专利名称：用于恙虫病诊断的重组抗原及其快速诊断的试纸的制作方法
技术领域：
本发明涉及疾病诊断的抗原，具体说是一种用于恙虫病诊断的重组抗原及其快速诊断的试纸。
恙虫病的临床症状中，虫咬溃疡是其特异性的体征，但由于虫咬溃疡大都部位隐蔽，数量少，对其检出率的报道各地差异较大，因此必须辅以实验室检查以便及时确诊。恙虫病东方体是严格的专性细胞内寄生的微生物，繁殖慢，纯化繁琐，因而难以获得大量纯化的恙虫病东方体抗原，限制了检验方法的发展。传统的诊断方法，如外斐氏试验(Weil-Felix test)、免疫过氧化物酶试验(IIP)、间接免疫荧光抗体检测(IFAT)等，均以血清学反应为基础，但因各自的局限性而限制了它们的使用。外斐氏试验虽然操作简单，但对恙虫病诊断缺乏敏感性和特异性；IFAT具有很好的敏感性和特异性，但需要荧光显微镜和训练有素的专业人员，难以在农村、基层医院及现场使用；IIP虽然以普通光学显微镜代替了荧光显微镜或甚至不需要显微镜，但仍然需要培养和纯化恙虫病东方体，需要昂贵的组织培养设备。因此，急需建立一种简便、快速并能克服上述局限的血清学诊断方法，以满足恙虫病东方体临床检测的需要。
恙虫病东方体56kD抗原(Scrub typhus antigen，Sta56)作为恙虫病东方体表面含量最丰富的外膜蛋白，可占菌体总蛋白的10～15％；免疫原性强，最常被宿主免疫系统所识别；Sta56可与株特异性单抗和群特异性单抗反应，表明Sta56存在株特异性表位和群特异性表位，因而Sta56是恙虫病诊断抗原的主要候选者之一。
胶体金是一种处于半还原状态的悬浮颗粒，能迅速吸附蛋白质等大分子而不影响其活性，胶体金具有易分辨的红至紫红色，在与大分子结合后，易于用肉眼识别，不需二级放大即可直接观察结果，胶体金诊断产品因而可直接进入没有复杂检测设备的诊所甚至家庭里。近年来，以早孕检测试纸为代表的胶体金免疫诊断试剂已进入千家万户，给人们的生活带来很大的方便。
从包括中国专利等有关资料检索表明，目前尚未有利用基因工程方法获得的重组抗原用于恙虫病的诊断及恙虫病快速诊断试纸的相关报道。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一.本发明涉及的溶液配方为(1)重组抗原溶解液SDS 0.1％甘氨酸 250mmol/LTris.Cl 25mmol/L(2)胶体金溶液3～5/万的四氯金酸，加1～2％柠檬酸三钠制备成胶体金颗粒；(3)二抗抗人IgG、抗人IgM多抗，购自Sigma公司；(4)包被缓冲液1～3％蔗糖in PBS；(5)基础缓冲液购自厦门波生生物技术有限公司；(6)反应缓冲液0.01～0.05％NaN3in PBS；(7)PBS在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24gKH2PO4，用盐酸调节溶液的pH值至7.2～7.6，加水定容至1L。
二.本发明重组抗原的工艺流程(1)从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出sta56基因的ORF或其中的大片段，用TA克隆技术将此大片段克隆；(2)以该重组质粒为模板，扩增出截短的sta56片段，定向插入pET30a载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达；Western blot证实该重组蛋白能被恙虫病患者阳性血清所识别；(3)采用电洗脱方法纯化重组蛋白对大量诱导时收集的菌体进行超声粉碎后，将超声上清进行制备电泳，确定目标条带在凝胶中的位置，切下含目标蛋白的凝胶胶置于透析袋中进行电洗脱；纯化样品进行SDS-PAGE，确定纯度并进行蛋白定量。
三.本发明的试纸制作工艺(1)以胶体金标记重组抗原和鼠IgG；(2)两种金标抗原溶液混合后充分浸润玻璃纤维纸，置冻干机冻干；(3)羊抗人μ链1.0～5.0mg/ml、羊抗人IgG 1.0～5.0mg/ml与羊抗鼠IgG单抗1.0～5.0mg/ml包被NC膜，自然晾干；(4)将吸水纸、NC膜和吸附了金标抗原的玻璃纤维组装成检测IgM、IgG和总Ig试纸条。
用本发明制作的重组抗原及利用重组抗原制作成的试纸条就可以用于恙虫病的临床诊断了。
本发明的有益效果是本发明利用基因工程技术，克隆恙虫病东方体的免疫优势抗原的结构基因，并在大肠杆菌内表达，以方便地获得大量廉价的重组抗原，纯化后即可用于免疫学诊断。由此方法得到的重组抗原及快速诊断试纸克服了现有恙虫病诊断方法的局限性，可以快速、简便地诊断恙虫病，无需特殊仪器，无需训练有素的专业人员，可以满足基层医院、农村卫生院等临床检测的需要，而且大大的降低了成本，方便了患者。同时本发明诊断精确度高，从而使患者能够得到及时的治疗，达到了防治的目的。
实施例2快速诊断试纸的制作(1)取3/万四氯金酸1000ml，加热至沸腾，加入1％柠檬酸三钠溶液25ml，继续煮沸5分钟，待胶体金溶液颜色由有蓝经紫变红后，自然冷却后备用；(2)取胶体金溶液1ml，加入0.2M K2CO310μl、50μg纯化抗原，搅匀后静置1h；(3)加入20％牛血清白蛋白25μl、20％ PEG 20,000 15μl，8,000r/min，离心8min，弃上清；(4)沉淀加入1ml基础缓冲液悬浮，即为金标抗原溶液；(5)同法标记鼠IgG；(6)两种金标抗原溶液混合后充分浸润玻璃纤维纸，置冻干机冻干；(7)羊抗鼠IgG单抗3.0mg/ml、羊抗人IgG 3.0mg/ml、羊抗人μ链1.0mg/ml分别在NC膜的上、中、下位置包被NC膜，自然晾干；或羊抗鼠IgG单抗3.0mg/ml、重组抗原溶液2mg/ml在NC膜的上、下三分之一处包被NC膜，自然晾干；(8)在约10cm宽的底板上，将吸水纸、NC膜、吸附了金标抗原的玻璃纤维和未吸附抗原的玻璃纤维组装成检测IgM与IgG和检测总Ig的试纸条。
评价在试纸条的玻璃纤维上加3μl(检测IgM和IgG)或5μl待检血清(检测总Ig)，再滴加1～2滴反应液。观察金标抗原释放后NC膜上检测线和对照线的反应情况，检测线和对照线同时出现红色条带判为阳性，仅对照线出现红色条带判为阴性，对照线未出现条带为无效试验。金标免疫层析法检测IgM、IgG、总Ig的敏感性分别为92.3％，90.9％和98.6％；特异性分别为94.7％，94.7％和93.3％。
权利要求
1.一种用于恙虫病诊断的重组抗原及其快速诊断试纸的溶液制备，其特征是溶液配方为(1)重组抗原溶解液 SDS 0.1％甘氨酸250mmol/LTris.Cl 25mmol/L(2)胶体金溶液2～5/万的四氯金酸，加1～2％柠檬酸三钠还原成中等大小的胶体金颗粒；(3)二抗抗人IgG、抗人IgM多抗，购自Sigma公司；(4)包被缓冲液1～3％蔗糖in PBS；(5)基础缓冲液购自厦门波生生物技术有限公司；(6)反应缓冲液0.01～0.05％NaN3in PBS；(7)PBS在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，用盐酸调节溶液的pH值至7.2～7.6，加水定容至1L。
2.一种用于恙虫病诊断的重组抗原的制备工艺流程，其特征是重组抗原的工艺流程为(1)从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出sta56基因的ORF或其中的大片段，用TA克隆技术将此大片段克隆；(2)以该重组质粒为模板，扩增出截短的sta56片段，定向插入pET30a载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达；Western blot证实该重组蛋白能被恙虫病患者阳性血清所识别；(3)采用电洗脱方法纯化重组蛋白对大量诱导时收集的菌体进行超声粉碎后，将超声上清进行制备电泳，确定目标条带在凝胶中的位置，切下含目标蛋白的凝胶胶置于透析袋中进行电洗脱；纯化样品进行SDS-PAGE，确定纯度并进行蛋白定量。
3.一种用于恙虫病诊断的重组抗原的快速诊断试纸，其特征是试纸制作工艺为(1)以胶体金标记重组抗原和鼠IgG；(2)两种金标抗原溶液混合后充分浸润玻璃纤维纸，置冻干机冻干；(3)羊抗人μ链1.0～5.0mg/ml、羊抗人IgG 1.0～5.0mg/ml与羊抗鼠IgG单抗1.0～5.0mg/ml包被NC膜，自然晾干；(4)将吸水纸、NC膜、吸附和未吸附金标抗原的玻璃纤维组装成检测IgM、IgG和总Ig试纸条。
全文摘要
本发明公开了一种用于恙虫病诊断的重组抗原及其快速诊断的试纸。恙虫病，又称丛林斑疹伤寒，是由恙虫病东方体引起的以发热、皮疹、虫咬溃疡(焦痂)和浅表淋巴结肿大为主要特征的发热性疾病，严重者出现肝脾肿大、腹水，救治不及时可导致死亡。本发明利用基因工程技术，克隆恙虫病东方体的免疫优势抗原的结构基因，并在大肠杆菌内表达，以方便地获得大量廉价的重组抗原，纯化后即可用于免疫学诊断。由此方法得到的重组抗原及快速诊断试纸克服了现有恙虫病诊断方法的局限性，可以快速、简便地诊断恙虫病，无需特殊仪器，无需训练有素的专业人员，可以满足基层医院、农村卫生院等临床检测的需要，而且大大的降低了成本，方便了患者。
文档编号G01N33/558GK1479099SQ0314731
公开日2004年3月3日 申请日期2003年7月5日 优先权日2003年7月5日
发明者严延生, 邓艳琴 申请人:福建省卫生防疫站