能够增强在表达重组抗原的宿主细胞中生产和分泌的异源信号肽。I^reF抗原通过引入一或多个修饰得以(三聚体融合前构象)稳定，比如添加、缺失或替代一或多个氨基酸。一个这类稳定修饰是添加包含异源稳定结构域的氨基酸序列。在示范性实施方案中，所述异源稳定结构域是蛋白多聚化结构域。所述蛋白多聚化结构域的一个特别合适的例子是卷曲螺旋(coiled-coil)结构域，比如促进含有这类结构域的多个多肽三聚化的异亮氨酸拉锁结构域。示范性异亮氨酸拉锁结构域如SEQIDN0:11所示。一般来说，异源稳定结构域位于Fl结构域的C端。任选地，多聚化结构域经由短的氨基酸连接序列，比如序列GG与Fl结构域连在一起。连接肽还可以说较长的连接分子(例如，包含序列GG的连接肽，比如氨基酸序列GGSGGSGGS；SEQIDNO:14)。本领域已知的许多构象上是中性的连接肽可以用于这种情况，而不破坏I^reF抗原的构象。另一种稳定修饰是去除位于天然FO蛋白中F2和Fl结构域之间的弗林蛋白酶的识别和切割位点。通过缺失或者取代弗林酶识别位点中的一或多个氨基酸，可以消除位于位点105-109和位点133-136的弗林酶识别位点中的一个或两者，这样蛋白酶不能将PreF多肽切割成它的组成结构域。任选地，还可以将之间的ρ印27肽除去或者用例如连接肽替代。此外或者任选地，可以除去或取代靠近融合肽的非弗林酶切割位点(例如，位点112-113处的金属蛋白酶位点)。稳定突变的另一个例子是在F蛋白的疏水结构域中添加或取代亲水氨基酸。通常，在疏水区域内添加带电荷的氨基酸(比如赖氨酸)或者用它取代中性残基(比如亮氨酸)。例如，在F蛋白胞外结构域的HRB卷曲螺旋结构域内添加亲水氨基酸或者用亲水氨基酸取代疏水或中性氨基酸。作为一个例子，可以用带电荷的氨基酸残基，比如赖氨酸取代F蛋白中位点512的亮氨酸。替代地或者此外地，可以在F蛋白的HRA结构域内添加亲水氨8基酸，或者用亲水氨基酸取代疏水或中性氨基酸。例如，可以在I^reF抗原位点105-106(例如对应参照序列SEQIDNO2中的残基105的氨基酸后面的，比如氨基酸105和106之间的位点)或者附近加入一或多个带电荷的氨基酸，比如赖氨酸。任选地，HRA和HRB结构域中都可以添加或取代亲水氨基酸。替代地，可以缺失一或多个疏水残基，只要I^reF抗原整体构象不被损害。此外或者替代地，可以进行能够改变I^reF抗原糖基化状态的一或多个修饰。例如，可以将天然RSVF蛋白中存在的糖基化位点的一或多个氨基酸(例如在相对SEQIDNO2的氨基酸残基500处或者附近)缺失或取代(或者可以添加氨基酸使得糖基化位点被破坏)，从而增加或减少I^reF抗原的糖基化情况。例如，对应SEQIDNO2中位点500-502的氨基酸可以选自NGS、NKS、NGT和NKT。因此，在某些实施方案中，PreF抗原含有的可溶性F蛋白多肽包含RSVF蛋白多肽的F2结构域(例如，对应SEQIDNO:2中的氨基酸沈_105of)和Fl结构域(例如，对应SEQIDNO2中的氨基酸137-516)，其中引入了至少一个使糖基化改变的修饰。RSVI^reF抗原通常在F2结构域和Fl结构域之间包含完整的融合肽。任选地，PreF抗原包含信号肽。正如以上公开的，这些F蛋白多肽可以包含至少一个选自以下的修饰(i)添加包含异源三聚化结构域(比如异亮氨酸拉锁结构域)的氨基酸序列；(ii)缺失至少一个弗林酶切割位点；(iii)缺失至少一个非弗林酶切割位点；(iv)缺失pep27结构域中的一或多个氨基酸；和(ν)在F蛋白胞外结构域的疏水结构域中取代或添加至少一个亲水氨基酸。正如以上公开的，这类糖基化修饰过的RSVI^reF抗原可以组装成多聚体，例如三聚体。在示范性实施方案中，糖基化修饰过的I^reF抗原选自a)包含SEQIDNO:22或由其构成的多肽；b)SEQIDN0:21或者与SEQIDNO:21在严紧条件下几乎全长杂交的多核苷酸序列所编码的多肽；c)与SEQIDNO22有至少95%序列同一性的多肽。任何和/或所有稳定修饰可以单独使用或者与本文公开的任何其他稳定修饰组合使用来产生I^reF抗原。在示范性实施方案中，PreF蛋白含有的多肽包含F2结构域和Fl结构域，并且在F2结构域和Fl结构域之间没有居中的弗林酶切割位点，还有位于Fl结构域C端的异源稳定结构域(例如三聚化结构域)。某些实施方案中，PreF抗原在疏水HRA和/或HRB结构域中还包含一或多个亲水残基的添加和/或取代。任选地，PreF抗原含有至少一个非弗林酶切割位点，比如金属蛋白酶位点的修饰。I^reF抗原任选包含其他多肽成分，包括RSVG蛋白的至少免疫原性部分。即在某些实施方案中，I^reF抗原是既包含F蛋白也包含G蛋白成分的嵌合蛋白。F蛋白成分可以是任何以上描述的I^reF抗原，选中的G蛋白成分是RSVG蛋白的有免疫原活性的部分(最多和/或包含全长G蛋白)。在示范性实施方案中，G蛋白多肽包含G蛋白的氨基酸149-229(其中氨基酸位点参照SEQIDNO:4所代表的G蛋白序列指定)。本领域技术人员理解，可以使用更小的G蛋白部分或片段，只要选中的部分保留了较大G蛋白片段的优势免疫特征。特别是选中的片段保留位于大约氨基酸位点184-198(例如氨基酸180-200)之间的免疫优势表位，并且长度足够折叠和组装成展示免疫优势表位的稳定构象。也可以使用更长的片段，例如从大约氨基酸1到大约氨基酸229，甚至全长的G蛋白。只要在宿主细胞内重组产生时，选择的片段在嵌合蛋白中折叠成稳定构象，并且不干扰到蛋白的产生、力口工或稳定性。任选地，G蛋白成分经由短的氨基酸连接序列，例如序列GG与F蛋白成分连接。连接肽还可以是较长的连接分子(比如氨基酸序列GGSGGSGGS:SEQIDNO:14)。本领域已知的许多构象上是中性的连接肽可以用于这种情况，而不破坏I^reF抗原的构象。任选地，G蛋白成分可以包含一或多个氨基酸取代，所述取代能够减轻或防止RSV疾病动物模型中出现加重的病毒疾病。这就是说，G蛋白可以包含氨基酸取代，当包含I^reF-G嵌合抗原的免疫原性组合物被给予选自公认动物模型(例如RSV的小鼠模型)的受试对象时，与接受含有未修饰G蛋白的疫苗的对照动物相比，受试对象表现出的疫苗加重的病毒疾病(例如嗜酸粒细胞增多、嗜中性粒细胞增多)的症状减轻或者没有症状。当免疫原性组合物在没有佐剂的情况下给予时，这种疫苗加重的病毒疾病的减轻和/或防止可能很明显(但在抗原例如与强Thl诱发佐剂一起给予时，可能不明显)。此外，给予人受试对象时，氨基酸取代可以减轻或防止疫苗加重的病毒疾病。合适的氨基酸取代的例子是用丙氨酸代替位点191的天冬酰胺(氨基酸191的Asn—Ala:N191A)。任选地，任何以上描述的I^reF抗原可以包含协助纯化的其他序列。一个例子是多聚组氨酸标签。如果需要，可以从终产物中去除这种标签。被表达时，PreF抗原进行分子内折叠并组装成包含多肽多聚体的成熟蛋白。有益的是PreF抗原多肽组装成三聚体，所述三聚体效仿成熟加工后的RSVF蛋白的融合前构象。本文公开的任何I^reF抗原(包括I^reF-G抗原)适合用于免疫原性组合物中，以便引发抗RSV的保护性免疫反应。这种免疫原性组合物一般包含药物可接受载体和/或赋形剂，比如缓冲液。为了增强给药后产生的免疫反应，免疫原性组合物一般还包含佐剂。对用于引发抗RSV保护性免疫反应的免疫原性组合物(例如疫苗)的情况，组合物包含主要引发Thl型免疫反应的佐剂(Thl型佐剂)是有利的。一般来说，佐剂要选择适合给予组合物所给予的目标群体。因此，根据应用，选择适合给予例如新生儿或老年人的佐剂。本文描述的免疫原性组合物适合作为疫苗用于减少或预防RSV感染，而不会在给药或接触RSV后诱发病理反应(比如疫苗加重的病毒疾病)。某些实施方案中，免疫原性组合物包含I^reF抗原(比如SEQIDNO6所示的示范性实施方案)和包含G蛋白成分的第二多肽。G蛋白成分通常至少包含G蛋白的氨基酸149-2四。虽然可以使用更小的G蛋白部分，所述片段应当最少包含氨基酸184-198的免疫优势表位。替代地，G蛋白可以包含更大的G蛋白部分，比如氨基酸1观-2四或130-230，任选是更大的蛋白(比如全长G蛋白或嵌合多肽)的元件。在其他实施方案中，免疫原性组合物包含的I^reF抗原是嵌合蛋白，也包含G蛋白成分(比如SEQIDNOs8和10所展现的示范性实施方案)。这种嵌合I^reF(或I^reF-G)抗原的G蛋白成分一般至少包含G蛋白的氨基酸149-229。正如以上指出的，也可以使用更小或更大的片段(比如氨基酸1四_2四或130-230)，只要保留免疫优势表位，并且I^reF-G抗原的构象不受不利影响。任选地，免疫原性组合物还包含除RSV以外的病原生物体的至少一个其他抗原。例如，所述病原生物体是除RSV以外的病毒，比如副流感病毒(PIV)、麻疹、乙肝、脊髓灰质炎或流感病毒。替代地，病原生物体可以是细菌，比如白喉、破伤风、百日咳、流感嗜血杆菌和肺炎球菌。编码任何I^reF抗原(包括I^reF-G抗原)的重组核酸也是本公开的特点。某些实施方案中，编码I^reF抗原的核酸的多核苷酸序列经过优化以便在选定的宿主(比如CHO细胞，其他哺乳动物细胞或昆虫细胞)中进行表达。相应地，载体，包括表达载体(包括原核和真核表达载体)也是本公开的特点。类似地，包含这些核酸和载体的宿主细胞是本公开的特点。所述核酸还可以用于免疫原性组合物给予受试对象引发针对RSV的免疫反应。PreF抗原适合用于防止和/或治疗RSV感染。因此，本公开的另一个方面涉及引发抗RSV的免疫反应的方法。所述方法涉及将免疫有效量的含有I^reF抗原的组合物给予受试对象(比如人或动物受试对象)。给予免疫有效量的组合物能够引发对I^reF抗原是呈递的表位特异的免疫反应。所述免疫反应可以包括B细胞反应(例如产生中和抗体)和/或T细胞反应(例如产生细胞因子)。优选地，由I^reF抗原引发的免疫反应包含对RSVF蛋白融合前构象上呈递的至少一个构象表位特异的元素。可以将I^reF抗原和组合物给予受试对象，而不加重他们与RSV接触后的病毒疾病。有利地，本文公开的I^reF抗原和恰当配制的免疫原性组合物引发Thl型免疫反应，所述免疫反应能够减少或防止RSV感染，和/或减少或防止感染RSV后的病理反应。免疫原性组合物可以经由多种途径给药，包括诸如鼻内这样将I^reF抗原与上呼吸道黏膜直接接触的途径。替代地，可以采用更传统的给药途径，比如肌内给药途径。因此，还考虑了任何公开的RSV抗原(或核酸)在制备治疗RSV感染(例如，预防性治疗或防止RSV感染)的药物中的用途。相应地，本公开提供了公开的重组RSV抗原或免疫原性组合物用于医药，以及它们预防或治疗RSV相关疾病的用途。以下描述和实施例中呈现了关于抗原以及它们的使用方法的其他细节。名词为了协助对本公开各种实施方案的审核，特提供以下名词解释。根据本公开的语境可以给出其他名词和解释。除非另有说明，本文使用的所有科技名词与本公开所属领域的技术人员通常理解的意义相同。分子生物学常见名词的定义可以在BenjaminLewin,GenesV,OxfordUniversityPress出版，1994(ISBN0-19-854287-9)；Kendrewetal.(eds.)，TheEncyclopediaofMolecularBiology,BlackwellScienceLtd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9)；以^RobertA.Meyers(ed.),MolecularBiologyandBiotechnology:aComprehensiveDeskReference,VCHPublishers,Inc.出版，1995(ISBN1-56081-569-8)中找到。除非上下文明确另有说明，单数名词“一个”(“a”、“an”和“the”)包括复数指示物。类似地，单词“或”意味着包含“和”，除非上下文明确另有说明。名词“复数”是指两个或以上。还应当明白，文中给出的核酸或多肽的所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有分子量或分子质量数值都是近似值，仅用于描述目的。此外，就物质(比如抗原)浓度或水平给出的数值限制是近似的。因此，浓度被指明是至少(例如)200pg的情况中，是指浓度应理解为至少接近(或者“大约”或“”)200pg。虽然与本文描述的方法和材料类似或等同的那些方法和材料可以用于实践或测试本公开，以下描述了合适的方法和材料。名词“包含”意味着“包括”。因此，除非上下文另有要求，单词“包含”(“comprises”及其变形，比如“comprise”和“comprising”)理解为表示含有所陈述的化合物或组合物(例如核酸、多肽、抗原)或者步骤，或者一组化合物或步骤；但不排除含有其他化合物、组合物、步骤或一组化合物、组合物或步骤。缩写“e.g.”来自拉丁文exempligratia，用于本文表示非限制性的例子。因此，缩写“e.g.”是名词“forexample(例如)”的同义词。人呼吸道合胞病毒(RSV)是副粘病毒科、肺炎病毒亚科、肺病毒属的病原性病毒。RSV的基因组是编码11个蛋白的负链RNA分子。RNA基因组与病毒N蛋白紧密关联形成包裹在病毒包膜内的核衣壳。根据G糖蛋白的抗原性的不同，已有A和B两组人RSV株被描述。迄今已分离到大量RSV株。GenBank和/或EMBL登录号所代表的示范性病毒株可以在W02008114149中找到，为了公开I^reF抗原(包括嵌合I^reF-G抗原)中适合使用的和适合与I^reF抗原组合的RSVF和G蛋白的核酸和多肽序列，通过引用将该文献并入本文。还可能分离到其他RSV株，也涵盖在RSV属内。类似地，RSV的属涵盖由遗传漂变天然发生(例如以前或者之后鉴定的株)的变体或者人工合成和/或重组产生的变体。名词“F蛋白”或“Fusion蛋白”或“F蛋白多肽”或“Fusion蛋白多肽”是指具有RSVFusion蛋白多肽的全部或部分氨基酸序列的多肽或蛋白质。类似地，名词“G蛋白”或“G蛋白多肽”是指具有RSVAttachment蛋白多肽的全部或部分氨基酸序列的多肽或蛋白质。已有许多RSVFusion和Attachment蛋白被描述，是本领域技术人员已知的。W02008114149给出了示范性的F和G蛋白变体(例如，天然变体)，至本公开提交日仍是公开的。当“变体”是指核酸或多肽(例如RSVF或G蛋白核酸或多肽，或者核酸或多肽)时，它是与参照核酸或多肽不同的核酸或多肽。通常，变体和参照核酸或多肽之间的差别与参照物相比，是构成比例上很少的差别。多肽或蛋白的“结构域”是多肽或蛋白内结构明确的元件。例如，“三聚化结构域”是多肽内促进多肽组装成三聚体的氨基酸序列。例如，三聚化结构域可以通过关联其他三聚化结构域(氨基酸序列相同或不同的其他多肽)促进三聚体的组装。该名词还指编码这类肽或多肽的多核苷酸。名词“天然”和“天然存在”是指其存在状态和在自然界中是一样的元件，比如蛋白、多肽或核酸。即，元件未被人工改造过。应当理解，在本公开的语境中，有许多从例如不同RSV的天然存在株或分离物中获得的RSV蛋白或多肽的天然/天然存在变体。名词“多肽”是指一种聚合物，其中的单体是通过酰胺键连接起来的氨基酸残基。名词“多肽”或“蛋白”用于本文意图涵盖任何氨基酸序列，并且包括修饰过的序列，比如糖蛋白。名词“多肽”特别要包含天然存在的蛋白，以及那些重组或合成产生的蛋白。提到多肽时的名词“片段”是指多肽的一部分(即亚序列)。名词“免疫原性片段”是指保留了全长参照蛋白或多肽的至少一个优势免疫原性表位的所有多肽片段。多肽内的方向通常按照N端到C端来叙述，所述N端到C端的方向是由各个氨基酸的氨基和羧基部分的方向确定的。多肽的翻译是从N或氨基端向C或羧基端。“信号肽”是这样的短氨基酸序列(例如大约18-25个氨基酸长)，这类序列能够将新合成的分泌蛋白或膜蛋白引导到或者引导着跨过例如内质网膜。信号肽常常但并不永远位于多肽的N端，经常在蛋白跨膜后被信号肽酶切割下来。信号序列一般含有三个常见的结构特征N-端极性碱性区(η区)、疏水中心和亲水c区)。名词“多核苷酸”和“核酸序列”是指至少10个碱基长的聚合物形式的核苷酸。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或者任何一种核苷酸的修饰形式。该名词包括单链和双链形式的DNA。“分离的多核苷酸”意味着所述多核苷酸和它所来源的生物体中天然存在的基因组中直接相接(一个在5’端，一个在3’端)的两个编码序列不再直接相接。在一个实施方案中，多核苷酸编码多肽。核酸的5'和3'方向参考各个核苷酸单元的连接而定义，并且按照脱氧核糖(或核糖)糖环的碳位置指定。多核苷酸序列的信息(编码)内容从5'向3'方向阅读。“重组”核酸是这样的核酸，它含有不是天然存在的序列或者含有将两个本来分开的序列区段通过人工组合而制成的序列。这种人工组合可以通过化学合成，或者更常见的，通过对核酸分离区段借助例如基因工程技术进行人工操作而实现。“重组”蛋白是由被导入诸如细菌或真核细胞的宿主细胞的异源(例如重组)核酸所编码的蛋白。核酸可以被导入表达载体，所述载体含有能够表达被导入的核酸所编码的蛋白的信号；或者核酸可以整合到宿主细胞染色体中。名词“异源”就核酸、多肽或另一种细胞成分而言，表明该成分出现在自然界中通常找不到它的地方和/或它起源于不同的来源或物种。名词“纯化”(例如就病原体或者含有病原体的组合物而言)是指从组合物中除去那些不希望有的成分的过程。纯化是一个相对名词，不要求不需要的成分全部都被从组合物中除去。在疫苗生产的语境中，纯化包括诸如离心、透析、离子交换层析和大小排阻层析、亲和纯化或沉淀的过程。因此，名词“纯化的”不要求绝对纯；而是作为一个相对名词。因此，例如，纯化的核酸制品是指，指定蛋白比在其核酸的产生环境(例如在细胞内或者在生化反应室内)中更富集的核酸制品。基本纯的核酸或蛋白制品可以被纯化成所需核酸代表制品中总核酸含量的至少50%。在某些实施方案中，基本纯的核酸代表制品中总核酸或蛋白含量的至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%或以上。“分离的”生物成分(比如核酸分子、蛋白或细胞器)已被与该成分天然存在的生物体的细胞内的其他生物成分(比如其他染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白和细胞器)分开或者纯化出来。被“分离的”核酸和蛋白包括通过标准纯化方法纯化得到的核酸和蛋白。该名词还包括通过在宿主细胞内重组表达而制备的核酸和蛋白以及化学合成的核酸和蛋白。“抗原”是可以在动物内刺激抗体产生和/或T细胞反应的化合物、组合物或物质，包括通过注射、吸收或其他方式引入动物的组合物。名词“抗原”包括所有相关的抗原表位。名词“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上B和/或T细胞对其反应的位点。“优势抗原表位”或“优势表位”是那些对它们产生功能重要的宿主免疫反应(例如，抗体反应或T细胞反应)的表位。因此，就抗病原体的保护性免疫反应而言，优势抗原表位是这样的抗原部分，当它们被宿主免疫系统识别时导致对抗病原体引起的疾病的保护作用。名词“T细胞表位”是指当结合合适的MHC分子时被T细胞(经由T细胞受体)特异结合的表位。“B细胞表位”是被抗体(或B细胞受体分子)特异结合的表位。“佐剂”是以非特异性方式增强免疫反应的产生的试剂。常见佐剂包括抗原吸附在上面的矿物质(明矾、氧化铝、磷酸铝)悬浮液；乳剂，包括油包水和水包油(及其变形，包括复乳剂和可逆乳剂)、脂糖、脂多糖、免疫刺激性核酸(比如CpG寡核苷酸)、脂质体、Toll样受体激动剂(特别是TLR2、TLR4、TLR7/8和TLR9激动剂)和这些成分的各种组合。“免疫原性组合物”是适合(在例如试验情景中)给予人或动物受试对象的物质组合物，其能够引发例如抗病原体，比如RSV的特异性免疫反应。这样，免疫原性组合物包含一或多种抗原(例如多肽抗原)或抗原表位。免疫原性组合物还可以包含一或多种其他能够引发或增强免疫反应的成分，比如赋形剂、载体和/或佐剂。某些情况中，受试对象被给予免疫原性组合物以便引发免疫反应保护其抵抗病原体引起的症状或状况。某些情况中，在受试对象接触到病原体(例如RSV)后，通过抑制病原体的复制来防止(或者减少或改善)病原体所导致的症状或疾病。在本公开的语境中，名词免疫原性组合物理解为涵盖这样的组合物，所述组合物是为了引发抗RSV的保护性或缓解性免疫反应的目的被给予受试对象或受试对象群体(即疫苗组合物或疫苗)。“免疫反应”是免疫系统的细胞，比如B细胞、T细胞或单核细胞对刺激的反应。免疫反应可以是导致产生特异抗体(比如抗原特异性中和抗体)的B细胞反应。免疫反应也可以是T细胞反应，比如CD4+反应或CD8+反应。某些情况中，反应对特定抗原是特异的(即，“抗原特异性反应”)。如果所述抗原来源于病原体，抗原特异性反应是“病原体特异性反应”。“保护性免疫反应”是抑制病原体的有害功能或活性、减少病原体感染或者减轻病原体感染所造成的症状(包括死亡)的免疫反应。保护性免疫反应可以通过噬斑减少试验或者ELISA中和分析法中病毒复制或噬斑形成受到的抑制来测量，或者通过体内测量对病原体攻击的抗性。“Thl”型免疫反应特征在于存在产生IL-2和IFN-γ的⑶4+辅助T细胞，因此特征也在于IL-2和IFN-γ的分泌或存在。相反，“Th2”型免疫反应特征在于产生IL-4、IL-5和IL-13的占优势的⑶4+辅助细胞。“免疫有效量”是组合物(一般是免疫原性组合物)的量，该量用于在受试对象中引发对组合物或组合物中的抗原的免疫反应。通常，希望的结果是产生能够保护或者协助受试对象抵抗病原体的抗原(例如病原体)_特异性免疫反应。但是，为了获得抵抗病原体的保护性免疫反应可能需要多次给予免疫原性组合物。因此，在本公开的语境中，名词免疫有效量涵盖与先前给药或者之后给药组合达到保护性免疫反应的部分剂量。形容词“药物可接受的”表明指示物适合给予受试对象(例如人或动物受试对象)。Remington,sPharmaceuticalSciences,byΕ.W.Martin,MackPublishingCo.,Easton,PA,15thEdition(1975)描述了适用于治疗性和/或预防性组合物(包括免疫原性组合物)的药物递送的组合物和制剂(包括稀释剂)。在提及反应，比如免疫反应时，名词“调整”意味着改动或改变反应的开始、反应量、持续时间或特点。能够调整免疫反应的试剂在给药后，能够改变免疫反应的开始、反应量、持续时间或特点中的至少一项，或者与参照试剂相比，能够改变免疫反应的开始、反应量、持续时间或特点中的至少一项。名词“减轻”是一个相对名词，如果在给予试剂后，反应或者状况从量上缩小了；或者与参照试剂相比，给予试剂后，反应或状况从量上缩小了，则所述试剂能够减轻反应或状况。类似地，只要反应或状况的至少一个特征被消除了，名词“防止”不一定要求试剂彻底消除了反应或状况。因此减轻或防止感染或反应(比如病理反应，例如疫苗增强的病毒疾病)的免疫原性组合物可以，但不一定彻底消除了这类感染或反应，只要感染或反应比没有所述试剂情况下的感染或反应或者与参照试剂相比，测量到缩小了例如至少大约50%，比如至少大约70%或大约80%或甚至大约90%(即达到原来的10%或更少)。“受试对象”是活的多细胞脊椎动物生物体。在本公开的语境中，受试对象可以是试验对象，比如非人动物，例如小鼠、棉田鼠或非人的灵长动物。替代地，受试对象可以是人受试对象。PreF抗原自然界中，RSVF蛋白表达为被称为FO的长574个氨基酸的单一多肽前体。在体内，FO在内质网中寡聚化，被弗林蛋白酶在两个保守弗林酶共有序列(弗林酶切割位点)RARR109(SEQIDNO15)和RKRR136(SEQIDNO16)处经蛋白水解加工形成由两个二硫键连接的片段构成的寡聚物。两个片段中的较小片段被称为F2，其起源于FO前体的N端部分。本领域技术人员能够认识到缩写F0、F1和F2在科技文献中常被称为Fd1和F2。较大的C末端Fl片段通过疏水氨基酸序列将F蛋白锚定在膜中，其中该疏水氨基酸序列邻接M个氨基酸的细胞质尾巴。三个F2-F1二聚体关联形成成熟的F蛋白，F蛋白处于次稳定的融合发生前(“融合前”)构象，在接触到靶细胞膜时被引发进行构象改变。这一构象改变使被称为融合肽的一段疏水序列被暴露，该融合肽与宿主细胞膜联系促进病毒或者感染细胞的膜与靶细胞膜的融合。Fl片段含有至少两个七肽重复结构域，命名为HRA和HRB，分别位于融合肽和跨膜锚定结构域附近。在融合前构象中，F2-F1二聚体形成球状头部和茎部结构，其中HRA结构域在球状头部中处于分节段(延伸)构象。相反，HRB结构域形成从头部区域伸出的三链卷曲螺旋茎部。在从融合前到融合后构象的转换过程中，HRA结构域瓦解并被带到HRB结构域附近形成反平行的6螺旋束。在融合后状态中，融合肽和跨膜结构域并列促进膜融合。虽然以上提供的构象描述是基于晶体学数据的分子模型，融合前和融合后构象的结构差异并不需要借助晶体学来进行监测。例如，可以按照Calderetal.,Virology,271:122-131(2000)和Mortonetal.，Virology,311:275-288展示的，用电子显微镜来区分融合前和融合后(替代地称为融合发生前或融合)构象，为了其中的技术教导将所述文献通过引用并入本文。还可以通过如Connollyetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,10317903-17908(2006)描述的脂质体关联分析法来区分融合前构象和融合(融合后)构象，为了其中的技术教导将所述文献通过引用并入本文。此外，还可以利用抗体(例如单克隆抗体)区分融合前和融合构象，所述抗体特异识别RSVF蛋白的融合前或融合形式中一个上存在，而在另一种形式上不存在的构象表位。这种构象表位可能是由于分子表面上优先暴露的抗原决定簇。替代地，构象表位可以来自线性多肽中不相邻的氨基酸的排列。本文公开的抗原是设计用于稳定和维持RSVF蛋白的融合前构象，这样在表达蛋白群中，相当一部分处于融合发生前(融合前)构象(例如结构和/或热动力学模型预测的或者通过以上公开的一或多种方法评估的)。天然(或合成)F蛋白(比如SEQIDNO:2的示范性RSVF蛋白)中被引入稳定化修饰，这样I^reF抗原被引入细胞或胞外环境(例如体内，例如给予受试对象后)后，能够保持F蛋白融合前构象中的主要免疫原表位。首先，可以将异源稳定结构域放置在构建体的C末端以便替代FO多肽的膜锚定结构域。所述稳定结构域预计能够补偿HRB的不稳定性，帮助稳定融合前构象。在示范性实施方案中，异源稳定结构域是蛋白多聚化结构域。这类蛋白多聚化结构域的一个特别优选的例子是三聚化结构域。示范性三聚化结构域折叠成卷曲螺旋，后者促进组装成含有该卷曲螺旋结构域的多个多肽的三聚体。三聚化结构域的一个优选例子是异亮氨酸拉锁。示范性的异亮氨酸拉锁结构域是Harburyetal.Science2621401-1407(1993)所描述的基因工程化的酵母GCN4异亮氨酸变体。SEQIDNO:15代表了一个合适的异亮氨酸结构域的序列，当然该序列的那些保留形成卷曲螺旋稳定结构域能力的变体同样适合。替代的稳定卷曲螺旋三聚化结构域包括TRAF2(GENBANK登录号Q12933[gi:23503103]；氨基酸四9-348)；血小板反应蛋白1(登录号P07996[gi:135717]；氨基酸四1_314)；Matrilin-4(登录号095460[gi:14548117]；氨基酸594-618)；CMP(matrilin-1)(登录号NP_002370[gi:4505111]；氨基酸463-496)；HSFl(登录号AAX42211[gi:61362386]；氨基酸165-191)；和Cubilin(AccessionNo.NP_001072[gi:4557503]；氨基酸104-138)。预计合适的三聚化结构域可以导致表达蛋白的相当一部分组装成三聚体。例如，含有三聚化结构域的重组I^reF多肽至少50%组装成三聚体(通过例如AFF-MALS估计的)。一般来说，表达多肽的至少60%，更优选至少70%，最希望至少75%或以上以三聚体存在。为了进一步增强稳定性，位于位点512(相对天然FO蛋白)的亮氨酸残基可以取代为赖氨酸(SEQID而10所示示范性1^评抗原多肽中1^4821()。这一取代提高了卷曲螺旋疏水残基的周期性。类似地，可以在位点105的氨基酸后面添加赖氨酸。其次，可以除去ρ印27。分析融合前状态的RSVF蛋白的结构模型显示ρ印27在Fl和F2之间形成一个大的不受约束的环。这个环对稳定融合前状态没有帮助，在天然蛋白被弗林蛋白酶切割后消除。第三，可以删除一个或者两个弗林酶切割基序。对于这种设计，融合肽没有被从F2切割下来，防止了它从融合前构象子的球状头部释放和与临近膜的接触。融合肽和膜界面之间的相互作用预计是融合前状态不稳定的一个主要问题。在融合过程中，融合肽和目标膜之间的相互作用导致融合肽从球状头部结构中暴露出来，提高了融合前状态的不稳定性和折叠成融合后构象子。这种构象改变使得膜融合过程得以实现。除去一个或者两个弗林酶切割位点预计会阻碍融合肽N端部分接近膜，从而稳定了融合前状态。因此，在本文公开的示范性实施方案中，去除弗林酶切割基序产生的I^reF抗原含有完整的融合肽，该融合肽在加工和组装过程之中或者之后不会被弗林酶切割。任选地，还可以通过例如取代一或多个氨基酸来去除至少一个非弗林酶切割位点。例如，试验证据表明在容易被某些金属蛋白酶进行切割的条件下，PreF抗原可以在氨基酸110-118附近被切割(例如，切割发生在I^reF抗原的氨基酸112和113之间；在SEQIDNO:2所示参照F蛋白多肽中位点142的亮氨酸和位点143的甘氨酸之间)。相应地，该区域内一或多个氨基酸的修饰会减少I^reF抗原的切割。例如，位点112的亮氨酸可以取代为不同氨基酸，比如异亮氨酸、谷氨酰胺或色氨酸(如SEQIDNO:20的示范性实施方案所示)。替代地或者另外地，位点113的甘氨酸可以取代为丝氨酸或丙氨酸。任选地，PreF抗原可以包含一或多个改变糖基化模式或状态的修饰(例如通过提高或降低天然F蛋白多肽中存在的一或多个糖基化位点上被糖基化的分子比例)。例如，SEQIDNO2的天然F蛋白多肽预计在氨基酸位点27、70和500(对应SEQIDNO6的示范性I^reF抗原的位点27、70和470)被糖基化。一个实施方案中，位于氨基酸位点500的糖基化位点附近被引入修饰(指定为N470)。例如，可以通过用诸如谷氨酰胺⑴)的氨基酸取代位点500(参照序列的，通过序列比对对应示范性I^reF抗原的位点470)的天冬酰胺将糖基化位点除去。在糖基化位点引入能够提高糖基化效率的修饰是有利的。合适修饰的例子包括在位点500-502的以下氨基酸序列NGS、NKS、NGT、NKT。有趣的是，已发现导致该糖基化位点糖基化增加的修饰也会导致I^reF的产生极大地提高。因此在某些实施方案中，I^reF抗原中对应参照I^reF序列(SEQIDNO:2)氨基酸500的位置(例如在SEQIDNO:6所示范的I^reF抗原的位点470)上带有修饰的糖基化位点。合适的修饰包括序列NGS、NKS、NGT、NKT，它们所在的氨基酸对应参照F蛋白多肽序列中的位点500-502。SEQIDNO:18提供了包含NGT修饰的示范性实施方案的氨基酸。本领域技术人员可以很容易地确定对应NGS、NKS和NKT修饰的类似修饰。这些修饰优选与本文公开的任何稳定突变(例如异源卷曲螺旋，比如异亮氨酸拉锁结构域和/或疏水区内的修饰；和/或去除pep27；和/或去除弗林酶切割位点；和/或去除非弗林酶切割位点)组合使用。例如在一个特定实施方案中，PreF抗原包含去除弗林酶切割位点的取代和提高糖基化的修饰。在一个特定实施方案中，PreF抗原还包含位于氨位点500的修饰的糖基化位点。SEQIDNO22提供了示范性序列(该示范性实施方案包含NGT修饰和位点112的亮氨酸被谷氨酰胺所取代)。更一般地说，本文公开的任何一种稳定修饰，例如优选在可溶性I^reF抗原的C末端添加异源稳定结构域，比如卷曲螺旋(例如，异亮氨酸拉锁结构域)；残基的修饰，比如疏水HRB结构域中亮氨酸到赖氨酸；去除pep27；去除一个或两个弗林酶切割基序；去除非弗林酶切割位点；和/或糖基化位点的修饰，可以与一种或多种(或者以任何希望的组合的所有)其他稳定修饰组合使用。例如，可以单独使用异源卷曲螺旋(或其他异源稳定结构域)，或者与下述中的任一种组合使用疏水区内的修饰、和/或去除pep27、和/或去除弗林酶切割位点、和/或去除非弗林酶切割位点。某些特定实施方案中，PreF抗原包含C-端卷曲螺旋(异亮氨酸拉锁)结构域、位于HRB疏水结构域的稳定取代，以及一或两个弗林酶切割位点的去除。这样的实施方案包含未被弗林酶切割所去掉的完整的融合肽。在一个特定实施方案中，PreF抗原还包含位于氨基酸位点500的被修饰过的糖基化位点。天然F蛋白多肽可以选自RSVA或RSVB株的任何F蛋白，或者它们的变体(如上文定义的)。在某些示范性实施方案中，F蛋白多肽是SEQIDNO:2所代表的F蛋白。为了方便对本公开的理解，不论来自哪个病毒株，所有氨基酸残基位点都是相对(即氨基酸残基位点对应)示范性F蛋白的氨基酸位点给出的。本领域技术人员利用现有的公知比对算法(比如BLAST，使用例如缺省参数)，通过将所选RSV株的氨基酸序列与示范性序列进行序列比对可以容易地确定任何其他RSVA或B株的相当的氨基酸位点。W02008114149(为了提供FSVF和G蛋白序列的其他例子，通过引用并入本文)中公开了来自不同RSV株的F蛋白多肽的许多其他例子。其他变体可以来自遗传漂变，或者可能利用定点或随机突变人工制备，或者通过两个或多个已有变体的重组制备。就本文公开的PreF(和I^reF-G)抗原来说，这些额外的变体也是合适的。挑选F蛋白的F2和Fl结构域时，本领域技术人员会认识到不必须包括完整的F2和/或Fl结构域。一般来说，当选择F2结构域的亚序列(或片段)时，构象方面的考虑是重要的。因此，F2结构域通常含有F2结构域中能够促进多肽组装和稳定性的那部分。在某些示范性变体中，F2结构域包含氨基酸沈-105。但长度(通过添加或缺失一或多个氨基酸)略有改变的变体也是可能的。通常，选择或设计Fl结构域的至少一个亚序列(或片段)来维持稳定的包含F蛋白免疫优势表位的构象。例如，通常希望选择Fl多肽结构域中位于氨基酸262-275(palivizumabneutralization)禾口423—436(Centocor，schlOlFMAb)的亚序列，所述亚序列包含能够被中和抗体识别的表位。此外，希望包含例如氨基酸328-355区域内的T细胞表位。最常见的，是作为Fl亚基的单一连续部分(例如跨越氨基酸沈2-436)，但表位也可以保留在合成序列中，所述合成序列包含这些免疫优势表位，在稳定构象中它们组装成不连续的元件。因此Fl结构域多肽包含RSVF蛋白多肽的至少大约氨基酸沈2-436。本文提供的一个非限制性实例中，Fl结构域包含天然F蛋白多肽的氨基酸137-516。本领域技术人员会认识到，实施者可以自己判断使用其他更短的亚序列。当选择F2或Fl结构域(或者如下文讨论的，对某些PreF-G抗原的G蛋白成分而言)的亚序列时，除了构象学方面的考虑，最好在包含其他免疫原性表位的基础上对序列(例如变体、亚序列等)进行选择。例如，利用锚定基序或其他方法，比如本领域已知的神经网络或多项式函数判定来鉴定其他T细胞表位，参见例如RANKPEP(mif.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html提供)；ProPredI(imtech.res.in/raghava/propredl/index.html提供)；Bimas(www-bimas.dcrt.nih.gov/molbi/hla_bind/index.html提供)；禾口SYFPEITH(syfpeithi.bmi-heidelberg.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm提供)。例如，利用算法确定肽的“结合阈值”，挑选那些有使它们在一定亲和力有较高MHC或抗体结合概率的分数的肽。算法基于特定位点上特定氨基酸对MHC结合的影响、特定位点上特定氨基酸对抗体结合的影响，或者含有基序的肽中特定取代对结合的影响。就免疫原性肽来说，“保守残基”是肽中特定位点上出现频率比随机分布情况下预期的频率明显高的残基。锚定残基是提供与MHC分子的接触点的保守残基。通过这种预测方法鉴定到的T细胞表位可以通过测量它们与特异MHC蛋白的结合以及当呈递给MHC蛋白时它们刺激T细胞的能力来确认。PreF抗原(包括以下讨论的I^reF-G抗原)包含与表达系统对应的信号肽是有利的，例如，包含哺乳动物或病毒信号肽，比如RSVFO天然信号序列(例如SEQIDNO:2的氨基酸1-25或者SEQIDNO:6的氨基酸1-25)。一般来说，选择的信号肽与选中用于重组表达的细胞相容。例如，信号肽(比如杆状病毒信号肽，或蜂素信号肽)可以经取代用于在昆虫细胞内进行表达。如果优选植物表达系统，合适的植物信号肽是本领域已知的。许多示范性信号肽是本领域已知的(参见例如Zhang&Henzel，ProteinSci.,13:2819-2824(2004),该文献描述了多种人信号肽)，并在例如SPdb信号肽数据库中罗列，该数据库包括古细菌、原核生物和真核生物的信号序列(http://proline,bic.nus.edu.sg/spdb/)。任选地，任何以上抗原可以包含其他序列或标签，比如协助纯化的His标签。任选地，PreF抗原可以包含其他免疫原性成分。某些特别有利的实施方案中，PreF抗原包含RSVG蛋白抗原成分。示范性的含有I^reF和G成分的嵌合蛋白包含以下Vl(SEQIDNOs7和8所代表)和PreF_V2(SEQIDNOs9禾口10所代表)。在ft~eF-G抗原中，在构建体的C末端添加G蛋白的抗原部分(例如，截断的G蛋白，比如氨基酸残基149-229)。通常G蛋白成分通过柔性连接序列与F蛋白成分连在一起。例如，在示范性I^reFJl设计中，G蛋白通过-GGSGGSGGS-连接肽(SEQIDNO14)与I^reF成分连在一起。在ft~eF_V2设计中，连接肽更短。PreF_V2含有两个甘氨酸(-GG-)作为连接分子，而没有-GGSGGSGGS-连接肽(SEQIDN0:14)。如果有G蛋白多肽结构域，其可以包含选自任何RSVA或RSVB株的G蛋白的全部或部分。在某些示范性实施方案中，G蛋白是SEQIDNO:4所代表的G蛋白或者与它95%相同。合适的G蛋白序列的其他例子可以在W02008114149(通过引用并入本文)中找到。选择的G蛋白多肽成分要包含G蛋白的至少一个这样的亚序列(或片段)，所述亚序列(或片段)保留了例如氨基酸183-197区域内的T细胞表位，比如G蛋白的包含天然G蛋白氨基酸151-229、149-2或128-229的片段。在一个示范性实施方案中，G蛋白多肽是天然G蛋白多肽中包含天然G蛋白多肽氨基酸残基149-229中全部或部分的片段。本领域技术人员容易理解，也可以使用更长或更短的G蛋白部分，只要选中的部分不会从构象上使得ft~eF-G抗原不稳定，或者破坏它的表达、折叠或加工。任选地，G蛋白结构域包含位点191处的氨基酸取代，该位点以前曾被证实参与减轻和/或防止福尔马林灭活RSV疫苗引起的以嗜酸粒细胞增多为特征的病情加重。对天然和取代(N191A)G蛋白的特性的详尽描述可以在例如美国专利公开2005/0042230中找到，该文献通过引用并入本文。例如，对于挑选对应天然存在病毒株的序列，一或多个结构域可以在序列上对应RSVA或B株，比如常见的命名为A2或Long的实验室分离物，或者任何其他天然存在株或分离物(如以上提到的W02008114149中公开的)。除了这些天然发生的和分离的变体，PreF(包括ft~eF-G)抗原中还可以采用与上述序列有相似度的基因工程变体。本领域技术人员理解，PreF抗原多肽(和如下文描述的多核苷酸序列)之间的相似度，和对于多肽一样(和一般来说的核苷酸序列)，可以表达为序列间的相似度，另外也可称为序列同一性。序列同一性常常以百分比同一性(或相似度)来衡量，百分比越高，两个序列的一级结构越相似。一般，两个氨基酸(或多核苷酸)序列的一级结构越相似，由折叠和组装产生的更高结构越相似。I^reF多肽(和多核苷酸)序列的变体通常含有一个或少数几个氨基酸缺失、添加或取代，但它们仍有高百分比的相同氨基酸(以及一般来说多核苷酸)。更重要的是，变体保持了本文公开的参照序列的结构上的因此也就是构象上的特性。确定序列同一性的方法是本领域公知的，可以应用于抗原多肽以及编码它们的核酸(例如如下文描述的方法)。各种程序和序列比对算法在SmithandWaterman,Adv.App1.Math.2:482,1981；NeedlemanandWunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970；HigginsandSharp,Gene73:237,1988；HigginsandSharp,CABIOS5:151,1989；Corpetetal.,核酸Research16:10881,1988禾口PearsonandLipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA852444，1988中有描述。Altschuletal.,NatureGenet.6:119，1994提供了对序列比对方法和同源性计算的详细考虑。NCBIBasicLocalAlignmentSearchTool(BLAST)(Altschuletal.，J.Mol.Biol.215:403,1990)可以从多个来源得到，包括NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI,Bethesda,MD)和互联网，可以与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx联合使用。NCBI网站提供了如何使用该程序确定序列同一性的描述。某些情况中，相对它所来源的天然存在病毒株的氨基酸序列，I^reF抗原含有一或多个氨基酸修饰(例如除了以上提到的稳定修饰)。这种差别可以是一或多个氨基酸的添加、缺失或取代。变体的差别通常不超过氨基酸残基的大约1<%，或2%，或5%，或10(%，或15%，或20%。例如，与SEQIDNO:6、8、10、18、20和/或22的示范性I^reF抗原多肽序列相比，变体I^reF抗原(包括ft~eF-G)多肽序列可以包含1个或2个，或最多5个，或最多大约10个，或最多大约15个，或最多大约50个，或最多大约100个氨基酸的差异。因此，就RSVF或G蛋白或者I^reF抗原(包括I^reF-G抗原)而言的变体一般与参照序列(例如SEQID而2、4、6、8、10、18、20和/或22所显示的参照序列)，或者本文公开的任何示范性1^评抗原具有至少80%、或85%，更常见的至少大约90%或以上，比如95%，或者甚至98%或99%的序列同一性。包含在本公开中作为特点之一的其他变体是I^reF抗原(包括I^reF-G抗原)，所述I^reF抗原包含选自W02008114149中公开的天然存在变体的全部或部分核苷酸或氨基酸序列。其他变体可以来自遗传漂变，或者可能利用定点或随机突变人工制备，或者通过两个或多个已有变体的重组制备。这些额外的变体就本文公开的I^reF(和I^reF-G)抗原来说，也是合适的。例如，修饰可以是不会改变所得I^reF抗原的构象或免疫原性表位的一或多个氨基酸(比如2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸，最多大约10个氨基酸或者更多)的取代。替代地或者另外地，修饰可以包括一或多个氨基酸的缺失和/或一或多个氨基酸的添加。的确，如果需要的话，一或多个多肽结构域可以是合成多肽，所述合成多肽不对应任何单一病毒株，而是包含来自多个病毒株的亚序列成分，或者甚至来自通过比对多个RSV病毒株的多肽推测的共有序列。在某些实施方案中，一或多个多肽结构域通过添加构成标签的氨基酸序列被修饰，所述标签能够协助后续的加工或纯化。这类标签可以是抗原或表位标签、酶标签或多聚组氨酸标签。标签一般位于蛋白的一端或者另一端，比如抗原或融合蛋白的C末端或N末端。编码PREF抗原的核酸本公开的另一个方面涉及编码以上描述的抗原的重组核酸。更明确地说，所述核酸编码包含可溶性F蛋白多肽抗原的多肽，其中所述F蛋白多肽抗原包含RSVF蛋白多肽的F2结构域和Fl结构域，核酸所编码的多肽包含选自以下的至少一个修饰(i)添加包含异源三聚化结构域的氨基酸序列；(ii)缺失至少一个弗林酶切割位点；(iii)缺失至少一个非弗林酶切割位点；(iv)缺失pep27结构域的一或多个氨基酸；和(ν)在F蛋白胞外结构域的疏水结构域中取代或添加至少一个亲水氨基酸。任选地，所述多核苷酸编码糖基化位点带有修饰的I^reF抗原。这类多肽的性质和结构细节已在上文详细公开。本领域技术人员根据本文的教导，可以容易地确定编码所述多肽中任一个和所有多肽的核苷酸序列，包括序列表中提供的示范性序列和以其他方式包括在本公开的序列(例如通过引用并入的)。在某些实施方案中，重组核酸经过密码子优化以便在选中的原核或真核宿主细胞内表达。例如，SEQIDNOs:5、12、17、19和21是编码I^reF抗原的序列的不同非限制性例子，这些序列经密码子优化用于在哺乳动物(例如CH0)细胞中表达。为了协助其复制和表达，可以将核酸并入载体，比如原核或真核表达载体。包含重组I^reF抗原编码核酸的宿主细胞也是本公开的特点。适合的宿主细胞包括原核(即细菌)宿主细胞，比如大肠杆菌；和大量的真核宿主细胞，包括真菌(例如酵母)细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞(比如CH0、VERO和HEK293细胞)。为了促进其复制和表达，可以将核酸并入载体，比如原核或真核表达载体。虽然本文公开的核酸可以包含到各种载体(包括例如，细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；由质粒和噬菌体DNA的组合衍生的载体；病毒DNA，比如痘苗病毒、腺病毒、鸡痘病毒、假狂犬病病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和许多其他病毒)中的任一种，载体常常是适合产生多肽表达产物的表达载体。在表达载体中，编码I^reF抗原的核酸通常被安排在引导mRNA合成的合适转录调控序列(启动子和任选地一或多个增强子)的附近和同一方向。即，目标多核苷酸序列可操纵地连接着合适的转录调控序列。这类启动子的例子包括CMV的立即早期启动子、LTR或SV40启动子、杆状病毒的多角体蛋白(polyhedron)启动子、大肠杆菌Iac或trp启动子、噬菌体T7和λPl启动子，以及其他已知能够调控基因在原核或真核细胞或者它们的病毒中的表达的启动子。表达载体一般还含有用于起始翻译的核糖体结合位点和转录终止子。载体任选包含合适的序列以便扩增表达。此外，表达载体任选包含一或多个可选择的标记物基因从而提供选择转化宿主细胞的表现型特征，比如对于真核细胞培养物，二氢叶酸还原酶或新霉素抗性；或者在大肠杆菌中比如卡那霉素、四环素或氨苄青霉素抗性。表达载体还可以包含其他表达元件来提高例如翻译效率。这些信号包括例如ATG起始密码子和相邻的序列。某些情况中，例如将翻译起始密码子和相关序列元件与目的多核苷酸序列(例如天然起始密码子)同时插入合适的表达载体中。这种情况下不需要额外的翻译调控信号。但对于只插入了多肽编码序列或它的一部分的情况，要给编码I^reF抗原的核酸的翻译提供外源翻译调控信号，包括ATG起始密码子。起始密码子的放置使它处于正确的阅读框中以确保目的多核苷酸序列的翻译。外源转录元件和起始密码子可以来自各种来源，可以是天然的也可以是合成的。如果需要，可以通过包含适合所用细胞系统的增强子来进一步提高表达效率(Scharfetal.(1994)ResultsProblCellDiffer20:125-62；Bitteretal.(1987)MethodsinEnzymol153:516-544)。某些情况中，编码抗原的核酸(比如载体)包含一或多个其他序列元件，所述选中的序列元件用于提高和/或优化I^reF编码核酸在导入宿主细胞时的表达。例如，在某些实施方案中，编码I^reF抗原的核酸包含内含子序列，比如人疱疹病毒5内含子序列(参见例如SEQIDN0:13)。内含子已被反复证明当它被恰当地置于重组构建体时，能够增强同源和异源核酸的表达。另一类表达增强序列包括超基因元件，比如核基质附着区(MatrixAttachmentRegion，或MAR)或类似的超基因元件，例如STAR元件(例如，比如Otteetal.，Biotechnol.Prog.23:801-807,2007中公开的那些STAR元件)。不受任何理论约束，MARs被认为能够介导靶DNA序列锚定到核基质上，产生从异染色质核心延伸出来的染色质环结构域。虽然MARs不含有任何明显的共有序列或可识别的序列，它们最一致的特点似乎是整体的高A/T含量，C碱基在一条链上占优势。这些区域形成弯二级结构，所述弯二级结构易于发生链分离，可能含有作为链分离成核点的核心解旋元件(CUE)。已发现与MAR序列关联的几个富含AT的简单序列基序例如A-box、T-box、DNA解旋基序、SATBl结合位点(H-box，A/T/C25)和对于脊椎动物或果蝇的共有拓扑异构酶II位点。示范性MAR序列在已公开的美国专利申请20070178469和国际专利申请W002/074969(文献通过引用并入本文)中有描述。可用于增强I^reF抗原编码核酸的表达的其他MAR序列包括Girodetal.，NatureMethods,4:747-753,2007中描述的鸡溶菌酶MAR、MARp1-42,MARp1-6、MARp1-68和MARpx-四(分别在GenBank以登录号EA423306、DI107030、DI106196、DI107561和DI106512公开)。技术人员能够理解，可以通过选择产生中等增强水平的MAR，比如报导过的MAR1-9来进一步调控表达。如果需要，可以例如利用诸如MAR-Finder(在futuresoft.org/MarFinder网站提供)、SMARTest(genomatix.de网站提供)或SMARScanKLevitskyetal.,Bioinformatics15:582_592，1999)的软件通过检索序列数据库鉴定替代的MAR序列来提高I^reF抗原的表达。在某些实施方案中，MAR与I^reF抗原编码序列在相同核酸(例如载体)上被导入(例如转染)宿主细胞。在替代的实施方案中，MAR被放在另外的核酸上(例如反式)导入，任选其与I^reF抗原编码多核苷酸序列共整合。足够指导本领域普通技术人员生成重组I^reF抗原核酸的示范性程序可以在Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989；Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3ded.,ColdSpringHarborPress,2001；Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociates，1992(禾口2003年的补充)；以及Ausubeletal.，ShortProtocolsinMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology,4thed.,Wiley&Sons,1999中找至lj。SEQIDNOs:5、7、9、12、13、17、19和21代表了编码I^reF抗原多肽的示范性核酸。包含糖基化位点修饰的变体，例如在对应SEQIDNO2中位点500的氨基酸带有修饰的变体，可以通过改变(例如突变)(与例如SEQIDNO12的多核苷酸序列相比的)位点1408-1414附近的核苷酸来产生。编码糖基化变体(例如糖基化效率提高的)的合适核苷酸序列包括aacgggt、aacaagt、aacggga和aacaaga。也可能使用替代的序列，比如消除糖基化位点的cagcagt。通过将选自任何已知或随后发现的RSV株的类似F和G蛋白多肽序列进行组装可以产生其他变体，例如象W02008114149中公开的。本领域技术人员可以制备与示范性变体有序列同一性的其他序列变体。一般来说，核酸变体编码的多肽的氨基酸残基差别不超过、或2%、或5%、或10%、或15%、或20%。这就是说，所编码的多肽有至少80%、或85%，或更常见的有至少大约90%或以上，比如95%或者甚至98%或99%的序列同一性。本领域技术人员立即可以明白，编码I^reF多肽的多核苷酸序列本身由于遗传密码的冗余性可能序列同一性小一些。某些情况中，相对它所来源的天然存在病毒株的氨基酸序列，PreF抗原含有一或多个氨基酸修饰(例如除了以上提到的稳定修饰)。这种不同可以分别是一或多个核苷酸或氨基酸的添加、缺失或取代。变体的差别通常不超过大约1%、或2%、或5%、或10%、或15%、或20%的核苷酸残基。例如，与SEQIDNO:5、7、9、12、13、17、19和/或21的示范性I^reF抗原核酸相比，变体I^reF抗原(包括I^reF-G)核酸可以包含1、或2、或最多5个、或最多大约10个、或最多大约15个、或最多大约50个、或最多大约100个核苷酸的差别。因此，就RSVF或G蛋白或I^reF抗原(包括I^reF-G抗原)核酸而言的变体通常与参照序列，例如SEQIDNO:5、7、9、12、13、17、19和/或21所展示的参照序列相比，或者与本文公开的任何其他示范性I^reF抗原核酸相比有至少80%、或85%，更常见的是有至少大约90%或以上，比如95%或者甚至98%或99%的序列同一性。包含在本公开中作为特点之一的其他变体是I^reF抗原(包括ft~eF-G抗原)，所述抗原包含选自W02008114149中公开的天然存在变体的全部或部分核苷酸序列。其他变体可以来自遗传漂变，或者可能利用定点或随机突变人工制备，或者通过两个或多个已有变体的重组制备。这些额外的变体就本文公开的PreF(和I^reF-G)抗原来说，也是合适的。除了先前描述的变体核酸，与SEQIDNOs:1、3、5、7、9、12、13、17、19和/或21所代表的示范性核酸中的一或多个杂交的核酸也可以作为编码I^reF抗原的核酸使用。本领域技术人员理解，除了以上讨论的％序列同一性衡量标准，两个核酸之间序列相似性的另一个指标是相互杂交的能力。两个核酸的序列越相似，它们能够在越严紧的条件下杂交。杂交条件的严紧程度是序列依赖性的，在不同环境参数下不同。因此，造成特定严紧程度的杂交条件根据所选杂交方法和杂交核酸序列的组成及长度而变化。通常，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(特别是Na+和/或Mg++浓度)决定了杂交的严紧度，尽管清洗时间也会对严紧度有影响。一般选择的严紧条件比特定序列在限定离子强度和PH下的热变性温度(Tm)低大约5°C-20°C。其中Tm是靶序列有50%与完全匹配的探针发生杂交时的温度(在限定离子强度和PH情况下)。核酸杂交的条件以及严紧度计算方法可以在例如Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,2001；Tijssen,HybridizationWithNucleicAcidProbes,PartITheoryandNucleicAcidPreparation,LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,ElsevierScienceLtd.,NY,NY,1993禾口Ausubeletal.ShortProtocolsinMolecularBiology,4thed.，Johnffiley&Sons,Inc.，1999中找到。为了本公开的目的，“严紧条件”涵盖这样的条件，在所述条件下只有当杂交分子与靶序列之间的错配低于25%，杂交才会发生。为了更准确的定义，可以将“严紧条件”分成更具体的严紧水平。因此，用于本文“温和严紧”条件是在该条件下有25%以上序列错配的分子不发生杂交的条件；“中等严紧”条件是在该条件下有15%以上错配的分子不发生杂交的条件，“高度严紧”条件是在该条件下有10%以上错配的序列不发生杂交的条件。“超严紧”条件是在该条件下有6%以上错配的序列不发生杂交的条件。相反，在“低严紧”条件下杂交的核酸包括那些序列同一性低得多的核酸，或者只在核酸的非常短亚序列有序列同一性的核酸。因此，应当明白本公开涵盖的各种核酸变体能够与SEQIDNOs:1,3,5,7、9、12、13、17、19和/或21中的至少一个几乎全长杂交。制备RSV抗原件多肽的方法本文公开的抗原(包括I^reF-G抗原，和适用的情况中的G抗原)是利用重组蛋白表达和纯化的成熟操作过程产生的。足够指导本领域技术人员的程序可在以下参考文献中找至丨JSambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,200；禾口Ausubeletal.ShortProtocolsinMolecularBiology,4thed.，JohnWiley&Sons，Inc.，999。其他具体细节在下文提供。将编码抗原的重组核酸通过各种公知程序导入宿主细胞，所述程序根据选定的载体和宿主细胞，包括比如电穿孔、脂质体介导的转染(例如利用商品脂质体转染剂，比如LIP0FECTAMINE2000或TRANSFECTIN)、磷酸钙沉淀、感染、转染等。SEQIDNOs:5、7、9、12、13、17、19和21提供了编码I^reF抗原(包括I^reF-G抗原)的示范性核酸。本领域技术人员可以理解，SEQIDN0s:5、7、9、12、13、17、19和21仅用于说明，并非用于限制。例如，与SEQIDNOs:5、7和9编码的蛋白(例如SEQIDNOs:6、8和10代表的)相同，但只有遗传密码冗余不同(比如象SEQIDNO:12中显示的，替代的密码子优化产生的)的多核苷酸序列，可以代替SEQIDNOs:5、7和9的示范性序列使用。对SEQIDN0s:17、19禾口21也是这样。类似地，可以采用SEQIDNO:13所显示的包含表达增强元件的多核苷酸序列，所述表达增强元件是比如固有内含子(或通过添加启动子、增强子、内含子或其他类似元件)。本领域技术人员可以认识到，这些修饰的组合也是合适的。类似地，选自任何RSVA或RSVB株的同源序列，和/或有相当大序列同一性的其他序列也可以用于表达I^reF抗原。的确，以前公开的任何变体核酸都适合导入宿主细胞，用于产生I^reF抗原(包括ft~eF-G抗原)和适用的情况下产生G多肽。例如，某些情况中，变体核酸经过修饰改变了糖基化模式，例如象上文描述的通过取代氨基酸位点500(相对SEQIDNO:2而言，例如SEQIDNO17)附近的一或多个氨基酸。已经发现改变糖基化模式，结合例如修饰切割识别位点能够提高I^reF抗原在细胞培养中的产量。这种情况下，下文描述的表达和分离重组I^reF抗原的方法提供了增加I^reF抗原生产的过程，所述过程通过取代糖基化位点的一或多个氨基酸来改变I^reF抗原的糖基化模式，任选与如上所述修饰一或多个切割位点(比如非弗林酶或弗林酶切割识别位点)组合使用。因此，包含重组抗原编码核酸的宿主细胞也是本公开的一个特征。适合的宿主细胞包括原核(即细菌)宿主细胞，比如大肠杆菌；和无数真核宿主细胞，包括真菌(例如酵母，比如酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母)细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞(比如CHO和HEK293细胞)。重组I^reF抗原核酸例如经由载体(比如表达载体)被导入(例如转导、转化或转染)宿主细胞。正如上文描述过的，载体最一般是质粒，但这类载体也可以是例如，病毒颗粒、噬菌体等。合适的表达宿主的例子包括细菌细胞，比如大肠杆菌、链霉菌和伤寒沙门氏菌；真菌细胞，比如酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母和粗糙脉孢菌；昆虫细胞，比如果蝇和草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)；哺乳动物细胞，比如3T3、COS、CH0、BHK,HEK293或Bowes黑素瘤；植物细胞，包括藻细胞等。某些情况中，瞬时转染细胞可以用于产生重组I^reF抗原。某些实施方案中，挑选带有稳定整合的I^reF核酸的细胞(例如克隆)并用于产生重组I^reF抗原。宿主细胞可以培养在常规营养培养基中，所述培养基根据启动子的激活、挑选转化子或扩增插入的多核苷酸序列等需要进行了改进。诸如温度、PH等的培养条件一般就是以前给表达选择的宿主细胞使用的条件，对本领域技术人员是显而易见的，可参见本文引用的参考文献，包括例如Freshney(1994)CultureofAnimalCells,aManualofBasicTechnique,thirdedition，Wiley-Liss，NewYork和该书引用的参考文献。任选地，宿主细胞培养在无血清和/或无动物制品的培养基中。本发明所述核酸对应的表达产物还可以在非动物细胞中产生，比如植物、酵母、真菌、细菌等。除了Sambrook、Berger和Ausubel，关于细胞培养的详细描述可以在I^ayneetal.(1992)PlantCellandTissueCultureinLiquidSystemsJohnffiley&Sons,Inc.NewYork,NY；GamborgandPhillips(eds)(1995)PlantCell,TissueandOrganCulture；FundamentalMethodsSpringerLabManual,Springer-Verlag(BerlinHeidelbergNewYork)禾口AtlasandParks(eds)TheHandbookofMicrobiologicalMedia(1993)CRCPress,BocaRaton,FL中找至lj。在细菌系统中，根据表达产物的预期用途，有大量表达载体可供选择。例如，当需要大量多肽或其片段用于产生抗体时，优选采用能够引导高水平表达易于纯化的融合蛋白的载体。这类载体包括，但不限于多功能大肠杆菌克隆和表达载体，比如BLUESCRIPTGtratagene)，该载体中目的编码序列(例如以上描述的本发明的多核苷酸)可以连接到载体内与编码氨基端启动翻译的甲硫氨酸和随后的7个β-半乳糖苷酶残基的序列读框一致，从而产生有催化活性的半乳糖苷酶融合蛋白；PlN载体(VanHeeke&Schuster(1989)TBiolChem264:5503-5509)。某些实例中，核酸经由适合在原核细胞(例如大肠杆菌细胞)内导入和表达的载体被引入细胞。例如，包含编码I^reF抗原的多核苷酸序列的核酸可以导入多种商品或专有载体中的任何一种，比如PET系列的表达载体(例如pET9b和pET2d)。IPTG诱导编码序列的表达，造成高水平的蛋白表达。编码I^reF抗原的多核苷酸序列在噬菌体T7启动子的引导下转录。替代的载体，比如包含热诱导ApL启动子的PURV22也是合适的。然后将表达载体导入(例如通过电穿孔)合适的细菌宿主。有许多合适的大肠杆菌株可供本领域技术人员选择(例如，Rosetta和BL21(DE!3)株已被证明适用于含有I^reF抗原编码多核苷酸序列的重组载体的表达)。类似地，在酵母(比如酿酒酵母)中，含有组成型或诱导型启动子(比如α因子、乙醇氧化酶和PGH)的许多载体可以用于所需表达产物的生产。综述参见Berger、AuSubel和例如Grantetal.(1987MethodsinEnzymologyl53:516-544)。在哺乳动物宿主细胞中，有许多表达系统，包括基于质粒和病毒的系统可供使用。另一个例子中，利用杆状病毒表达载体系统(BEVS)，将编码抗原的多核苷酸序列导入昆虫细胞。能够感染昆虫细胞的重组杆状病毒可以利用商品载体、试剂盒和/或系统来制备，比如来自BDBioscience的BDBaculoGold系统。简单来说，将编码抗原的多核苷酸序列插入到pAcSG2转移载体中。然后，宿主细胞SF9(草地贪夜蛾)用pAcSG2嵌合质粒和BDBaculoGold共转染，其中所述BDBaculoGold含有杆状病毒-苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus,(AcNPV))的线性基因组DNA。转染后，PACSG2质粒和杆状病毒基因组之间发生同源重组因而产生重组病毒。在一个例子中，PreF抗原在多角体蛋白启动子(pH)的调控下表达。类似的转移载体可以利用其他启动子，比如Basic(Ba)和plO启动子来产生。类似地，可以采用替代的昆虫细胞，比如与Sf9密切相关的SF21和来源于粉纹夜蛾(Trichoplusiani)的HighFive细胞系。更典型地，编码抗原的多核苷酸被引入适合在真核(例如昆虫或哺乳动物细胞)中导入和表达的表达载体。为了利于在选中的载体/宿主细胞中进行表达，这些核酸经过密码子优化(例如，SEQIDNOs:5、7、9、12、13、17、19和21显示的序列是为了在CHO细胞中表达经过密码子优化的)。在一个示范性实施方案中，编码I^reF抗原的多核苷酸序列被引入载体，比如LonzaBiologicals公司开发的pEE14载体。多肽在组成型启动子，比如立即早期CMV(巨细胞病毒)启动子的引导下表达。挑选表达所述多肽的稳定转染细胞是根据转染细胞在没有谷氨酰胺来源的情况下能够生长进行的。被成功引入PEE14的细胞能够在没有外源谷氨酰胺的情况下生长，因为PEE14载体表达GS(谷氨酰胺合成酶)酶。选中的细胞可以经克隆扩增并对所需I^reF多肽的表达进行研究。任选宿主细胞是根据其对插入序列的表达的调控能力或者宿主细胞以预期方式加工表达蛋白的能力来进行挑选的。所述蛋白修饰包括，但不限于糖基化(以及例如乙酰化、羧化、磷酸化、脂化和酰基化)。任选在宿主细胞中进行翻译后加工，例如(由弗林蛋白酶)将蛋白的前体形式切割为成熟形式。不同的宿主细胞，比如313、0)5、010、彻1^、8·、MDCK、293、WI38等有特定的细胞机器和特征性机制进行这类翻译后活动，可供选择以确保导入的外来蛋白的正确修饰和加工。为了长期高产量地生产本文公开的重组抗原，一般使用稳定表达系统。例如，利用表达载体将稳定表达I^reF抗原多肽的细胞系导入宿主细胞，所述表达载体含有病毒复制原点或内源表达元件以及选择性标记基因。导入载体后，细胞在营养培养基中生长1-2天，然后转移到选择性培养基中。选择性标记的目的是赋予抗性以便进行挑选，它的存在保证那些能够成功表达导入序列的细胞的生长和回收。例如，稳定转化细胞的抗性组或菌落可以利用适合该细胞类型的组织培养技术进行增殖。任选在适合编码蛋白的表达并从培养物中回收的条件下培养转化了I^reF抗原编码核酸的宿主细胞。正如以上指出的，如果需要，可以将宿主细胞培养在无血清(和/或无动物产物)的培养基中。在转导合适的宿主细胞系并且宿主细胞生长至合适的细胞密度后，通过适当的手段(例如温度变化或化学诱导)对所选的启动子进行诱导，并将细胞继续培养一段时间。任选地，培养基包含能够减少蛋白酶对表达蛋白的降解的成分和/或添加物。例如，用于培养产生I^reF抗原的细胞的培养基可以包含蛋白酶抑制剂，比如螯合剂或小分子抑制剂(例如AZ11557272、AS111793等)，以便减少或消除细胞内或细胞外(例如基质)蛋白酶的不希望的切割。然后从培养基中回收分泌的多肽产物。替代地，可以通过离心收集细胞，经物理或化学手段破碎，并保留得到的粗提取物进一步纯化。蛋白表达所采用的真核或微生物细胞可以通过任何方便的方法破碎，包括反复冻融、超声波、机械破碎或利用细胞裂解剂或本领域技术人员已知的其他方法。表达的抗原可以通过本领域已知的许多方法中的任何一种从重组细胞培养物中回收和纯化，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、过滤、超滤、离心、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析(例如利用本文提到的任何一种标签系统)、羟磷灰石层析和凝集素层析。如果需要可以利用蛋白重折叠步骤来完成成熟蛋白的构型。最后，在纯化终末步骤中可以采用高效液相层析(HPLC)。除了以上提到的参考文献，许多纯化方法是本领域熟知的，包括例如下述文献中列举的Sandana(1997)BioseparationofProteins,AcademicPress,Inc.；禾口Bollagetal.(1996)ProteinMethods,2-Editionffiley-Liss,NY;ffalker(1996)TheProteinProtocolsHandbookHumanaPress,NJ,HarrisandAngal(1990)ProteinPurificationApplicationsAPracticalApproachIRLPressatOxford,Oxford,U.K.；Scopes(1993)ProteinPurificationPrinciplesandPracticeEditionSpringerVerlag,NY；JansonandRyden(1998)ProteinPurification!Principles,HighResolutionMethodsandApplications,SecondEditionWiley-VCH，NY:以及Walker(1998)ProteinProtocolsonCD-ROMHumanaPress,NJ.。在一个示范性实施方案中，按照以下纯化方案从细胞中回收I^reF蛋白。编码I^reF多肽的重组核酸被导入宿主CHO细胞后，将包含被导入多核苷酸序列的瞬时转染宿主细胞或经过扩增的稳定细胞群生长在培养基中，生长条件适合细胞生长到对所需目的来说可以接受的规模Π列如象Freshney(1994)CultureofAnimalCells,aManualofBasicTechnique,thirdedition,ffiley-Liss,NewYork和其中引用的参考文献中描述的)。一般来说，细胞于37°C生长在摇瓶或生物反应器中的无血清培养基中，以2-3天的间隔进行传代。由在这些条件下扩增的细胞建立起来的新培养物通常在生物反应器中的无血清培养基中于27°C温育5-7天，p02维持在20%，从而产生I^reF抗原。为了回收重组I^reF抗原，将细胞培养物离心，细胞培养物上清液保存在零下70°C以备后用。培养物上清液融化后，上清液用MilliQ水&稀释，并用HCl调节到pH6.0。将稀释后的上清液以75cm/h上样到装在BPG140/500柱子中的3LCMCeramicHyperDFF树脂中，柱子已用20mM磷酸盐(pH6.0)平衡。上样后，用平衡缓冲液过柱以便回到UV基线。用5个柱体积(CV)的25mM磷酸缓冲液(pH7.0)清洗后，用含有0.IMNaCl的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)进行洗脱。CMHyperD洗脱级分用20mM磷酸盐(pH7.0)3.3x稀释，在270ml羟磷灰石II型柱子(装在XK50中)上进行处理，柱子已用20mMPO4(Na)缓冲液(pH7.0)以50mL/min平衡。柱子用平衡缓冲液(3CV)洗后，用含有0.5MNaCl的20mMP04(Na)(pH7.0)进行洗脱。HA洗脱级分以15mL/min(与树脂有10分钟接触时间)上样到150mLCaptoAdhere柱子(装在XK沈中)上进行处理，柱子已用20mM磷酸盐(pH7.0)平衡。用5CV含有0.IM精氨酸缓冲液的IOmM磷酸盐(pH7.0)清洗后，用含有0.6M精氨酸的IOmM磷酸缓冲液(pH7.0)进行洗脱。然后将CaptoAdhere洗脱级分浓缩大约IOx以便在制备性大小排阻层析(SEC)柱上处理。浓缩用50kDPellicon聚醚砜膜进行。在SEC柱子上处理之前，材料经PLAN0VA20NIOOcm2滤器过滤，作为清除病毒的步骤。该纳米过滤步骤可以安排在Pellicon膜浓缩之前或者之后进行。然后用500mLSuperdexS200柱子进行制备SEC，IOmM磷酸盐(Na/K2)、160mMNaCl缓冲液(PH6.5，对应最终缓冲液)作为流动相。将等同5%SEC柱体积的浓缩I^reF以2.6mL/min上样到树脂中。通常收集每份IOmL的级分。如果需要，将级分汇合在一起通过银染和抗HCP(宿主细胞蛋白Western印迹在SDS胶上分析以便优化产量同时减少HCP水平。在0.22μmMillex滤器(替代地可以使用Merivex滤器)上过滤后获得纯化好的批次。如果需要，纯化的I^reF抗原制品在使用前可以保存在-70°C。替代地，PreF蛋白可以包含多聚组氨酸(例如6组氨酸)标签，所述标签可以用于协助纯化。对于这种带组氨酸标签的I^reF多肽，可以采用以下纯化方案。在用固定化金属离子亲和层析(IMAC)进行纯化之前，细胞培养物上清液在缓冲液A(20mmBicine,pH8.5)中稀释两倍，pH调节至8.5。得到的溶液上样到已用缓冲液A平衡好的柱体积23ml的QsepharoseFF柱子(GEHealthcare)上。PreF蛋白与某些宿主细胞杂质一起被捕获到柱子上。可能对IMAC纯化步骤造成干扰的培养基成分没有滞留，而是清除到穿流液中。蛋白通过200mM、400mM、600mM、800mM和IMNaCl逐步洗脱被分开和洗脱。目的PreF蛋白在200mMNaCl的第一个步骤中洗脱。任选地，利用SDSPAGE和Wfestern印迹(用抗His标签的抗体检测带标签的I^reF蛋白)可以监测蛋白回收情况。在继续纯化前可以将级分汇合。(汇合的)含I^reF蛋白的洗脱级分在缓冲液B(20mMBicine、500mMNaCl、pH8.3)中稀释3倍，pH被调节到8.3。得到的溶液上样到加载氯化镍(GEHealthcare)的例如柱体积5ml的已用缓冲液B平衡好的IMACs印haroseFF树脂上。I^reF结合到树脂上，大部分宿主细胞杂质被洗脱到穿流液中。柱子用20mM咪唑清洗以便除去弱结合的杂质。蛋白经250mM咪唑一步洗脱。可以进行考马斯亮蓝染色的SDSPAGE和抗His标签^festern印迹来鉴定阳性级分。由IMAC得到的集合然后可以利用Centricon浓缩装置(Millipore)浓缩到至少150yg/ml的浓度，蛋白在补充有500mML-精氨酸的PBS缓冲液中透析。得到的蛋白用RCDC蛋白检测法(BioRad)定量，并保存在-70或_80°C待用。免疫原件组合物和方法还提供了免疫原性组合物，所述组合物包含任何以上公开的I^reF抗原(比如SEQIDNOs:6、8、10、18、20和22所示范的那些)和药物可接受载体或赋形剂。在某些实施方案中，通常即抗原不包含G蛋白成分的实施方案中(比如SEQIDNO:6)，免疫原性组合物可以包含分离的、重组的和/或纯化的G蛋白。现有技术已描述过许多合适的G蛋白，包括全长重组G蛋白，和由G蛋白的一部分(比如氨基酸128-229或130-230)与融合伙伴(比如硫氧还蛋白)或者信号和/或前导序列(协助表达和/或纯化)组成的嵌合蛋白。与I^reF抗原混合使用的示范性G蛋白可以在W02008114149、美国专利5，149，650、美国专利6，113，911、美国已公开申请20080300382和美国专利7，368，537中找到，这些文献均通过引用并入本文。正如对嵌合I^reF-G蛋白已指出的，更小的G蛋白片段，比如氨基酸149-2之间的部分，或者大约1到大约2之间的部分适合用于包括PreF(没有G)和G的混合物中。正如以上讨论过的，重要的考虑是免疫优势表位的存在，例如在氨基酸183-197区域内包含的表位。替代地，这种组合物中可以采用全长G蛋白。药物可接受载体和赋形剂是公知的，可以由本领域技术人员选择。例如，载体或赋形剂可以有利地包含缓冲液。任选地，载体或赋形剂还含有至少一种稳定溶解度和/或稳定性的成分。助溶/稳定剂的例子包括去污剂，例如月桂肌氨酸和/或Tween。替代的助溶/稳定剂包括精氨酸和玻璃形成多元醇(比如蔗糖、海藻糖等)。大量药物可接受载体和/或药物可接受赋形剂是本领域已知的,在例如Remington'sPharmaceuticalSciences,byΕ.W.Martin,MackPublishingCo.,Easton,PA,5thEdition(975)中有描述。相应地，本领域技术人员可以选择合适的赋形剂和载体来制备适合通过所选给药途径递送给受试对象的制剂。合适的赋形剂包括，但不限于甘油、聚乙二醇(PEG)、山梨醇、海藻糖、N-月桂酰肌氨酸钠盐、L-脯氨酸、非去污的甜菜碱磺酸、盐酸胍、脲、氧化三甲胺、KCl、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Si2+和其他二价阳离子相关盐、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇和β-巯基乙醇。其他赋形剂可以是去污剂(包括Tween80、Tween20、TritonX-00、NP_40、EmpigenBB、辛基葡萄糖苷、月Zwittergent3-08>Zwittergent3-0>Zwittergent3-2>Zwittergent3-4>Zwittergent3_6、CHAPS、脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、溴化十六烷基三甲胺)。任选地，免疫原性组合物还包含佐剂。就适合给予受试对象以便引发抗RSV的保护性免疫反应的免疫原性组合物而言，佐剂的选择要能够引发特征在于产生干扰素-Y(IFN-y)的Thl型或Thl/Th2平衡型免疫反应。通常挑选佐剂以便增强被给予组合物的受试对象或受试对象群体中的Thl型免疫反应(或者作1/1112平衡型免疫反应)，所述免疫反应特征在于0^-^的产生和分泌。例如，当免疫原性组合物是要给予对RSV感染易感(或风险增加)的特定年龄组受试对象时，要挑选对受试对象或受试对象群体安全并有效的佐剂。因此，当配制含有RSV抗原的免疫原性组合物用于老年受试对象(比如超过65岁的受试对象)给药时，挑选在老年受试对象中安全有效的佐剂。类似地，当含有I^reF抗原的免疫原性组合物是要给予新生儿或婴儿受试对象(比如出生到两岁的受试对象)时，挑选在新生儿和婴儿中安全有效的佐齐U。对于挑选在新生儿和婴儿中安全有效的佐剂的情况，佐剂剂量可以选择是通常给予成年受试对象的剂量的稀释液(或分剂量)。此外，一般挑选经免疫原性组合物的给药途径给予时能够增强Thl免疫反应的佐剂。例如，当配制用于经鼻给药的含有I^reF抗原的免疫原性组合物时，蛋白酶体和protollin是合适的Thl偏向型佐剂。相反，当免疫原性组合物配制用于肌内给药时，适合挑选包含3D-MPL、角鲨烯(例如QS21)、脂质体、和/或油和水乳剂中的一种或多种的佐剂。适合与I^reF抗原组合使用的一种佐剂是无毒的细菌脂多糖衍生物。合适的脂质A无毒衍生物的例子是单磷酰脂质A或更具体地说是3-脱酰基单磷酰脂质A(3D-MPL)。3D-MPL由GlaxoSmithKlineBiologicalsN.A.以MPL的名字销售，在本文件中称为MPL或3D-MPL。参见例如，美国专利4，436，727,4,877，611,4,866，034和4，912，094。3D-MPL主要促进有IFN-y(Thl)表现型的CD4+T细胞反应。3D-MPL可以根据GB2220211A中公开的方法生产。从化学上来说，它是带有3、4、5或6个酰基化链的3-脱酰基单磷酰脂质A的混合物。在本发明的组合物中，可以使用小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL的颗粒大小使它能够经0.22μm滤器过滤除菌。W094/21292中描述了这种制剂。脂多糖，比如3D-MPL，在每个人类剂量的免疫原性组合物中可以使用1_50μg。这种3D-MPL可以按大约25μg的水平使用，例如20-30μg，合适的是21-μg或22-μg或23-27μg或M-沈μg，或者25μg。另一个实施方案中，人类剂量的免疫原性组合物中包含大约ομg水平的3D-MPL，例如5-15μg,合适的是6-14μg,例如7-13μg或8-12μg或9-11μg，或者10μg。再一个实施方案中，人类剂量的免疫原性组合物中包含大约5μg水平的3D-MPL，例如1-9μg，或2-8μg，或者合适的是3-7μg或4-μg，或者5μg。在其他实施方案中，脂多糖可以是如美国专利6，005，099和欧洲专利07^47!3B1中描述的β(1-6)葡萄糖胺二糖。本领域技术人员根据这些文献中的教导，很容易制备出各种脂多糖，比如3D-MPL。这些文献均通过引用并入本文。除了以上提到的免疫刺激剂(与LPS或MPL或3D-MPL结构相似的)，是以上MPL结构一部分的酰基化单糖和二糖衍生物也是合适的佐剂。在其他实施方案中，佐剂是脂质A的合成衍生物，其中的某些被描述为TLR-4激动剂，包括但不限于0M174(2-脱氧-6_o-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二酰氧四环-癸酰氨]-4-o-磷酸基-β-D-吡喃葡萄糖基]-2-[(R)-3-羟基十四酰氨]_α-D-吡喃葡萄糖基二氢磷酸酯)，(W095/14026)；OM294DP(3S，9R)-3—[(R)-十二酰氧十四酰氨]-4-氧-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-羟基十四酰氨]癸烷-1，10-二醇1，10-双(二氢磷酸酯)(W099/64301和WO00/0462)；和OM197MP_AcDP(3S-，9R)_3_[(R)-十二酰氧十四酰氨]-4-氧-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰氨]癸烷-1，10-二醇，1-二氢磷酸盐10-(6-氨基己酸酯)(W001/46127)。其他可以使用的TLR4配体是烷基葡萄糖胺磷酸酯(AGPs)，比如W098/50399或美国专利6，303，347(还公开了AGPs的制备过程)中公开的那些，合适的是RC527或RC529或者美国专利6，764，840中公开的AGPs的药物可接受盐。某些AGI3s是TLR4激动剂，某些是TLR4拮抗剂。两种都被认为可以作为佐剂使用。其他能够经由TLR-4引起信号传导反应(Sabroeetal，JI2003pl630_5)的合适的TLR-4配体是例如，来自革兰氏阴性细菌的脂多糖及其衍生物或者它们的片段，特别是LPS的无毒衍生物(比如3D-MPL)。其他合适的TLR激动剂是热震惊蛋白(HSP)10、60、65、70、75或90；表面活性蛋白A、透明质酸寡糖、硫酸肝素片段、纤连蛋白片段、纤维蛋白原肽和b-防御素-2以及胞壁酰二肽(MDP)。在一个实施方案中，TLR激动剂是HSP60、70或90。其他合适的TLR-4配体在WO2003/011223和WO2003/099195中有描述，比如W02003/011223的4_5页或者W02003/099195的3_4页公开的化合物I、化合物II和化合物III，特别是W02003/011223中公开为ER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057、ER804058、ER804059、ER804442、ER804680和ER804764的那些化合物。例如一个合适的TLR-4配体是ER804057。其他TLR激动剂也可以作为佐剂使用。名词“TLR激动剂”是指这样的试剂，所述试剂能够直接作为配体或者通过产生内源或外源配体间接引起经由TLR信号传导途径的信号传导反应。这些天然或合成TLR激动剂可以作为替代的或额外的佐剂使用。Kaisho&Akira,BiochimicaetBiophysicaActal589:1_13，2002中提供了TLRs作为佐剂受体的简短综述。这些潜在的佐剂包括，但不限于TLR2、TLR3、TLR7、TLR8和TLR9的激动齐IJ。相应地，在一个实施方案中，佐剂和免疫原性组合物还包含选自TLR-I激动剂、TLR-2激动剂、TLR-3激动剂、TLR-4激动剂、TLR-5激动剂、TLR-6激动剂、TLR-7激动剂、TLR-8激动齐U、TLR-9激动剂或它们的组合的佐剂。在本发明的一个实施方案中，使用了能够经由TLR-I弓丨起信号传导反应的TLR激动剂。能够经由TLR-I引起信号传导反应的合适的TLR激动剂选自三酰基化脂肽(LPs)；酚溶性modulin；结核分枝杆菌LP；模拟细菌脂蛋白乙酰化氨基端的S_(2，3-双(棕榈酰氧基)-(2-RS)-丙基)-N-棕榈酰-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-0H,三盐酸(Pam3Cys)LP；和来自伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)的OspALP。在替代实施方案中，使用了能够经由TLR-2引起信号传导反应的TLR激动剂。能够经由TLR-2引起信号传导反应的合适的TLR激动剂是来自结核分枝杆菌、伯氏疏螺旋体或苍白螺旋体的脂蛋白、肽聚糖、细菌脂肽；来自包括金黄色葡萄球菌的种的肽聚糖；脂磷壁酸、甘露糖醛酸、奈瑟氏菌孔蛋白、细菌纤毛、耶尔森氏菌毒力因子、CMV毒粒、麻疹病毒血凝素以及来自酵母的酵母聚糖中的一种或多种。在替代实施方案中，使用了能够经由TLR-3弓丨起信号传导反应的TLR激动剂。能够经由TLR-3引起信号传导反应的合适的TLR激动剂是双链RNA(dsRNA)或聚肌胞苷酸(PolyIC)，后者是与病毒感染相关联的分子核酸形式。在替代实施方案中，使用了能够经由TLR-5引起信号传导反应的TLR激动剂。能够经由TLR-5引起信号传导反应的合适的TLR激动剂是细菌鞭毛蛋白。在替代实施方案中，使用了能够经由TLR-6引起信号传导反应的TLR激动剂。能够经由TLR-6引起信号传导反应的合适的TLR激动剂是分枝杆菌脂蛋白、二酰基化LP和酚溶性modulin。其他TLR6激动剂在W02003/043572中有描述。在替代实施方案中，使用了能够经由TLR-7引起信号传导反应的TLR激动剂。能够经由TLR-7引起信号传导反应的合适的TLR激动剂是单链RNA(ssRNA)、洛索立宾(loxoribine，位点N7和C8的鸟嘌呤核苷类似物)或咪唑喹啉化合物或其衍生物。在一个实施方案中，TLR激动剂是咪喹莫特(imiquimod)。其他TLR7激动剂在WO2002/085905中有描述。在替代实施方案中，使用了能够经由TLR-8引起信号传导反应的TLR激动剂。能够经由TLR-8引起信号传导反应的合适的TLR激动剂是单链RNA(ssRNA)、具有抗病毒活性的咪唑喹啉分子，例如雷西莫特(resiquimod，R848)。雷西莫特也能被TLR-7识别。其他可以使用的TLR-8激动剂包括WO2004/071459中描述的那些。在替代实施方案中，使用了能够经由TLR-9弓丨起信号传导反应的TLR激动剂。在一个实施方案中，能够经由TLR-9引起信号传导反应的合适的TLR激动剂是HSP90。替代地，能够经由TLR-9引起信号传导反应的TLR激动剂是细菌或病毒DNA，含有未甲基化的CpG核苷酸的DNA，在特定序列语境中被称为CpG基序。含有CpG的寡核苷酸诱发占优势的Thl反应。这些寡核苷酸是公知的，在例如WO96/02555、WO99/33488以及美国专利6，008，200和5，856，462中有描述。合适的CpG核苷酸是CpG寡核苷酸。用于本发明的免疫原性组合物中的合适寡核苷酸是含有CpG的寡核苷酸，任选含有被至少3个，合适的是至少6个或更多个核苷酸隔开的两个或更多个二核苷酸CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸和后面的鸟嘌呤核苷酸。本发明的CpG寡核苷酸通常是脱氧核苷酸。在特定实施方案中，寡核苷酸中的核苷酸间键合是二硫代磷酸酯，或者合适的是硫代磷酸酯键，虽然磷酸二酯和其他核苷酸间键也在发明的范围内。还包含在本发明范围内的是带有混合的核苷酸间键合的寡核苷酸。生产硫代磷酸寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法在美国专利5，666，153,5,278，302和WO95/26204中有描述。可以与抗原一起用于免疫原性组合物的其他佐剂，例如单独或者与3D-MPL或本文描述的另一种佐剂组合使用的佐剂是皂苷，比如QS21。Lacaille-Dubois,MandWagnerH.(1996.Areviewofthebiologicalandpharmacologicalactivitiesofsaponins.Phytomedicinevol2pp363-386)提供了关于皂苷的教导。皂苷是广泛分布在植物和海洋动物界的类固醇或三萜甙。皂苷的特点是在水中形成摇动时发泡的胶态溶液并能沉淀胆固醇。当皂苷靠近细胞膜时，它们能够在膜上产生孔样结构导致膜破裂。红细胞溶血即是该现象的一个例子，这是某些但并非全部皂苷的属性。皂苷已知可以作为用于系统给药的疫苗中的佐剂。各种皂苷的佐剂和溶血活性已有广泛研究(Lacaille-DuboisandWagner，同前)。例如，QuilA(来源于的树皮南美树种莫利那肥皂草皂树(QuillajaSaponariaMolina))及其组分在US5，057，540和"Saponinsasvaccineadjuvants，，，Kensil,C.R.,CritRevTherDrugCarrierSyst,1996,12(1-2):1-55;以及EP0362279B1中有描述。包含QuilA部分的颗粒结构，被称为免疫刺激复合物(ImmuneStimulatingComplexes,ISC0MS)是溶血性的，已被用于疫苗制备(Morein，B.,EP0109942B1；WO96/11711；WO96/33739)。溶血皂苷QS21和QS17(QuilA的HPLC纯化组分)被描述为强力的系统佐剂，它们的生产方法在美国专利.5，057，540和EP0362279B1中公开，所述专利通过引用并入本文。被用于系统疫苗接种研究的其他皂苷包括来源于其他植物物种，比如丝石竹属(Gypsophila)和肥皂草属(Saponaria)的皂苷(Bomfordetal.,Vaccine,10(9):572-577,1992)。QS21是来源于莫利那肥皂草皂树皮的HPLC纯化的无毒组分。美国专利5，057，540中公开了生产QS21A的方法。含有QS21的非反应性佐剂制剂在WO96/33739中有描述。以上提到的文献通过引用并入本文。所述免疫活性皂苷，比如QS21，在每个免疫原性组合物人类剂量中可以按照1到50μg之间的量使用。有益的是QS21以大约25μg的水平使用，例如20-30μg之间，合适的是21-μg之间或22-μg之间或23-27μg之间或M-沈μg之间，或者是25yg。另一个实施方案中，免疫原性组合物的人类剂量中包含大约IOyg水平的QS21，例如5禾口15μg之间，合适的是6-14μg之间，例如7-13μg之间或8-12μg之间或9-11μg之间，或者是10μg。再一个实施方案中，免疫原性组合物的人类剂量中包含大约5μg水平的QS21，例如1-9μg之间或2-8μg之间，或者合适的是3-7μg或4-6μg之间，或者是5μg。这种包含QS21和胆固醇的制剂已被证实当与抗原一起成剂时是成功的Thl刺激佐剂。因此，例如，PreF多肽适合与包含QS21和胆固醇组合的佐剂一起用于免疫原性组合物中。任选地，佐剂还可以包含矿物盐，比如铝或钙盐，特别是氢氧化铝、磷酸铝和磷酸钙。例如，含有3D-MPL和铝盐(例如氢氧化铝或“明矾”)联用的佐剂适合用于配制给予人受试对象的含有I^reF抗原的免疫原性组合物。另一类适合用于含I^reF抗原的制剂的Thl型佐剂包括基于OMP的免疫刺激组合物。基于OMP的免疫刺激组合物尤其适合作为粘膜佐剂，例如用于鼻内给药。基于OMP的免疫刺激组合物是一类来自革兰氏阴性细菌(包括，但不限于奈瑟氏菌)的外膜蛋白(OMPs，包括某些孔蛋白)制品(参见例如Lowelletal.，J.Exp.Med.167=658,1988；Lowe11etal.，Science240:800，1988；Lynchetal.，Biophys.J.45:104，1984；Lowell,in"NewGenerationVaccines"2nded.,MarcelDekker,Inc.,NewYork,Basil,HongKong,page193，1997；美国专利5，726，292；美国专利4，707，543)，可以作为载体来用或用在免疫原(比如细菌或病毒抗原)组合物中。某些基于OMP的免疫刺激组合物可以称为“蛋白体O^roteosomes)”，它们是疏水的并且人可以安全使用。所述蛋白体有能力自动组装成大约20nm到大约SOOnm的囊泡或囊泡样OMP簇，并与蛋白抗原(Ags)，特别是含有疏水部分的抗原非共价地合并、协作、关联(例如静电地或者疏水地)，或以其他方式合作。任何产生处于囊泡或囊泡样形式中的外膜蛋白成分的制备方法，包括多分子膜结构或者一或多个OMPs构成的熔融球状OM组合物，都包含在蛋白体的定义中。蛋白体可以按照例如现有技术(参见例如美国专利5，726，292或美国专利5，985，观4)的描述制备。蛋白体还可以含有来自制备OMP孔蛋白的细菌(例如奈瑟氏菌)的内源脂多糖或脂肪寡糖(分别是LPS或L0S)，其中脂多糖或脂肪寡糖只占整个OMP制品的2%以下。蛋白体主要由化学提取的脑膜炎奈瑟氏菌的外膜蛋白(OMPs)(主要是孔蛋白A和B以及4型0ΜΡ)组成，利用去污剂保持在溶液中(LowellGH.ProteosomesforImprovedNasal,Oral,orInjectableVaccines.InLevineMM,WoodrowGC,KaperJB,CobonGS,eds,NewGenerationVaccines.NewYork:MarcelDekker,Inc.1997；193-206)。蛋白体可以与多种抗原通过例如渗滤或常规透析过程成剂，所述抗原是例如来自病毒来源的纯化或重组蛋白，包括本文公开的I^reF多肽。逐渐去除去污剂使得形成直径大约100-200nm的颗粒状疏水复合物(LowellGH.ProteosomesforImprovedNasal,Oral,orInjectableVaccines.InLevineMM,WoodrowGC,KaperJB,CobonGS,eds,NewGenerationVaccines.NewYork=MarcelDekker,Inc.1997；193-206)。〃蛋白体LPS或ftOtollin"用于本文是指混合蛋白体制品，例如通过外源添加至少一种脂多糖来提供OMP-LPS组合物(可以作为免疫刺激组合物)。因此OMP-LPS组合物可以由I^rotollin的两种基本成分组成，所述组合物包含(1)由革兰氏阴性菌，比如脑膜炎奈瑟氏菌制备的蛋白体的外膜蛋白制品(例如ftOjimmt)，和(2)—或多种脂多糖的制品。脂肪寡糖可以是内源的(例如OMP蛋白体制品天然含有的)，可以与来自外源制备的脂肪寡糖(例如由与OMP制品来源不同的培养物或微生物制备的)的OMP制品混合或组合，或者可以是它们的组合。这些外源加入的LPS可以与OMP制品来自相同的革兰氏阴性细菌，或者来自不同的革兰氏阴性细菌。Protollin也应被理解为任选包含脂质、糖脂、糖蛋白、小分子等，以及它们的组合。Protollin可以按照例如美国专利申请公开2003/0044425中的描述进行制备。不同佐剂的组合，比如以上提到的佐剂的组合，也可以与I^reF抗原一起用于组合物。例如，正如已经提到的，QS21可以与3D-MPL—起成剂。QS213D-MPL的比率一般在110到101的水平；比如15到51，常常基本是11。通常，比率在2.51到113D-MPLQS21的范围内。另一个组合佐剂制品包含3D-MPL和铝盐，比如氢氧化铝。当组合配制时，这种组合可以增强抗原特异性Thl免疫反应。某些情况中，佐剂制品包含诸如钙或铝盐的矿物质盐，例如磷酸钙、磷酸铝或氢氧化铝。存在铝的情况下，例如与3D-MPL组合的情况，其量一般在每剂大约100μg和Img之间，比如从大约100μg或大约200μg到大约750μg,比如大约500μg。某些实施方案中，佐剂包含油和水乳剂，例如水包油乳剂。水包油乳剂的一个例子是在水性载体中包含可代谢油，比如角鲨烯；母生育酚，比如生育酚，例如α-生育酚；和表面活性剂，比如山梨醇三油酸酯(Span85)或聚环氧乙烷山梨醇单油酸酯(Tween80)。在某些实施方案中，水包油乳剂不含有任何其他免疫刺激剂(特别是不含有无毒脂质A衍生物，比如3D-MPL；或皂苷，比如QS21)。水性载体可以是例如磷酸盐缓冲液。此外，水包油乳剂可以含有span85和/或卵磷脂和/或三辛酸甘油酯。本发明的另一个实施方案中，提供了疫苗组合物。所述疫苗组合物包含抗原或抗原组合物，和包含水包油乳剂的佐剂组合物，以及任选的一或多种其他免疫刺激剂，其中所述水包油乳剂包含0.5-10mg可代谢油(合适的有角鲨烯)、0.5-llmg母生育酚(合适的有生育酚，比如α-生育酚)和0.4-4mg乳化剂。在一个特定实施方案中，佐剂制品包含制备成乳剂，比如水包油乳剂形式的3D-MPL。某些情况中，乳剂颗粒的直径大小如WO94/21292中公开的低于0.2μm。例如，3D-MPL颗粒小到可以经0.22μm膜过滤除菌(如欧洲专利0689454中描述的)。替代地，3D-MPL可以制备成脂质体制剂。任选地，含有3D-MPL(或其衍生物)的佐剂还包含其他免疫刺激成分。选择的佐剂在免疫原性组合物要给予的群体中是安全有效的。对于成年和老年群体，制剂含有的佐剂成分通常比婴儿制剂中的多。在使用水包油乳剂的特定制剂中，所述乳剂可以包含其他成分，例如象胆固醇、角鲨烯、α-生育酚；和/或去污剂，比如Tween80或Span85。在示范性制剂中，这些成分存在的量如下大约l_50mg胆固醇、2-10%角鲨烯、2-10%α-生育酚和0.3-3%Tween80。一般来说，角鲨烯α-生育酚的比率等于或小于1，这样能够提供更稳定的乳剂。某些情况中，制剂还可以含有稳定剂。当含有I^reF多肽抗原的免疫原性组合物是配制用于婴儿给药时，要确定佐剂的剂量在婴儿受试对象中是有效并且相对没有反应性的。通常，婴儿制剂中的佐剂剂量比为成年人(例如65岁及以上的成年人)设计的制剂中使用的量少(例如剂量可能是给予成年人的制剂中提供的剂量的一部分)。例如，3D-MPL在每剂中的量通常在lyg-200yg的范围，比如10-100μg或者10μg-50μg。婴儿剂量一般在该范围的较低一端，例如大约1μg-大约50μg，比如从大约2μg，或大约5μg，或大约10μg到大约25μg或大约50μg。通常，对于制剂中使用了QS21的情况，范围是相当的(并且符合以上指出的比率)。对于油和水乳剂(例如水包油乳剂)的情况，提供给儿童或婴儿的佐剂剂量可以是给予成年人受试对象的剂量的一部分。实施例9提供了免疫原性组合物效力的证明，所述组合物含有PreF抗原组合了不同剂量的示范性水包油佐剂。免疫原性组合物一般含有免疫保护量(或其分剂量)的抗原，并且可以通过常规技术制备。免疫原性组合物，包括要给予人受试对象的那些，它们的制备概括描述于PharmaceuticalBiotechnology,Vol.61VaccineDesign—thesubunitandadjuvantapproach,editedbyPowellandNewman,PlenumPress,1995禾口NewTrendsandDevelopmentsinVaccines,editedbyVolleretal.,UniversityParkPress,Baltimore,Maryland,U.S.A.1978。在脂质体内的包封由例如Fullerton(美国专利4,235,877)描述过。蛋白与大分子的偶联在LiWiite的美国专利4，372，945和Armor等的美国专利4，474，757中有公开。一般来说，每剂免疫原性组合物中的蛋白量选择能够在典型受试对象中诱发免疫保护反应，但没有明显有害副作用的量。这一语境下的免疫保护不一定意味着完全抗感染；它意味着抗某些症状或疾病，特别是抗与病毒关联的严重疾病的保护作用。根据所采用的具体免疫原，抗原的量可能不同。通常，每个人类剂量可以预期包含I-IOOOyg蛋白，比如大约1μg-大约100μg，例如，大约1μg-大约50μg，比如大约1μg、大约2μg、大约5μg、大约10μg、大约15μg、大约20μg、大约25μg、大约30μg、大约40μg或大约50μg。免疫原性组合物中使用的量根据受试对象群体(例如婴儿或老年人)来选择。通过标准研究，包括观察受试对象中的抗体效价和其他反应，可以给特定组合物确定最佳用量。在接受初始疫苗接种后，受试对象可以在大约4周后接受加强剂。应当指出，无论选择了何种佐剂，其在最终制剂中的浓度经计算对目标群体是安全有效的。例如，用于在人中引发抗RSV的免疫反应的免疫原性组合物适合给予婴儿(例如从出生到1岁的婴儿，比如首次给药时年龄为0-6个月)。引发抗RSV的免疫反应的免疫原性组合物也适合给予老年人(例如单独，或者与流感抗原和/或其他COPD相关病原体的抗原联合给药)。可以理解，这些不同应用中可以选择不同佐剂，每种情况的最佳佐剂及其浓度可以由本领域技术人员根据经验决定。在某些实施方案中，免疫原性组合物是能够减少或防止感染RSV的疫苗。某些实施方案中，免疫原性组合物是减少或防止感染RSV后的病理反应的疫苗。任选地，含有I^reF抗原的免疫原性组合物与至少一种来自RSV之外的病原生物体的其他抗原一起成剂。例如，所述病原生物体可以是呼吸道病原体(比如引起呼吸道感染的病毒或细菌)。某些情况中，免疫原性组合物含有来自RSV之外的病原病毒的抗原，所述病毒是比如引起呼吸道感染的病毒，比如流感或副流感病毒。其他实施方案中，可以选择额外的抗原来协助给药或者减少给受试对象提供抗多种感染性生物体的保护作用所需的接种次数。例如，可以使用来源于流感、乙肝、白喉、破伤风、百日咳、流感嗜血杆菌、脊髓灰质炎、链球菌或肺炎球菌等中的任何一种或多种的抗原。相应地，抗原或其编码核酸在制备药物中的用途也是本公开的特征之一，其中所述药物用于接触或感染了RSV(之后治疗性的或者之前预防性的)的治疗。类似地，在受试对象中引发抗RSV的免疫反应的方法也是本公开的特征之一。所述方法包括将免疫有效量的包含I^reF抗原的组合物给予受试对象，比如人受试对象。组合物常常包含能够引发Thl型免疫反应的佐剂。组合物被配制用于引发针对RSV的特异性免疫反应，而不会在接触RSV后加重病毒疾病。这就是说，组合物被配制并且导致Thl型免疫反应，该免疫反应减少或防止感染RSV，和/或减少或防止感染RSV后的病理反应。虽然组合物可以通过多种不同途径进行给药，最经常地，免疫原性组合物经由肌内或鼻内给药途径递送。免疫原性组合物一般含有免疫保护量(或其分剂量)的抗原，并且可以通过常规技术制备。免疫原性组合物，包括要给予人受试对象的那些，它们的制备概括描述于PharmaceuticalBiotechnology,Vol.61VaccineDesign—thesubunitandadjuvantapproach,editedbyPowellandNewman,PlenumPress,1995禾口NewTrendsandDevelopmentsinVaccines,editedbyVolleretal.,UniversityParkPress,Baltimore,Maryland,U.S.A.1978。在脂质体内的包封由例如Fullerton(美国专利4,235,877)描述过。蛋白与大分子的偶联在LiWiite的美国专利4，372，945和Armor等的美国专利4，474，757中有公开。一般来说，每剂免疫原性组合物中的蛋白量选择能够在典型受试对象中诱发免疫保护反应，但没有明显有害副作用的量。这一语境下的免疫保护不一定意味着完全抗感染；它意味着抗某些症状或疾病，特别是抗与病毒关联的严重疾病的保护作用。根据所采用的具体免疫原，抗原的量可能不同。通常，每个人类剂量可以预期包含I-IOOOyg蛋白，比如大约1μg-大约100μg，例如，大约1μg-大约50μg，比如大约1μg、大约2μg、大约5μg、大约10μg、大约15μg、大约20μg、大约25μg、大约30μg、大约40μg或大约50μg。免疫原性组合物中使用的量根据受试对象群体(例如婴儿或老年人)来选择。通过标准研究，包括观察受试对象中的抗体效价和其他反应，可以给特定组合物确定最佳用量。在接受初始疫苗接种后，受试对象可以在大约4-12周后接受加强剂。例如，在将含有I^reF抗原的免疫原性组合物给予婴儿个体时，初始和后续的接种可以与同时期要给予的其他疫苗一起给予。以下实施例仅供阐明某些特定特征和/或实施方案。这些实施例不应被理解为使发明限于所描述的特定特征或实施方案。实施例实施例1示范性PreF抗原基于这样一个预测，即针对F蛋白的融合前构象产生的免疫反应优先包含的抗体能够防止膜融合所涉及的结合、构象转换和/或其他事件，从而提高了保护性反应的效力，因此为了将蛋白稳定在它的融合前构象，对I^reF抗原相对天然RSVF蛋白进行了修饰。图IA和B示意了RSVFO和示范性I^reF重组抗原的特性。图IA代表了RSVFO蛋白。FO是由574个氨基酸组成的前蛋白。FO前蛋白在翻译后被蛋白水解加工和糖基化。信号肽(后来被信号肽酶去除)将FO前蛋白的翻译定靶到内质网(RE)上进行。RE中的新生肽然后在多个位点(以三角形代表)被N-糖基化。弗林蛋白酶对FO的切割产生F2和Fl肽结构域，它们折叠并一起组装成F2-F1异质二聚体的三聚体(即，3份F2-F1)。在天然状态下，F蛋白通过其C端区域内的跨膜螺旋锚定在膜上。FO多肽的其他特性包括15个半胱氨酸、4个已被研究的中和表位、2个卷曲螺旋区和脂化基序。图IB显示了示范性抗原的特性。为了构建I^reF抗原，对FO多肽进行了修饰以便稳定F蛋白的融合前构象，从而保留F蛋白的优势免疫原表位，所述优势免疫原表位即是RSV病毒在与宿主细胞结合并融合前呈递的表位。相对FO多肽，向抗原中引入了以下稳定突变。首先，在FO多肽胞外结构域的C末端放置一个稳定卷曲螺旋结构域来代替FO的膜锚定结构域。其次，去除pep27肽(在天然蛋白中位于F2和Fl结构域之间)。第三，将两个弗林蛋白酶基序都除去。在替代的实施方案(命名为I^reFJl和ft~eF_V2)中，给C端结构域添加了RSVG蛋白的免疫活性部分(例如氨基酸149-229)。其他实施方案中，引入修饰来改变糖基化和/或减少弗林蛋白酶之外的蛋白酶的切割。实施例2从CHO细胞产牛和纯化PreF重组蛋白编码示范性I^reF抗原的重组多核苷酸序列被导入宿主CHO细胞进行I^reF抗原的产生。将包含被导入多核苷酸序列的瞬时转染宿主细胞或经过扩增的稳定细胞群生长在培养基中，生长条件适合细胞生长到对所需目的来说可以接受的规模(例如象Freshney(1994)CultureofAnimalCells,aManualofBasicTechnique,thirdedition,ffiley-Liss,New^rk及其中引用的参考文献概括描述的)。一般来说，细胞于37°C,5%CO2下生长在摇瓶中的无血清培养基中，以2-3天的间隔进行传代，或者在生物反应器中于生长，p02维持在20%。为了回收重组I^reF抗原，将细胞培养物离心，细胞培养物的上清保存在大约-80°C待用。对于进一步分析，取两升细胞培养物上清液用纯化水&稀释，用NaOH调节pH9.5。上清液以Hml/min的速度上样到已用20mM哌嗪(pH9.5)平衡过的QSepharoseFF离子交换柱(60ml，11.3cm)中。柱子用出发缓冲液洗后，用20柱体积的NaCl进行洗脱，NaCl梯度在0-0.5M(级分大小IOml)。级分在SDSPAGE胶上通过银染和^festern印迹分析。然后将含有I^reF蛋白的级分汇合做进一步处理。汇合的Q步骤洗脱级分(130mls)用Millipore的带有PellliconXLPESBiomax100(丽CO10，OOODa)膜盒的TFF系统经缓冲液交换到IOmM硫酸盐(pH7.0)中。得到的材料PH为7.0，电导率为1.8mS/cm。取IOOml该样品以5ml/min上样到用IOmMPO4(Na)缓冲液(pH7.0)平衡好的IOml羟基磷灰石II型(HATII)胶(XK16，高度=5cm)中。柱子用出发缓冲液洗后，以20柱体积的IOmM到200mMP04(Na)(pH7.0)进行梯度洗脱。再次在SDSPAGE上通过银染和考马斯亮蓝分析级分，合并阳性的级分。亲和层析后，用Vivaspin20浓缩单元，10，OOODaMWCO将合并的级分浓缩并将缓冲液交换为DPBS(pH7.4)。终产物大约13ml。蛋白浓度经Lowry分析法检测为195μg/ml。纯度大于95%。该纯化的I^reF抗原制品经过滤除菌，保存在-20°C待用。实施例3:CH0细胞中产生的PreF重组蛋白的表征在CHO细胞中产生的I^reF重组蛋白通过非对称场流分离(AFF-MALS)分析并与包含RSVF和G蛋白成分的嵌合抗原进行比较。AFF-MALS允许在最小的基质相互作用情况下，根据分子大小将液流中的蛋白种类分开，并通过多角度光散射进一步分析确定分子量。图2A显示纯化的TO物质在最终的PBS缓冲液中65%以上处于高分子量寡聚物(1000-100000KDa)，只有3%保持单体形式。图2B显示纯化的I^reF蛋白在PBS缓冲液中73%折叠成三聚体形式。物质的10%处于1000到20000KDa的寡聚物。这些结果表明CHO细胞中表达的重组I^reF蛋白和天然状态预期的一样折叠成三聚体。纯化的I^reF蛋白还与戊二醛交联，其双重目的是确认蛋白在磷酸缓冲液中的溶解性和形成与re蛋白进行体内评估比较的凝聚物(见以下实施例7)。已知戊二醛交联能够很好地评估蛋白质的四级结构，在Biochemistry，3610230-10239(1997)和Eur.J.Biochem.，271:4284-4292(2004)中有描述。蛋白与1%、2%和5%戊二醛交联剂于4°C温育4小时，加入NaBH4阻断反应。过多的戊二醛通过PBS缓冲液脱盐柱去除。得到的蛋白经^Onm的吸光度定量，通过变性还原条件下的SDSPAGE评估。确认大部分纯化重组I^reF在PBS溶液中以三聚体迁移。SDSPAGE证实需要将温育温度提高到23°C，才能将大部分三聚体蛋白转化为高分子量的凝聚物。实施例4:PreF抗原引起的体外中和抑制通过ELISA筛选来自志愿者的人血清的抗RSVA反应性，用于中和抑制(Ni)检验法，血清的相对稀释度是根据以前给每个血清样品建立的可能RSV中和滴度确定的。简单来说，血清与浓度为25μg/ml的抑制蛋白TreF或对照蛋白，后者基本对应美国专利5，194，595中公开的命名为Rixre的嵌合TO)在含有50%199-H培养基、0.5%FBS、2mM谷氨酰胺、50μg/mlgenamycin(全部购自Invitrogen)的DMEM中混合，于37°C在回转轮上温育1.5到2小时。取20μ1血清和蛋白的梯度稀释液在圆底96孔板中与RSVA混合，为了优化每个血清样品的抑制范围所述RSVA已进行了滴定。得到的混合液于33°C在5%CO2(为了维持pH)下温育20分钟。然后将血清-抑制剂-病毒混合液移入预先接种了Vero细胞的平底96孔板，于33°C温育2小时，然后加入160μ1培养基。培养板继续在33°C，5%C02下温育5_6天，直至进行NI滴度检测的免疫荧光试验。用溶于磷酸缓冲液(PBS)的仲甲醛固定1小时后，培养板用2%牛奶/PBS和封闭缓冲液封闭。每孔加入山羊抗RSV抗体(BiodesignInternation；1400)，不经清洗于室温(RT)温育2小时。样品用PBS洗2次，向孔中加入溶于封闭缓冲液的抗山羊IgG-FITC(Sigma;1400)。培养板再在RT温育2小时，同上洗2次，然后读数。检测到彡1的荧光合胞体时，孔被认为是阳性的。利用Spearman-Karber(SK)方法计算50%组织培养感染剂量(TCID50)，NI百分比计算为[(0yg/ml抑制蛋白的中和效价-25μg/ml抑制蛋白的中和效价)/0μg/ml抑制蛋白的中和效价]X100。图3显示的示范性结果表明在测试的21个供体中，16个I^reF的NI比TO的高。实施例5:PreF抗原是具有免疫原性的为了证实I^reF抗原的免疫原性，小鼠间隔两周IM免疫两次，免疫使用preF(6.5、3.1、0·63,0.13和0.025μg/ml)和1/20人剂量的含有3DMPL和QS21的Thl佐剂(“AS01E”)，或者preF(l、0.2和0.04μg/ml)和1/10人剂量的含有3DMPL和铝的Thl佐剂(“AS04C”)，三周后收集血清。根据标准程序，通过ELISA对汇合的血清样品确定抗原特异性IgG抗体效价。简单来说，96孔板包埋纯化的灭活RSVA、RSVB和同源preF蛋白，并于4°C温育过夜。血清样品在封闭缓冲液中梯度稀释，开始是原始浓度的150，还有出发浓度为200ng/ml的纯化的小鼠IgG(Sigma,ON)，室温温育2小时。用偶联辣根过氧化物酶(HRP)的抗小鼠IgG(Sigma,ON)检测结合的抗体。3，3A，5，5A-四甲基联苯胺(TMB,BDOptEIATM,BDBiosciences,ON)用作HRP的底物。每孔加入50μ1IMH2S04来终止反应。每孔450nm处的吸光值用MolecularDevices微量培养板读板仪(MolecularDevices,USA)检测。图4A和4B描述的代表性结果显示用preF抗原免疫后，引发了抗RSVA和RSVB的强效价。实施例6=PreF引发中和抗体评估了小鼠血清样品中和抗体的存在和量，所述小鼠按照以上实施例5中的描述免疫。来自免疫动物的汇合血清从18的出发稀释度开始在96孔板的RSV培养基中梯度稀释ΟΟμΙ/well)。对照孔仅含有RSV培养基，或者150的山羊抗RSV抗体(Biodesigninternational)。代表性RSVA或B株的500-1000感染剂量加到孔中，培养板在33°C，5%0)2温育20分钟，然后将混合液转移到预先接种了IxlO5细胞/mLVero细胞的96孔平底培养板中。细胞在33°C，5%CO2温育大约2小时，补充培养基，然后在相同的温度下温育5-6天。除去上清液，培养板用PBS清洗，用1%溶于PBS的仲甲醛将附着的细胞固定1小时，然后进行间接免疫荧光(IFA)分析，用山羊抗RSV—抗和抗山羊IgG-FITC检测。图5A和5B分别显示的代表性结果表明在用preF免疫过的动物的血清中检测到了抗两种RSV株的显著中和抗体。实施例7=PreF提供抗RSV攻击的保护小鼠如上所述以两周间隔IM免疫两次，第二次注射三周后用RSVA攻击。通过测量攻击后肺中存在的病毒来评价抗RSV的保护作用。简单来说，麻醉后无菌取出免疫动物的肺，在15ml管中用两个体积的IOml/肺的RSV培养基中洗。然后将肺称重，各用自动Potter勻浆仪(Fisher，N印ean0N)在RSV培养基中勻浆，于4°C以^55xg离心2分钟。上清液中存在的病毒通过梯度稀释(8个重复，从110开始)到96孔板中预先接种的Vero细胞(ATCC#CCL-81)单层上并温育6天来测定滴度。在1%仲甲醛/PBS(pH7.2)中固定后，用山羊抗RSV—抗和标记FITC的抗山羊IgG二抗通过间接IFA检测RSV。图6A和B显示的代表性结果表明在有佐剂的情况下，给予等于或高于0.04μg的剂量引发了抗RSV的强保护作用。实施例8=PreF不会诱发攻击后肺嗜酸性粒细胞的募集为了评估抗原在进行免疫和之后的攻击后激发加重的疾病的可能性，小鼠组(5只小鼠/组)各用(a)IOyg戊二醛处理的preF、(b)IOygpreF或(c)IOyg不含佐剂的TO免疫两次。加强剂后3周用RSVA攻击小鼠，攻击后的第4天进行支气管肺泡灌洗(BAL)。根据巨噬细胞/单核细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞和淋巴细胞的细胞形态，进行了每个小鼠BAL中总的白血病浸润枚举以及差异枚举(300个细胞)。给每只动物总细胞数量乘上嗜酸粒细胞的差异百分比。代表的是每组的几何平均值，置信界限为95%。图7显示的代表性结果表明preF免疫和攻击后，嗜酸粒细胞没有被募集到肺中。此外，这些结果表明preF抗原的可溶性质，与特意使之凝集的preF形式(戊二醛处理)或re抗原(天然凝聚的)相比，并不更偏爱嗜酸粒细胞。实施例9与水包油乳剂佐剂稀释液一起成剂的PreF抗原的免疫原件小鼠接受与示范性水包油佐剂一起成剂的250ngpreF，所述佐剂是人“完全”剂量(AS03A，10.70mg角鲨烯、11.88mgDL-α-生育酚、4.85mg聚山梨醇酯80)的1/10(AS03A)、1/2剂量(AS(XBB)、1/4剂量(AS03C)或没有佐剂。对照小鼠只接受AS03A或PBS。小鼠在第0和第14天被免疫。第39天(第2剂后15天)进行血液、肾细胞采集和攻击。攻击后4天将肺勻浆进行RSV滴定。抗原特异性IgG抗体效价通过ELISA给各个血清样品确定。简单来说，96孔板用纯化的灭活RSVA包埋，于4°C温育过夜。血清样品从1200开始在封闭缓冲液中梯度稀释，和出发浓度为200ng/ml的纯化小鼠IgG(Sigma，ON)—起，于37°C温育2小时。用偶联辣根过氧化物酶(HRP)的抗小鼠IgG(Sigma，ON)检测结合的抗体。3，3A，5，5A-四甲基联苯胺(TMB,BDOptEIATMjBDBiosciences,ON)用作HRP的底物。每孔加入50μ11MH2S04来终止反应。每孔450nm处的吸光值用MolecularDevices微量培养板读板仪(MolecularDevices,USA)检测。结果如图8所示。在来自用preF组合AS03A、AS0!3B或AS03C免疫的小鼠的血清中，观察到浓度大约250，000ng/mL的抗RSVIgG,而在来自只用preF免疫的小鼠的血清中观察到很少(1^8ng/ml)。来自免疫动物的汇合血清从18的稀释度开始在96孔板RSV培养基中梯度稀释(20μ1/孔)。对照孔仅含有RSV培养基或者150的山羊抗RSV抗体(Biodesigninternational)。加入RSVLong株，培养板在33°C温育20分钟，混合液转移到预先接种IxlO5细胞/mLVero细胞的96孔平底板中。相同温度温育5-6天后，移去上清液；培养板用PBS洗，附着的细胞用溶于PBS的仲甲醛固定1小时，然后进行间接免疫荧光(IFA)。图9显示，无论与preF联合给予的AS03的量是多少，RSV中和抗体效价保持一致(lllog2)，而免疫没有用AS03的小鼠中RSV中和抗体效价显著低(61og2)。将免疫动物麻醉后无菌取肺，在2个体积IOml/肺的RSV培养基在15ml管中洗。然后将它们称重，用自动Potter勻浆仪(Fisher，NepeanON)在RSV培养基中分别勻浆，于41在沈55秘离心2分钟。滴定上清液中存在的病毒。简单来说，肺勻浆以8个重复从110开始梯度稀释到96孔板中预先接种的Vero细胞(ATCC#CCL-81)单层上，温育5-6天。RSV通过间接IFA检测。图10显示的结果表明，用preF组合AS03A、AS0;3B或AS03C免疫的小鼠中观察到的保护作用没有差别，而免疫没有使用AS03的小鼠中观察到的保护作用较少。这些结果显示抗原可以与浓度范围很广的佐剂共同配制产生能够引发抗RSV的免疫反应的组合物。序列表SEQIDNO1编码RSV参照融合蛋白的核苷酸序列A2株GenBank登录号U50362atggagttgctaatcctcaaagcaaatgcaattaccacaatcctcactgcagtcacatttgttttgcttctggtcaaaacatcactgaagaattttatcaatcaacatgcagtgcagtagcaaaggctatcttagtgctctgagaactggttggtataccagtgttataactatagattaagtaatatcaaggaaaataagtgtaatggaacagatgctaaggtaaaattgataaacaagaattagataaatataaaaatgctgtaacagaattgcagttgctcatgcaaagcacccagcaacaaacaatcgagccagaagagaactaccaaggtttatgaattatacactcaaaatgccaaaaaaaccaatgtaacattaagcaagaaaaggaaaagaagatttcttggtttttgttaggtgttggatctgcaatcgccagtggcgttgctgtatctaaggtcctgcacctgaaggggaagtgaacaagatcaaaagtgctctactatccacaaacaaggctgtagtcagttatcaaatggagttagtgtcttaaccagcaaagtgttagacctcaaaaactatatagaaaacaattgttacctattgtgaacaagcaaagctgcagcatatcaaatatagcaactgtatagagttccaacaaaagaacaacagactactagagattaccagggaatttagtgttaagcaggtgtaactacacctgtaagcacttacatgttaactaatagtgaattattgtcattatcaatgatatgcctataacaaatgatcagaaaaagttaatgtccaacaatgttcaaatgttagacagcaaagttactctatcatgtccataataaaagaggaagtcttagcatatgtgtacaattaccactatatggtgttatagatacaccctgttggaaactacacacatccccctatgtacaaccaacacaaaagaagggtccaacatctgtttaacaagaactgacagaggtggtactgtgacaatgcaggatcagtatctttcttcccacaagctgaaacatgtaaagtcaatcaaatcgagtattttgtgacacaatgaacagtttaacattaccaagtgaagtaaactctgcaatgttgacatattcaaccccaaatatgattgtaaaattatgacttcaaaaacgatgtaagcagctccgttatcacatctctaggagccattgtgtcatgctatggcaaaacaaatgtacagcatccaataaaaatcgtggaatcataaagacattttctaacgggtgcgatatgtatcaaataaaggggtggacactgtgtctgtaggtaacacattatattatgtaaaaagcaagaaggtaaaagtctctatgtaaaaggtgaaccaataataaatttctatgacccttagtattcccctctgatgaatttgatgcatcaatatctcaagtcaacgagaagattaacagagcctagcatttattcgtaaa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agctggacaagtacaagagcgccgtgaccgaactccagctgctgatgcagtccacccctgccaccaacaacaagtttctgggcttcctgcagggcgtgggctccgccatcgcctccggcatcgccgtgagcaaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagagcgccctgctgtccaccaacaaggccgtggtgtccctgtccaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcctatcgtgaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagaccgtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggagatcacccgcgagttctccgtgaacgccggcgtgaccacccctgtgtccacctacatgctgaccaactccgagctgctgtccctgatcaacgacatgcctatcaccaacgaccagaaaaaactgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagtcctacagcatcatgagcatcatcaaggaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccttgctggaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaaggagggctccaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgacaacgccggctccgtgtccttcttccctctggccgagacctgcaaggtgcagtccaaccgggtgttctgcgacaccatgaactccctgaccctgccttccgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgaccagcaagaccgacgtgtcctccagcgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcctccaacaagaaccggggaatcatcaagaccttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtggacaccgtgtccgtgggcaacacactgtactacgtgaataagcaggagggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcctatcatcaacttctacgaccctctggtgttcccttccgacgagttcgacgcctccatcagccaggtgaacgagaagatcaaccagtccctggcctteatccggaagtccgacgagaagctgcataacgtggaggacaagatcgaggagatcctgtccaaaatctaccacatcgagaacgagatcgcccggatcaagaagctgatcggcgaggccSEQIDNO:20PreF_L112Q的氨基酸序列MELLILKTNAITAILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKSAVTELQLLMQSTPATNNKFLGFLQGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPLAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEKLHNVEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEASEQIDNO:21编码PreF_NGTL_Ll12Q的核苷酸序列atggagctgctgatcctgaaaaccaacgccatcaccgccatcctggccgccgtgaccctgtgcttcgcctcctcccagaacatcaccgaggagttctaccagtccacctgctccgccgtgtccaagggctacctgtccgccctgcggaccggctggtacacctccgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaggtgaagctgatcaagcaggagctggacaagtacaagagcgccgtgaccgaactccagctgctgatgcagtccacccctgccaccaacaacaagtttctgggcttcctgcagggcgtgggctccgccatcgcctccggcatcgccgtgagcaaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagagcgccctgctgtccaccaacaaggccgtggtgtccctgtccaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcctatcgtgaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagaccgtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggagatcacccgcgagttctccgtgaacgccggcgtgaccacccctgtgtccacctacatgctgaccaactccgagctgctgtccctgatcaacgacatgcctatcaccaacgaccagaaaaaactgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagtcctacagcatcatgagcatcatcaaggaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccttgctggaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaaggagggctccaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgacaacgccggctccgtgtccttcttccctctggccgagacctgcaaggtgcagtccaaccgggtgttctgcgacaccatgaactccctgaccctgccttccgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgaccagcaagaccgacgtgtcctccagcgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcctccaacaagaaccggggaatcatcaagaccttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtggacaccgtgtccgtgggcaacacactgtactacgtgaataagcaggagggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcctatcatcaacttctacgaccctctggtgttcccttccgacgagttcgacgcctccatcagccaggtgaacgagaagatcaacgggaccctggccttcatccggaagtccgacgagaagctgcataacgtggaggacaagatcgaggagatcctgtccaaaatctaccacatcgagaacgagatcgcccggatcaagaagctgatcggcgaggccSEQIDNO:22PreF_NGTL_L112Q的氨基酸序列MELLILKTNAITAILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKSAVTELQLLMQSTPATNNKFLGFLQGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPLAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINGTLAFIRKSDEKLHNVEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEA权利要求1.重组呼吸道合胞病毒(RSV)抗原，其包含含有RSVF蛋白多肽的F2结构域和F1结构域的可溶性F蛋白多肽，其中所述F蛋白多肽包含至少一个使糖基化改变的修饰。2.权利要求1所述的重组RSV抗原，其中所述F蛋白多肽包含至少一个选自下述的修饰(i)添加包含异源三聚化结构域的氨基酸序列；()缺失至少一个弗林蛋白酶切割位点；(iii)缺失至少一个非弗林蛋白酶的切割位点；(iv)缺失ρ印27结构域的一或多个氨基酸；和(ν)在F蛋白胞外结构域的疏水结构域中取代或添加至少一个亲水氨基酸。3.权利要求1所述的重组RSV抗原，其中所述使糖基化改变的修饰包含取代一或多个氨基酸，所述一或多个氨基酸包含和/或邻接对应SEQIDNO2中位点500的氨基酸。4.权利要求1或3所述的重组RSV抗原，其中对应SEQIDNO2中位点500-502的氨基酸选自NGS、NKS、NGT、NKT。5.权利要求1-4中任一项所述的重组RSV抗原，其中所述使糖基化改变的修饰包含谷氨酰胺取代，是在对应SEQIDNO2中位点500的氨基酸处的取代。6.权利要求1-5中任一项所述的重组RSV抗原，其中可溶性F蛋白多肽在F2结构域和Fl结构域之间包含完整的融合肽。7.权利要求1-6中任一项所述的重组RSV抗原，其中所述至少一个修饰包含添加含有异源三聚化结构域的氨基酸序列。8.权利要求7所述的重组RSV抗原，其中所述异源三聚化结构域被定位到Fl结构域的C端。9.权利要求1-8中任一项所述的重组RSV抗原，其包含F2结构域和Fl结构域，而没有居中的弗林蛋白酶切割位点。10.权利要求1-9中任一项所述的重组RSV抗原，其中所述RSV抗原组装成多聚体。11.权利要求1-10中任一项所述的重组RSV抗原，其中所述RSV抗原组装成三聚体。12.权利要求1-11中任一项所述的重组RSV抗原，其中&结构域包含对应SEQIDNO:2的参照F蛋白前体多肽(ig中氨基酸沈-105的RSVF蛋白多肽的至少一部分。13.权利要求1-12中任一项所述的重组RSV抗原，其中F1结构域包含对应SEQIDNO:2的参照F蛋白前体多肽(ig中氨基酸137-516的RSVF蛋白多肽的至少一部分。14.权利要求1-13中任一项所述的重组RSV抗原，其中F2结构域包含对应SEQIDNO:2的参照F蛋白前体多肽(Ftl)中氨基酸沈-105的RSVF蛋白多肽，和/或F1结构域包含对应SEQIDNO2的参照F蛋白前体多肽(F。)中氨基酸137-516的RSVF蛋白多肽。15.权利要求1-14中任一项所述的重组RSV抗原，其中所述RSV抗原选自a)包含SEQIDNO22的多肽；b)SEQIDNO:21编码的或者与SEQIDNO:21在严紧条件下基本全长杂交的多核苷酸序列编码的多肽；c)与SEQIDNO22有至少95%序列同一性的多肽。16.权利要求1-15中任一项所述的重组RSV抗原，其中F2结构域包含RSVF蛋白多肽的氨基酸1-105。17.结构域带有完整的融合肽，但没有居中的pep27结构域。18.权利要求1-17中任一项所述的重组RSV抗原，其中所述异源三聚化结构域包含卷曲螺旋结构域。19.权利要求18所述的重组RSV抗原，其中所述多聚化结构域包含异亮氨酸拉链。20.权利要求19所述的重组RSV抗原，其中所述异亮氨酸拉锁结构域包含SEQIDNO11的氨基酸序列。21.权利要求1-20中任一项所述的重组RSV抗原，其中所述RSV抗原在F蛋白胞外结构域的疏水结构域中包含至少一个亲水氨基酸取代或添加。22.权利要求21所述的重组RSV抗原，其中所述疏水结构域是F蛋白胞外结构域的HRB卷曲螺旋结构域。23.权利要求22所述的重组RSV抗原，其中所述HRB卷曲螺旋结构域包含在对应SEQIDNO2的参照F蛋白前体(Ftl)中氨基酸512的位点上带电荷残基取代中性残基。24.权利要求23所述的RSV抗原，其中HRB卷曲螺旋结构域包含在对应SEQIDNO2的参照F蛋白前体(Ftl)中氨基酸512的位点上赖氨酸或谷氨酰胺取代亮氨酸。25.权利要求21所述的重组RSV抗原，其中所述疏水结构域是F蛋白胞外结构域的HRA结构域。26.权利要求25所述的重组RSV抗原，其中HRA结构域包含在对应SEQIDNO2的参照F蛋白前体(Ftl)中氨基酸105的位点后添加带电荷的残基。27.权利要求沈所述的重组RSV抗原，其中HRA结构域包含在对应SEQIDNO2的参照F蛋白前体(！^中氨基酸105的位点后添加赖氨酸。28.权利要求21-27中任一项所述的重组RSV抗原，其中所述RSV抗原在F蛋白胞外结构域的HRA结构域中至少包含亲水氨基酸的第一取代或添加；在HRB结构域中至少包含亲水氨基酸的第二取代或添加。29.权利要求1-中任一项所述的重组RSV抗原，其中所述RSV抗原包含消除天然F蛋白前体(Ftl)中存在的弗林蛋白酶切割位点的至少一个氨基酸添加、缺失或取代。30.权利要求四所述的重组RSV抗原，其中所述RSV抗原包含氨基酸添加、缺失或取代，这些修饰消除了对应SEQIDNO2的参照F蛋白前体中氨基酸105-109的位点上的，对应氨基酸133-136的位点上的，或者对应氨基酸105-109和133-136这两个位点上的弗林蛋白酶切割位点。31.权利要求1-30中任一项所述的重组RSV抗原，其中F1和F2多肽结构域的序列对应RSVALong株的序列。32.权利要求1-31中任一项所述的重组RSV抗原，其中所述RSV抗原包含多肽的多聚体。33.权利要求1-31中任一项所述的重组RSV抗原，其中所述RSV抗原包含多肽的三聚体。34.免疫原性组合物，其包含权利要求1-33中任一项所述的重组RSV抗原，和药物可接受载体或赋形剂。35.权利要求34所述的免疫原性组合物，还包含佐剂。36.权利要求35所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含3D-MPL、QS21、水包油乳剂和明矾(Alum)中的至少一个。37.权利要求36所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含水包油乳剂。38.权利要求36或37所述的免疫原性组合物，其中所述水包油乳剂包含母生育酚。39.权利要求36-38中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述水包油乳剂每个人类剂量中包含低于5mg的角鲨烯。40.权利要求35-39中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂适合给予新生儿。41.权利要求34-40中任一项所述的免疫原性组合物，其中当免疫原性组合物包含权利要求1-33中任一项所述的重组RSV抗原时，所述免疫原性组合物还包含G蛋白多肽，所述G蛋白多肽含有对应RSVG蛋白多肽中氨基酸位点149-2的氨基酸序列。42.权利要求34-41中任一项所述的免疫原性组合物，还包含除RSV之外的病原生物体的至少一种其他抗原。43.重组核酸，包含编码权利要求1-33中任一项所述的重组RSV抗原的多核苷酸序列。44.权利要求43所述的重组核酸，其中所述编码RSV抗原的多核苷酸序列为了在选定的宿主细胞中表达进行了密码子优化。45.权利要求43或44所述的重组核酸，其中所述核酸包含选自以下的多核苷酸序列a)包含SEQIDN0:21的多核苷酸序列；b)编码SEQIDNO22的多核苷酸序列；c)与SEQIDNO21在严紧条件下基本全长杂交的多核苷酸序列；d)与SEQIDNO:21有至少95%序列同一性的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列不对应天然RSV株。46.载体，所述载体包含权利要求43-45中任一项所述的重组核酸。47.宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求43或44所述的核酸或者权利要求46所述的载体。48.权利要求1-33中任一项所述的RSV抗原在制备治疗RSV感染的药物中的用途。49.权利要求48所述的RSV抗原或核酸的用途，其中所述药物为了预防性治疗RSV感染而给药。50.引发抗呼吸道合胞病毒(RSV)的免疫反应的方法，所述方法包括将包含权利要求1-33中任一项所述的重组RSV抗原的组合物或者权利要求34-42中任一项所述的免疫原性组合物给予受试对象。51.权利要求50所述的方法，其中给予包含RSV抗原的组合物引发了RSV特异性免疫反应，但不会在接触RSV后加重病毒性疾病。52.权利要求50或51所述的方法，其中所述免疫反应包括保护性免疫反应，其减少或防止感染RSV和/或减少或防止感染RSV后的病理反应。53.权利要求50-52中任一项所述的方法，其中所述受试对象是人受试对象。54.权利要求1-33中任一项所述的重组RSV抗原或权利要求34-42中任一项所述的免疫原性组合物用于医药。55.权利要求1-33中任一项所述的重组RSV抗原或权利要求34-42中任一项所述的免疫原性组合物用于防止或治疗RSV相关疾病。56.产生糖基化模式被改变的重组RSV抗原的方法，所述方法包括(i)在宿主细胞中表达权利要求43-45中任一项所述的核酸；和(ii)分离由此表达的重组RSV抗原。57.提高RSV融合蛋白多肽的表达的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达编码RSV融合蛋白多肽的核酸，所述核酸包含会产生氨基酸添加、缺失或取代的至少一个突变，其中所述氨基酸添加、缺失或取代使得所编码的RSV融合蛋白多肽与天然RSV融合蛋白相比，改变了的糖基化位点，从而改变了糖基化位点的RSV融合蛋白多肽，与不含所述氨基酸添加、缺失或取代的RSV融合蛋白相比，表达被提高。58.权利要求57所述的方法，其中编码RSV融合蛋白多肽的核酸还包含其他突变，所述突变产生的氨基酸添加、缺失或取代能够消除所编码的RSV融合蛋白多肽中的肽酶切割位点ο59.权利要求57或58所述的方法，其中RSV融合蛋白多肽是被稳定在融合前构象中的重组融合蛋白多肽。全文摘要本公开提供了重组呼吸道合胞病毒(RSV)抗原及其制备和使用方法，包括用于治疗和/或防止RSV感染的免疫原性组合物(例如疫苗)。文档编号A61K39/155GK102481359SQ201080037770公开日2012年5月30日申请日期2010年6月24日优先权日2009年6月24日发明者G·J·M·F·P·鲍杜克斯,J·L·鲁尔,N·布莱斯,P·雷奥尔特,S·L·西尔申请人:葛兰素史密斯克莱生物公司,魁北克益得生物医学公司