日本血吸虫重组多表位抗原及其表达、纯化方法与应用的制作方法

专利名称：：日本血吸虫重组多表位抗原及其表达、纯化方法与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物基因，具体涉及日本血吸虫重组多表位抗原及其表达、纯化方法与在制备日本血吸虫病免疫预防疫苗和诊断试剂中的应用。
背景技术：
：日本血吸虫病是一种重要的人兽共患寄生虫病。由于中间宿主钉螺难以消灭及血吸虫重复感染现象严重，单靠药物治疗不能控制血吸虫病流行和最终消灭血吸虫病，因此抗血吸虫病疫苗研究已经成为血防科研工作的重点之一。至今已有上百个血吸虫抗原基因被克隆和鉴定，不少于30种血吸虫基因重组抗原疫苗和核酸疫苗用于动物免疫保护试验，一些基因工程苗也取得了一定的保护效果。但由于血吸虫虫体大，抗原性复杂，单一抗原诱导的保护效果不够理想。表位(印itope)又称抗原决定簇，是指决定某抗原物质抗原特异性的化学基团。T细胞和B细胞表面均存在特异性抗原受体，能识别相应的抗原表位，根据表位设计疫苗，包括合成肽疫苗、多价基因工程疫苗及表位核酸疫苗，是疫苗设计的一种新途径。抗原的加工就是天然蛋白质抗原在细胞内经过蛋白酶水解，转变成和组织相容性复合物(MHC)分子相结合的肽段的过程，加工后的抗原被转送至细胞表面以抗原肽—MHC相结合的形式进入三元体被免疫细胞识别，被称为抗原呈递。依照抗原加工呈递原理可以人工预测、筛选抗原表位，而且研究人员已经根据此原理设计了计算机应用程序和数据库来预测抗原加工呈递过程并进行抗原表位筛选，构建多表位基因工程抗原疫苗或核酸疫苗，期望其可增强单一抗原的免疫原性，并诱导更高的免疫保护效果。表位是疫苗设计和免疫识别的基础，因此，加强日本血吸虫抗原表位研究，利用重组多表位抗原进行联合免疫或设计含多个表位的基因工程重组抗原疫苗或核酸疫苗，是一条值得探索的提高疫苗保护力的途径。曰本血吸虫病诊断方法主要有病原诊断和免疫诊断两种。牛、羊等大家畜的病原诊断方法目前应用较多的是尼龙筛淘洗集卵结合粪便毛蚴孵化法，该法结果可靠，但检出率低、花费的时间较长。现有的家畜血吸虫病血清学诊断方法的应用提高了诊断方法的敏感性，但特异性、重复性等还不够稳定。应用现代生物技术，寻找更为理想的诊断抗原，对提高血清学诊断方法的敏感性、特异性将有很大的帮助。本发明应用生物信息学方法和基因工程技术研制的重组多价核酸疫苗pCMV-BSjGCP-BSj23、pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28和重组多表位抗原pGEX-BSJGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28在小鼠免疫实验中获得了较好的免疫保护效果，重组多表位抗原在牛日本血吸虫病诊断中具有较高的敏感性和特异性，表明该种多表位重组抗原和核酸疫苗的研制方法及其产物具有较高的应用价值。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于研究设计日本血吸虫重组多表位抗原的表达和纯化以及在制备日本血吸虫病免疫预防疫苗和诊断试剂中的应用。本发明提供了一种日本血吸虫重组多表位抗原。所述日本血吸虫重组多表位抗原编码核苷酸片段具有如下核酸序列和相应的蛋白序列-1)BSjGCP-BSj23核酸序列(见序列表SEQID4)atgcgaattggatatgagggtctaccacgtgatcaatggccaaaagtgattcattggaat60ctacatgcacgtgacggtattatctgggtattagatggtctattgaaatgtccggaaaaa120ctttgcccattacttgctgaagatgttgattattattctagaatgactggtgctctggaa180aatccaaacgaggaaataacggcaaccatggatsagatacaaacgtcattccattgttgt240ggagtcaaaggtccagacgattataaagggaatgtgccagcatcatgtaaagaagggcaa300gaagtttatgttcagggttgtctatctgtctttagtgcattcttgaaacgcaac354BSjGCP-BSj23GlySerMetArg蛋白序列(见序列表SEQlieGlyTyrGluGlyLeuID9)ProArgAspGin1LysVallieLeuAspGluAsn65CysAsp50GluGly35ValHis20Leu5TrpAsnLeuHisLeuLysCysAspTyrTyrGlulieThrCysGlyValSerCysLysPheSerAla115Glu100PheLys85GlyAla70GlySer55ThrPro40ArgAla25Glu10ArgAspGlylieLysLeuCysMetThrGlyMetAspLysProAspAspGinGluValLeuLysArgTyr105LysTyr90ValLeulie75LysAla60GinPro45Leulie30LeuTrp15TrpProValLeuAlaGluAsnProThrSerPheGlyAsnValGinGlyCysLeu110Pro95SerHis80AlaValAsn1202)BSjGCP-BSj23-BSj28核酸序列(见序列表SEQID5)atgcgaattggatatgagggtctaccacgtgatcaatggccaaaagtgattcattggaat60ctacatgcacgtgacggtattatctgggtattagatggtctattgaaatgtccggaaaaa120ctttgcccattacttgctgaagatgttgattattattctagaatgactggtgctctggaa180aatccaaacgaggaaataacggcaaccatggataagatacaaacgtcattccattgttgt240ggagtcaaaggtccagacgattataaagggaatgtgccagcatcatgtaaagaagggcaa300gaagtttatgttcagggttgtctatctgtctttagtgcattcttgaaacgcaacgaattc360犯gccaccag站gaaaaagageiaaatctccaaggagatattgaacggtaaagttcccatt420cttctccaagcaatttgtgaaaccttaaaagagtctacaggtaatctgactgtcgga477BSjGCP-BSj23-BSj28蛋白序歹lj:(见序列表SEQID10)GlySerMetArglieGlyTyrGluGlyLeuProArgAspGinTrpPro151015LysVallieHisTrpAsnLeuHisAlaArgAspGlylielieTrpVal202530LeuAspGlyLeuLeuLysCysProGluLysLeuCysProLeuLeuAla354045GluAspValAspTyrTyrSerArgMetThrGlyAlaLeuGluAsnPro505560AsnGluGlulieThrAlaThrMetAspLyslieGinThrSerPheHis65707580CysCysGlyValLysGlyProAspAspTyrLysGlyAsnValProAla859095SerCysLysGluGlyGinGluValTyrValGinGlyCysLeuSerVal100105110PheSerAlaPheLeuLysArgAsnGluPheLysProProGluGluLys115120125GluLyslieSerLysGlulieLeuAsnGlyLysValProlieLeuLeu130135140GinAlalieCysGluThrLeuLysGluSerThrGlyAsnLeuThrVal145150155160GlyLysLeu。本发明另一目的提供了日本血吸虫重组多表位抗原的表达和纯化方法。本发明应用生物信息学方法预测和筛选了日本血吸虫抱雌沟蛋白(SjGCP)的抗原表位，应用PCR技术扩增了日本血吸虫23KDa表膜蛋白(SJ23)，日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶(Sj28GST)和日本血吸虫抱雌沟蛋白(SjGCP)的各一段富含表位的肽段所对应的编码核苷酸片段，运用基因工程重组技术将此三种核苷酸片段重组到载体pCMV-script和pGEX-2T中，构建了pCMV-BSjGCP-BSj23、pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28多表位真核表达质粒及pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28原核表达质粒。将真核表达质粒pCMV-BSJGCP-BSj23、pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28纯化后直接以肌肉注射的方法免疫昆明系小鼠，分别获得了14.76%、64.95%减虫率。将重组原核表达质粒pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28转化大肠杆菌BL21后进行了诱导表达并且纯化到重组蛋白。本发明提供的日本血吸虫重组多表位抗原的表达和纯化方法包括以下步骤(1)利用生物信息学在线分析程序RANKPEP筛选到日本血吸虫抱雌沟蛋白SjGCP'的第539590位肽段的表位集中区为BSjGCP表位，截取日本血吸虫23KD抗原(Sj23)的大亲水区(LHD-SJ23)作为表位BSj23，选取和曼氏血吸虫Sm28KdGST抗原的第115-153氨基酸肽段对应的Sj28GST肽段为BSj28表位，将三种抗原表位重组成BSjGCP-BSj23和BSjGCP-BSj23-BSj28多表位抗原；(2)根据上述表位的核酸序列分别设计PCR引物，并在两端加上特异限制性内切酶酶切位点，PCR扩增各表位编码核酸片断，再利用特异限制性内切酶BamHI、XbaI、EcoRI、HindIII依次将编码BSjGCP、BSj23、BSj28表位抗原的核酸片段定向克隆至真核表达载体pCMV的多克隆位点区，构建重组真核表达质粒pCMV-BSjGCP-BSj23及pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28,并在大肠杆菌DH5a中大量培养，肌肉注射免疫小鼠。(3)将重组真核表达质粒pCMV-BSjGCP-BSj23及pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28中的编码BSjGCP-BSj23和BSjGCP-BSj23-BSj28多表位抗原的核酸片段利用特异限制性内切酶BamHI、EcoRI、HindIII定向克隆至原核表达载体pGEX-2T多克隆位点区，构建重组原核表达质粒pGEX-BSjGCP-BSj23及pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28;将上述两种重组质粒分别转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导表达，并用亲和层析纯化GST融合蛋白的方法纯化到日本血吸虫多表位重组蛋白，应用重组蛋白制备成疫苗进行血吸虫病免疫预防试验并将重组蛋白作为诊断试剂进行牛血吸虫病诊断试验。本发明又一目的提供了日本血吸虫重组多表位抗原在制备预防日本血吸虫的免疫预防疫苗和诊断日本血吸虫的试剂中的应用。经动物试验结果显示，本发明提供的多表位核酸疫苗pCMV-BSjGCP-BSj23、pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28在昆明系小鼠中分别获得了14.76%、64.95%的减虫率。重组多表位抗原pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28免疫BalB/c小鼠获得了15.7%、57.99%的减虫率，作为诊断抗原分别获得了91.0%、89.9%的敏感性和97.8%、93.4%的特异性，可以用于制备诊断血吸虫的试剂。图1:重组真核表达质粒pCMV-BSjGCP-BSj23和pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28的构建图2:重组真核表达质粒的酶切鉴定M:DL2000Marker,1:BamHI和Hindin酶切后空质粒pCMV,2:BamHI和HindIII酶切后的pCMV-BSj23-BSj28，3:BamHI和HindlII酶切后pCMV-BSjGCP-BSj23，4:BamHI和HindIII酶切后pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28图3:重组原核表达质粒pGEX-BSjGCP-BSj23和pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28的构建图4:重组质粒pGEX-BSjGCP-BSj23的双酶切鉴定和PCR鉴定分析1、2、5、6:BamHI和EcoRI双酶切空载pGEX，M:DNAMarker,3:BamHI和EcoRI双酶切pGEX-BSjGCP-BSj23，4:pGEX-BSjGCP-BSj23PCR鉴定图5:重组质粒pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28的双酶切鉴定1、2、3、4:BamHI和HindIII双酶切pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28M:DNAmarker图6:SDS-PAGE分析IPTG诱导pGEX-BSjGCP-BSJ23/BL21的表达1:IPTG诱导了6小时的pGEX/BL21，2:IPTG诱导了6小时的空宿主菌BL21，3-8:分别为诱导了Oh、2h、4h、6h、8h、10h的pGEX-BSjGCP-BSj23/BL21，M:低分子量蛋白标准图7:融合蛋白pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28时相表达的电泳分析1:IPTG诱导了6小时的空宿主菌BL21;2:IPTG诱导了6小时的pGEX/BL21;3-8:分别为诱导了Oh、2h、4h、6h、8h、10h的pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28/BL21，M:低分子量蛋白标准图8:SDS-PAGE分析纯化的pGEX-BSjGCP-BSj23与pGEX-BSjGCP-BSj23_BSj281:纯化的pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28，2:纯化的pGEX-BSjGCP-BSj23，M:低分子量蛋白标准实施例l、日本血吸虫多表位重组核酸疫苗构建与免疫保护实验1、材料1、1质粒与菌株真核表达载体pCMV-script,大肠杆菌DH5a等购自上海申能博彩生物技术公司。1、2实验动物雄性昆明系小鼠，体重25g，购自上海实验动物中心。1、3日本血吸虫中国大陆株尾蚴中国农科院上海兽医研究所钉螺室提供。1、5主要试剂氨苄青霉素、卡那霉素、Agarose、Tryptone、酵母提取物、NaCl等购自上海生工生物工程有限公司；DNAMarkerDL2000、dNTPMixture、MgCl2、TaqDNAPloyrose、限制性内切酶EcoRI、HindIII、B柳HI、XbaI、T<DNAligase连接酶等为大连宝生物技术有限公司产品。DNAAgaroseGelPurificationKit纯化回收试剂盒、质粒提取试剂盒等购自天为时代生物有限公司。2、方法2、1抗原表位的预测与筛选2、1、1SjGCP表位筛选根据日本血吸虫SjGCP(GenBankaccessionnumber:AF519183)的编码基因序列及相应的氨基酸序列，在http:〃bio.dfci.harvard.edu/RANKPEP/网站上分析预测其线性T细胞抗原表位，筛选出的表位所对应的编码核苷酸序列简称为BSjGCP。2、1、2Sj23抗原表位选取日本血吸虫23KD抗原(Sj23)的大亲水区(LHD-SJ23)(简称BSj23，其对应的编码核苷酸序列共192bp)构建重组的多价疫苗，抗原表位预测表明，该肽段含有多个T细胞和B细胞抗原表位。2、1、3Sj28GST表位参照曼氏血吸虫Sm28KdGST表位分析与鉴定结果选取，Sm28GST抗原的115-131，140-153肽段为其两个重要的T细胞表位，blast比较发现Sj28GST与Sm28GST的具有很高的同源性，其115-153肽段与曼氏血吸虫的对应肽段极为相似(相似率为76%)，故本研究中选择了这一肽段。将所对应的其编码核苷酸序列简称为BSj28(共117bp)。2、2重组真核表达质粒pCMV-BSjGCP-BSj23和pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28的构建根据表位分析筛选结果，确定克隆策略(如图l所示)，分别设计引物，以日本血吸虫成虫cDNA为模板PCR扩增目的片段BSjGCP、BSj23和BSj28，并进行酶切、连接等基因重组，将各表位片段重组到pCMV-script载体中，构建pCMV-BSJGCP-BSj23和pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28重组真核表达质粒。根据日本血吸虫抱雌沟蛋白(GCP)539590位氨基酸的编码核苷酸序列设计两对引物，在BSjGCP的上游引物BSjGCP(叩)5'端加上限制性内切酶BamHI和启动密码子ATG,在BSjGCP下游引物BSjGCP(down)5'端加上限制性酶切位点XbaI，具体如下BSjGCP(up)5，-AATAGGATCCATGCGAATTGGATATG-3，，BSjGCP(down)5,-GCGCTCTAGAATAATAATCAACATCTTCAG-3，;根据日本血吸虫Sj23大亲水区编码核苷酸序列分别设计两对引物，在LHD-SJ23上游引物BSj23(up)5'端加上限制性酶切位点XbaI，在BSj23下游引物BSj23(down)的5'端加上限制性酶切位点EcoRI，具体如下；BSj23(up)5，-AATA3HA^ATGACTGGTGCTCTGGA-3',BSj23(down)5，-CGCGGAATTCGTTGCGTTTTAAG-3，根据日本血吸虫Sj28GST的115153区段氨基酸的编码核苷酸序列分别设计两对引物，在BSj28上游引物BSj28(叩)5'端加上限制性酶切位点EcoRI，在BSj28下游引物BSj28(down)5'端加上限制性酶切位点HindIII及终止密码子，具体如下BSj28(up)5，-CGGCGAATTCAAGCCACCAGAAGAA-3，，BSj28(down)5，-ATTAAAGCTTCTATCCGACAGTCAGATTA-3'。所有引物的5'端添上四个保护性碱基，由基康生物公司合成。根据下列PCR反应体系和条件进行PCR。PCR反应体系Template(日本血吸虫成虫cDNA)mi,10XPCRBuffer5W，MgCl23W，dNTP(2.5mM)扭l，PCRprimer(20pmol/l4)各0.5l4，TaKaRaTaqpolyrase(5uM)，灭菌去离子水35.5Pl加至总体积50W。PCR扩增条件如下:预变性，94°C5分钟;按94。C变性45秒，BSjGCP55。C、BSj2353°C、BSj2857t:各复性45秒；72'C延长反应1分，共扩增30个循环，再于72'C延长反应10分钟,最后将PCR产物保存于4'C，进行琼脂糖水平电泳观察PCR产物。按天为时代生物有限公司DNAAgaroseGelPurificationKit纯化、回收试剂盒的操作手册进行PCR产物回收纯化。最后将DNA溶解于30WTE或水。利用上述PCR引物两侧和pCMV-script载体中的限制性内切酶位点，用特异限制性内切酶BamHI、XbaI、EcoRI、HindIII将上述表位的DNA片断依次克隆进pCMV-script载体，构建pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28重组真核表达质粒。首先用BamHI、XbaI将BSjGCP表位DNA片断和pCMV-script载体酶切，用^DNAligase将两者重组连接，制备pCMV-BSjGCP重组质粒。然后用XbaI、EcoRI将BSj23表位DNA片断和pCMV-BSjGCP重组质粒酶切，用T《DNAligase将两者重组连接，制备pCMV-BSjGCP-BSj23重组质粒。最后用EcoRI、Hind11I将BSj28表位DNA片断和pCMV-BSjGCP-BSj23重组质粒酶切，用T4DNA1igase将两者重组连接，制备pCMV-BSjGCP-BSJ23-BSj28重组质粒，转入大肠杆菌DH5a。最后将重组质粒用酶切鉴定，并将阳性克隆送上海基康生物公司测序。2、3动物免疫保护实验2、3、1大量制备重组质粒和空载体大量培养含pCMV-BSjGCP-BSj23和pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28重组质粒和空载体pCMV-script的大肠杆菌，按照上海天为时代生物有限公司的质粒抽提试剂盒方法，大量制备重组质粒pCMV-BSjGCP-BSj23、pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28和pCMV-script载体，紫外分光光度计分别测量两种质粒的A^和A^，并计算出纯度和含量，-2(TC保存。2、3、2免疫和攻击感染30只昆明系小鼠分三个组，每组10只，每只小鼠在后腿肌肉部位分别多点注射pCMV-BSjGCP-BSj23、pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28重组质粒或pCMV-script空载体各50Pg，每隔两周免疫一次，共免疫三次。第三次免疫后第三周，试验鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾呦(40土1)条。2、3、3计算减虫率攻击感染日本血吸虫尾蚴42天后，剖杀小鼠，冲虫计数，按照公式减虫率=(对照组平均检获成虫数-实验组平均检获成虫数)+对照组平均检获成虫数X100X，计算减虫率。3、结果3、1抗原表位分析结果3、1、1SjGCP的抗原表位分析结果根据日本血吸虫SjGCP(GenBankaccessionnumber:AF519183)的编码基因序列及相应的氨基酸序列，在http:〃bio.dfci.harvard.edu/RANKPEP/网站上分析预测其线性T细胞抗原表位，以不同大小的TAP肽段作为条件选择参数，分析结果表明在该蛋白的C端集中着对人类HLA-ALL具有较好结合效率的抗原肽。进一步进行MHCI类分子结合的普适性分析和结合特异性分析，结果显示该蛋白的539548位，578590位的肽段具有较好的参与抗原呈递的特性，适合作为表位，另外在这两个肽段之间被筛选出来的肽段也较多，并且分值较高，如553562位的肽段。结果表明在SjGCP的539590位的肽段(其编码核苷酸序列共156bp)是一个潜在的表位集中区。因此优先选择了该肽段作为研究的表位之一。具体序列(见序列表SEQID6)如下MRIGYEGLPRDQWPKVIHWNLHARDGIIWVLDGLLKCPEKLCPLLAEDVDYY对应的核苷酸序列(见序列表SEQID1)为acgtgacggtattatctgggtattagatggtctattgaaatgtccggaaaaactttgcccattacttgctgaagatgttgattattat3、1、2BSj23的抗原表位分析及序列截取日本血吸虫23KD抗原(Sj23)的大亲水区(LHD-SJ23)作为BSj23序列(见序列表SEQID7)MTGALENPNEEITATMDKIQTSFHCCGVKGPDDYKG證ASCKEGQEVYVQGCLSVFSAFLKRN对应的核苷酸序列为(见序列表SEQID2)ccattgttgtggagtcaaaggtccagacgattataaagggaatgtgccagcatcatgtaaagaagggcaagaagtttatgttcagggttgtctatctgtctttagtgcattcttgaaacgcaac3、1、3BSj28的抗原表位分析及序列截取和曼氏血吸虫Sm28KdGST抗原的第115-153氨基酸肽段对应的Sj28GST肽段为BSj28表位序列(见序列表SEQID8):KPPEEKEKISKEILNGKVPILLQAICETLKESTGNLTVG对应的核苷酸序列(见序列表SEQID3)为Aagccaccagaaga朋aagagaaaatctcceiaggagatattgaacggtaaagttcccattcttctccaagcaatttgtgaaaccttaaaagagtctacaggtaatctgactgtcgga3、2多表位重组质粒的构建将BSjGCP和BSj23表位的核苷酸序列用限制性内切酶连接，序列如下(见序列表SEQID4)AAGCTT相应的氨基酸序列为(见序列表SEQID9)ATMDKIQTSFHCCGVKGPDDYKGNVPASCKEGQEVYVQGCLSVFSAFLKRNKL将BSjGCP、BSj23和BSj28表位的核苷酸序列用限制性内切酶连接，序列如下:(见序列表SEQID5)AAGCAATTTGTGAAACCTTAAAAGAGTCTACAGGTAATCTGACTGTCGGAAAGCTT对应的氨基酸序列为(见序列表SEQID10)GSMRIGYEGLPRDQWPKVIHWNLHARDGIIWVLDGLLKCPEKLCPLLAEDVDYYSRMTGALENPNEEITATMDKIQTSFHCCGVKGPDDYKGNVPASCKEGQEVYVQGCLSVFSAFLKRNEFKPPEEKEKISKEILNGKVPILLQAICETLKESTGNLTVGKL三种重组质粒经酶切后，分别出现了约300bp,340bp,500bp左右大小的DNA条带,表明为正确重组质粒。重组质粒经测序鉴定为重组正确(见图2)。3、4动物免疫保护实验结果试验小鼠于攻击感染42天后剖杀、冲虫计数，pCMV空载体对照组平均虫荷数为17.75，pCMV-BSjGCP-BSj23、pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28试验组平均虫荷数分别为15.13、6.25，和对照组相比其减虫率分别为14.76%、64.95%。其中三价重组质粒试验组的虫荷数明显低于对照组，统计结果显示差异非常显著(P<0.01)(见表l)。表l:动物免疫保护实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>实施例2、日本血吸虫多表位重组抗原的表达、纯化与免疫预防实验1、材料1、1质粒与菌株原核表达载体pGEX-2T，大肠杆菌DH5a，BL21等购自上海申能博彩生物技术公司。1、2实验动物BALB/c系小鼠雄性，6周龄，购自上海实验动物中心。1、3闩本血吸虫尾蚴由中国农科院上海家畜寄生虫病研究所钉螺室提供。1、4酶类及其它相关试剂氨苄青霉素、IPTG、X-gal、谷胱甘肽、尿素等购自上海生工生物工程公司。DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、标准蛋白Marker等购自天为时代生物公司，蛋白重折叠试剂盒购自普飞生物公司。Ta^DNA聚合酶、限制性内切酶EcoRI、Xbal、HindIII、BamHI购自TaKaRa公司。考马斯亮兰R250为Fluka进口分装。氯仿、异丙醇等生化试剂购自中国医药集团化学试剂公司。2、方法2、1重组原核表达质粒pGEX-BSjGCP-BSj23和pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28的构建分别以前述BSjGCP(叩)和BSj23(down)或BSjGCP(up)和BSj28(down)为引物，以质粒pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28为模板，应用PCR扩增目的DNA片断BSjGCP-BSj23和BSjGCP-BSj23-BSj28。(如图3所示)DNA片断BSjGCP-BSj23的引物BSjGCP(叩)5'-AATAGGATCCCATGCGAATTGGATATG-3，，BSj23(down)5'-CGCGgMIieGTTGCGTTTTAAG-3，DNA片断BSjGCP-BSj23-BSj28的引物BSjGCP(up):5'-AATAGGATCCCATGCGAATTGGATATG-3，，BSj28(down):5'-ATTAAAGCTTTCCGACAGTCAGATTA-3，；PCR反应体系同前，94'C预变性5分钟；按94。C变性45秒，56。C复性45秒，72'C延长反应1分，共扩增30个循环，再于72。C延长反应10分钟，最后将PCR产物保存于4。C，进行琼脂糖水平电泳观察PCR产物。按天为时代生物有限公司DNAAgaroseGelPurificationKit纯化回收试剂盒的操作手册进行PCR产物回收纯化。最后将DNA溶解于30riTE或水。用BamHI、EcoRI将表位BSjGCP-BSj23的DNA片断和pGEX-2T载体酶切，用^DNAligase重组连接，构建pGEX-BSjGCP-BSj23重组质粒。用BamHI、HindIII将表位BSjGCP-BSj23-BSj28的DNA片断和pGEX-2T载体酶切，用T,DNAligase将两者重组连接，构建pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28重组组质粒(如图3所示)，将质粒转入大肠杆菌DH5a。然后将重组质粒用酶切、PCR鉴定，并将阳性克隆送上海基康生物公司测序。2、2重组多表位质粒pGEX-BSjGCP-BSj23和pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28的诱导表达将阳性重组多表位质粒pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28分别转化BU感受态细胞。将含重组质粒的阳性菌按l.0%接种入一定量的含50^/1111氨卞青霉素的2YT培养液中，37。C剧烈振摇4小时，加入IPTG至终浓度lmmol/ml，37。C诱导表达0、2、4、6、8、IO小时，各取出lml细菌培养物于Eppendorf管；10000rpm离心lmin，去掉LB上清培养液。在离心沉淀的菌体中加入2X上样缓冲液5(mi，(1朋2050^，在混匀器上超声裂解后于沸水中煮3到5分钟后，进行SDS-PAGE电泳，用考马氏亮蓝对SDS-PAGE电泳胶进行染色，室温摇动染色4小时以上。脱色后，对凝胶进行扫描，分析其分子量和表达状况。2、3重组多表位抗原pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28的纯化将前述鉴定的菌株过夜培养，第二天按W的量加入200ml液体LB培养基中扩大培养3h后，加入IPTG诱导6h。4°C,1000r/min离心收集菌体。将收集的菌体在一7(TC冰箱和室温反复冻融5次。超声裂解破碎细胞10次(10sec/次)，4°C5000g离心15min，分别取离心后的沉淀和上清样品，以SDS-PAGE电泳分析重组蛋白的溶解性。根据novagen蛋白重折叠试剂盒预处理包涵体蛋白，进行复性处理，并进一步按Amersham公司提供的GlutathioneS印harose4B亲和层析方法进行pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28重组蛋白的纯化。纯化后的重组蛋白用PBS透析去除小分子，经SDA-PAGE分析和蛋白含量测定后，用PBS稀释至一定浓度，于-2(TC保存备用。2、4动物免疫实验2、4、1免疫将6—7周龄BALB/c系小鼠分成4组，每组6只。其中三个试验组分别应用重组多表位抗原pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28与福氏佐剂结合进行免疫(每只鼠每次注射抗原50Pg)，每两周免疫一次，共免疫三次。试验设两个对照组分别为空白对照组和佐剂对照组，分别注射福氏佐剂和PBS。2、4、2攻击感染第三次免疫后二周试验组及对照组小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾呦40条。感染42天后，剖杀小鼠，冲虫计数，按照公式减虫率=(对照组平均检获成虫数_实验组平均检获成虫数)+对照组平均检获成虫数X100X计算减虫率。3、结果3、1多表位重组表达质粒构建利用PCR和限制性内切酶位点BamHI、EcoRI、HindIII，将BSjGCP-BSj23、BSjGCP-BSj23-BSj28表位目的核苷酸片段亚克隆入载体pGEX-2T中，PCR、酶切鉴定重组的原核表达质粒均出现了与预期大小一致的DNA片段(见图4、5)。对阳性克隆的菌落小量液体培养后，将菌液样本送上海基康生物公司测序，结果证实含多表位的核苷酸序列编码阅读框正确。3、2融合蛋白pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28诱导表达结果将含重组质粒pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28的BL21大肠杆菌于含50Mg/ml氨卞青霉素的2YT培养液中振摇培养，加入IPTG诱导表达O、2、4、6、8、IO小时，分别取细菌培养物进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明，禾BpGEX/BL21或BL21空宿主菌相比，pGEX-BSjGCP-BSJ23/BL21经IPTG诱导后不同时相的菌液均有预期大小的特异目的蛋白(约39KDa)条带出现，在诱导6小时后其表达量达到最高水平(见图6)。SDS-PAGE电泳分析诱导后pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28/BL21不同时间的菌液样品表明也有预期大小的目的蛋白(接近45KDa)条带出现，在诱导6小时后重组蛋白的表达量达到最高水平，8小时j^达量开始下降(见图7)。3、3融合蛋白纯化结果分别大量培养菌株BL21/pGEX-BSjGCP-BSj23、BL21/pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28，IPTG诱导后，离心收集菌体，反复冻融、超声裂解破碎细菌，SDS-PAGE电泳分析发现pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28重组蛋白均以包涵体表达。按novagen蛋白重折叠试剂盒预进行复性处理，并进一步用亲和层析方法纯化。如图8所示，经过纯化得到了纯度较高的重组蛋白。3、4动物免疫实验结果试验小鼠于攻击感染42天后剖杀、冲虫计数，空白对照组、佐剂对照组、pGEX-BSJGCP-BSj23免疫组、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28免疫组的平均虫荷数分别为21.83、19、18.4和9.17，和对照组相比两个试验组的减虫率分别为15.7%(P〉0.05)和57.99%(P<0.01)(见表2)。表2动物免疫保护试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>实施例3、重组多表位抗原用于诊断牛血吸虫病研究试验1、材料1、1抗原重组多表位抗原pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28，根据前述的方法制备。-20°(:保存备用。1、2血清水牛血吸虫病阳性血清采自云南省日本血吸虫病疫区放牧水牛。采集前由当地兽医对目标水牛的粪便根据国标法进行粪便毛蚴孵化法检査以诊断水牛曰本血吸虫病，将粪检阳性水牛的血清作为日本血吸虫病阳性血清，共有189份，92份阴性血清采自血吸虫病非疫区河南的健康牛血清，分离血清保存于-20。C备用。取健康水牛血清50份混合后作水牛标准阴性血清。1、3明胶、TMB等购自天为时代生物公司，兔抗牛IgG购自普飞生物公司，其它生化试剂购自中国医药集团上海化学试剂公司。'2、方法2、1ELISA法检测水牛日本血吸虫病阴、阳性血清分别应用重组多表位抗原pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28作为抗原(15Pg/ml)以间接ELISA法检测水牛血清。主要步骤如下'2、2抗原(15^g/ml)用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释后包被96孔酶标板，抗原稀释度按预试验结果进行，每孔加100ul，4'C过夜。用PBST洗二次，每次5min。2、3用3%明胶37。C封闭3hr，每孔加150y1。结束后用PBST洗三次，每次5min。2、4加l:IOO稀释的待检血清，每份血清加二孔，每孔100ul，37。C作用lhr，每次试验都设标准阴性对照孔。结束后用PBS洗四次，每次5min。2、5加HRP标记的兔抗牛IgG,每孔100ul，37'C作用45min。结束后用PBST洗四次，每次5min。2、6加TMB/柠檬酸缓冲液显色，每孔75ul，37"C作用10min左右。每孔加20u12M硫酸终止反应。2、7于450nM测0D值，计算平均OD值。2、8结果判断把待检血清的平均0D值大于和等于标准阴性血清的平均0D值+2倍标准差的，判断为阳性，小于的判断为阴性。3、结果以重组表位抗原pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28作为诊断抗原，应用间接ELISA法检测疫区189份水牛血清和92份健康牛血清，结果pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28三价表位抗原的敏感性和特异性分别为89.9%、93.4%，pGEX-BSjGCP-BSj23二价表位抗原的敏感性和特异性比三价稍高，分别为91.0%、97.8%(见表3)。表3重组表位抗原检测水牛血吸虫病结果<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>从以上结果看出，以二价表位重组抗原pGEX-BSjGCP-BSj23作为诊断抗原，获得的平均OD值、对阳性牛的检出率和对健康牛的阴性符合率都最高，可以看出pGEX-BSjGCP-BSj23有潜力发展成为一种新的、特异、敏感的血吸虫病诊断抗原。同时由于基因重组抗原可以大量生产制备，易于产品的标准化和诊断技术的规范化。列及相应的蛋白序列:SEQID1:日本血吸虫抱雌沟蛋白表位核酸序列atgcgaattggat已tgagggtctaccacgtgatcaatggccaaaagtgattcattggaat60ctacatgcacgtgacggtattatctgggtattagatggtctattgaaatgtccggaaaaa120ctttgcccattacttgctgaagatgttgattattat156SEQID2:日本血吸虫23KD抗原表位核酸序列atgactggtgctctggaaaatcc犯acgaggaaataacggcaaccatggataagatacaa60acgtcattccattgttgtggagtcaaaggtccagacgattataaagggaatgtgccagca120tcatgtaaagaagggcaagaagtttatgttcagggttgtctatctgtctttagtgcattc180ttgaaacgcaac192SEQID3:日本血吸虫28KD谷胱苷肽-S-转移酶抗原表位核酸序列aagccsccagaaga已aaagagaaaatctccaaggagatattgaacggtaaagttcccatt60cttctccaagcaatttgtgaaaccttaaaagagtctax;aggtaatctgactgtcgga117SEQID4:日本血吸虫抱雌沟蛋白-23KD抗原重组表位核酸序列atgcgaattggatatgagggtctaccacgtgatc犯tggcca犯agtgattcattggaat60ctacatgcacgtgacggtattatctgggtattagatggtctattgaaatgtccgg犯aaa120ctttgcccattacttgctgaagatgttgattattattctagaatgactggtgctctggeia180aatccaaacgaggaaataacggcaaccatggat犯gatacaaacgtcattccattgttgt240ggagtcasaggtccagacgattataaagggaatgtgccagcatcatgtaaag犯gggcaa300gaagtttatgttcagggttgtctatctgtctttagtgcattcttgaaacgcaac354SEQID5:日本血吸虫抱雌沟蛋白-23KD抗原-28KD谷胱苷肽-S-转移酶抗原重组表位核酸序列atgcgaattggatatg鄉gtctaccacgtgstc犯tggcC犯肌gtg3ttcattggaat60ctacatgcacgtg3Cggt3ttatctgggtatt3gatggtctattga犯tgtccggaaaaa120ctttgcccattacttgctgaa_gatgttgattattattctagaatgactggtgctctggaa180aatccaaacgagga犯taacggcaaccatggataagatacaaacgtc已ttccattgttgt240ggagtc犯aggtccagacgattataaagggaatgtgccagc已tcatgt已a300ga已gttt3tgttcagggttgtctatctgtctttagtgcattcttgaaacgcaacg33ttc360犯gCC3CC3ggaaaatctcctgaacggtaaagttcccatt420cttctccaagcaatttgtgaaaccttaaaagagtctacaggta已tctgactgtcgg3477SEQID6:日本血吸虫抱雌沟蛋白表位蛋白序列MetArglieGlyTyrGluGlyLeuProArgAspGinTrpProLysVal151015lieHisTrpAsnLeuHisAlaArgAspGlylielieTrpValLeuAsp202530GlyLeuLeuLysCysProGluLysLeuCysProLeuLeuAlaGluAsp354045ValAspTyrTyr50SEQID7:日本血吸虫23KD抗原表位蛋白序列MetThrGlyAlaLeuGluAsnProAsnGluGlulieThrAlaThrMet151015AspLyslieGinThrSerPheHisCysCysGlyValLysGlyProAsp202530AspTyrLysGlyAsnValProAlaSerCysLysGluGlyGinGluVal354045TyrValGinGlyCysLeuSerValPheSerAlaPheLeuLysArgAsn505560SEQID8:日本血吸虫28KD谷胱苷肽-S-转移酶抗原表位蛋白序列LysProProGluGluLysGluLyslieSerLysGlulieLeuAsnGly1510.15LysValProlieLeuLeuGinAlalieCysGluThrLeuLysGluSer202530ThrGlyAsnLeuThrValGly35SEQIDGlySer1LysValLeuAspGluAsp50AsnGlu65CysCysSerCysPheSer9:日本血吸虫抱雌沟蛋白MetArglieGlyTyrGlu-23KD抗原重组表位蛋白序列GlyLeuProArgAspGinTrplieHis20GlyLeu35ValAsp5TrpGlyValLysGlu100AlaPhe115Lys85GlyAsnLeuHisLeuLysCysTyrTyrGlulieThrAla70GlySer55ThrPro40ArgLeuLysArgAsn120Ala25GluGinGluValTyr105Lys10ArgProAspAspAspGlylieLysLeuCysMetThrGlyMetAspLysTyr90ValLeulie75LysAla60GinPro45Leulie30Leu15TrpProValLeuAlaGluAsnProThrSerPheGlyAsnValGinGlyCysLeu110Pro95SerHis80AlaValSEQID10:日本血吸虫抱雌沟蛋白-23KD抗原-28KD谷胱苷肽-S-转移酶抗原重组表位蛋白序列GlySerMetArglieGlyTyrGluGlyLeuProArgAspGinTrpPro151015LysVallieHisTrpAsnLeuHisAlaArgAspGlylielieTrpVal202530LeuAspGlyLeuLeuLysCysProGluLysLeuCysProLeuLeuAla354045GluAspValAspTyrTyrSerArgMetThrGlyAlaLeuGluAsnPro505560AsnGluGlulieThrAlaThrMetAspLyslieGinThrSerPheHis65707580CysCysGlyValLysGlyProAspAspTyrLysGlyAsnValProAla859095SerCysLysGluGlyGinGluValTyrValGinGlyCysLeuSerVal100105110PheSerAlaPheLeuLysArgAsnGluPheLysProProGluGluLys115120125GluLyslieSerLysGlulieLeuAsnGlyLysValProlieLeuLeu130135140GinAlalieCysGluThrLeuLysGluSerThrGlyAsnLeuThrVal145150155160GlyLysLeu2权利要求1、一种日本血吸虫重组多表位抗原，其特征在于所述多表位表原为BSjGCP-BSj23，它由日本血吸虫23KD抗原表位和日本血吸虫抱雌沟蛋白抗原表位重组组成，具有如下核酸序列和相应的蛋白序列BSjGCP-BSj23核酸序列atgcgaattggatatgagggtctaccacgtgatcaatggccaaaagtgattcattggaat60ctacatgcacgtgacggtattatctgggtattagatggtctattgaaatgtccggaaaaa120ctttgcccattacttgctgaagatgttgattattattctagaatgactggtgctctggaa180aatccaaacgaggaaataacggcaaccatggataagatacaaacgtcattccattgttgt240ggagtcaaaggtccagacgattataaagggaatgtgccagcatcatgtaaagaagggcaa300gaagtttatgttcagggttgtctatctgtctttagtgcattcttgaaacgcaac354BSjGCP-BSj23蛋白序列GlySerMetArgIleGlyTyrGluGlyLeuProArgAspGlnTrpPro151015LysValIleHisTrpAsnLeuHisAlaArgAspGlyIleIleTrpVal202530LeuAspGlyLeuLeuLysCysProGluLysLeuCysProLeuLeuAla354045GluAspValAspTyrTyrSerArgMetThrGlyAlaLeuGluAsnPro505560AsnGluGluIleThrAlaThrMetAspLysIleGlnThrSerPheHis65707580CysCysGlyValLysGlyProAspAspTyrLysGlyAsnValProAla859095SerCysLysGluGlyGlnGluValTyrValGlnGlyCysLeuSerVal100105110PheSerAlaPheLeuLysArgAsnLysLeu115120。2、一种日本血吸虫重组多表位抗原，其特征在于所述多表位抗原为BSjGCP-BSj23-BSj28，它由日本血吸虫23KD抗原表位、日本血吸虫抱雌沟蛋白抗原表位和日本血吸虫28KD谷胱甘肽-S-转移酶抗原表位重组组成，具有如下核酸序列和相应的蛋白序列BSjGCP-BSj23-BSj28核酸序列atgcgaattggatatgagggtctaccacgtgatcaatggccaaaagtgattcattggaat60ctacatgcacgtgacggtattatctgggtattagatggtctattgaaatgtccggaaaaa120ctttgcccattacttgctgaagatgttgattattattctagaatgactggtgctctggaa180aatccaaacgaggaaataacggcaaccatggataagatacaaacgtcattccattgttgt240ggagtcaaaggtccagacgattataaagggaatgtgccagcatcatgtaaagaagggcaa300gaagtttatgttcagggttgtctatctgtctttagtgcattcttgaaacgcaacgaattc360aagccaccagaagaaaaagagaaaatctccaaggagatattgaacggtaaagttcccatt420cttctccaagcaatttgtgaaaccttaaaagagtctacaggtaatctgactgtcgga477BSjGCP-BSj23-BSj28蛋白序列GlySerMetArglieGlyTyrGluGlyLeuProArgAspGinTrpProLysVallieHisTrpAsnLeuHisAlaArgAspGlylielieTrpValLeuAspGlyLeuLeuLysCysProGluLysLeuCysProLeuLeuAlaGluAspValAspTyrTyrSerArgMetThrGlyAlaLeuGluAsnProAsnGluGlulieThrAlaThrMetAspLyslieGinThrSerPheHisCysCysGlyValLysGlyProAspAspTyrLysGlyAsnValProAlaSerCysLysGluGlyGinGluValTyrValGinGlyCysLeuSerVal(100105110PheSerAlaPheLeuLysArgAsnGluPheLysProProGluGluLys(115120125GluLyslieSerLysGlulieLeuAsnGlyLysValProlieLeuLeu(130135140GinAlalieCysGluThrLeuLysGluSerThrGlyAsnLeuThrVal145150155160GlyLysLeu。3、一种权利要求1或2所述日本血吸虫重组多表位抗原的表达、纯化方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)利用生物信息学在线分析程序RANKPEP筛选到日本血吸虫抱雌沟蛋白SjGCP的第539590位肽段的表位集中区为BSjGCP表位，截取日本血吸虫23KD抗原SJ23的大亲水区LHD-SJ23作为表位BSj23,选取和曼氏血吸虫Sm28KdGST抗原的第115-153氨基酸肽段对应的Sj28GST肽段为BSj28表位，将三种抗原表位重组成BSjGCP-BSj23或BSjGCP-BSj23-BSj28多表位抗原；(2)根据上述表位的核酸序列分别设计PCR引物，并在两端加上特异限制性内切酶酶切位点，PCR扩增各表位编码核酸片断，再利用特异限制性内切酶BamHI、XbaI、EcoRI、HindIII依次将编码BSjGCP、BSj23、BSj28表位抗原的核酸片段定向克隆至真核表达载体pCMV的多克隆位点区，构建重组真核表达质粒pCMV-BSjGCP-BSj23或pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28;(3)将重组真核表达质粒pCMV-BSjGCP-BSj23及pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28中的编码BSjGCP-BSj23和BSjGCP-BSj23-BSj28多表位抗原的核酸片段利用特异限制性内切酶BamHI、EcoRI、HindIII定向克隆至原核表达载体pGEX-2T多克隆位点区，构建重组原核表达质粒pGEX-BSjGCP-BSj23或pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28;将上述两种重组质粒分别转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导表达，并用亲和层析纯化GST融合蛋白的方法纯化到日本血吸虫多表位重组蛋白pGEX-BSjGCP-BSj23或pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28。4、一种如权利要求1或2所述的日本血吸虫重组多表位抗原在制备日本血吸虫病免疫预防疫苗中的应用。5、根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述制备免疫预防疫苗时，使用的重组蛋白是带有GST标签的融合蛋白。6、根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述制备的免疫预防疫苗为日本血吸虫重组多表位抗原的DNA疫苗。7、根据权利要求6所述的应用，其特征在于制备所述免疫预防疫苗时，使用的宿主菌为大肠杆菌DH5a，真核表达质粒为pCMV-script。8、一种如权利要求1或2所述的日本血吸虫重组多表位抗原在制备诊断日本血吸虫病的试剂中的应用。9、根据权利要求8所述的应用，其特征在于制备所述诊断试剂时，使用的重组蛋白为带有GST标签的融合蛋白。全文摘要本发明公开了日本血吸虫重组多表位抗原BSjGCP-BSj23和BSjGCP-BSj23-BSj28的基因序列和表达、纯化方法及在制备日本血吸虫病免疫预防疫苗和诊断试剂中的应用。重组多表位核酸疫苗pCMV-BSjGCP-BSj23和pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28在昆明系小鼠中分别获得了14.76％、64.95％的减虫率。重组多表位抗原pGEX-BSjGCP-BSj23和pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28免疫BalB/c小鼠获得了15.7％、57.99％的减虫率，作为诊断抗原分别获得了91.0％、89.9％的敏感性和97.8％、93.4％的特异性。文档编号C07K14/435GK101624422SQ20081004038公开日2010年1月13日申请日期2008年7月9日优先权日2008年7月9日发明者傅志强,刘金明,周伟芳,朱传刚,浩李,林矫矫,石耀军,章登吉,珂陆申请人:中国农业科学院上海兽医研究所