专利名称：：广州管圆线虫循环抗原的检测方法及其酶联免疫试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种广州管圆线虫循环抗原的检测方法及其酶联免疫试剂盒，主要适用于广州管圆线虫病的快速诊断和考核疗效。
背景技术：
：广州管圆线虫(^^/0Wr0/7^r/Mca/^o/e/7s/s)由我国学者陈心陶(1933)在广州家鼠肺部中发现并命名。其主要分布在太平洋、印度洋某些岛屿和东南亚国家。人体感染广州管圆线虫主要是人因食用生或半生的含有第三期幼虫的螺类、鱼、坏以及被此幼虫污染的蔬菜、瓜果和饮水所致。首例人体广州管圆线虫病由Nomura和Lin在台湾发现。中国大陆自1984由何竟智报道首例广州管圆线虫病病例以来，陆续在浙江、辽宁、福建、云南、北京等地暴发过多次。其中，最严重的一次是2006年6~9月间暴发于北京的"福寿螺事件"，前后累计才艮道病例达160例。目前，全球已报道病例3000多例。卫生部对此表示高度的重视，并于2006年第15号公告中把此虫列为对人类健康危害最严重的食源性寄生虫之广州管圆线虫病主要依靠临床症状、流行病史、实验室血常规嗜酸粒细胞变化和ELISA法4全测抗原或抗体来诊断，几乎4艮难实现病原学的确诊。近十年来，通过研究者们的不断努力，ELISA法开始广泛用于广州管圆线虫病的检测。但该传统的EIISA法始终无法解决敏感性较低，重复性相对较差、容易与其它寄生虫病发生交叉反应、检测时间比较长等问题。本发明采用针对广州管圆线虫蛋白分泌物的单克隆抗体建立的双抗体夹心法，检测广州管圆线虫循环抗原，具有敏感性高、特异性强、重复性好等优点。该试剂盒其一步检测法更是操作简便、快速，全程只需40min,适合大量样本的快速筛查；而两步法则用于精确测定病人血清或脑脊液中广州管圆线虫循环抗原的量，用于病人疗效的考核。
发明内容本发明的第一目的是为了提供一种检测广州管圆线虫循环抗原的双抗体夹心法，该方法操作简便、灵敏度高、特异性强，适合批量样本的检查，针对不同检测目的可分为一步法和两步法一步法用于广州管圆线虫病的临床诊断，只需40min时间，可目测判断结果；两步法用于广州管圆线虫病的疗效考核，需要借助酶标议读数，可精确算出病人血清或脑脊液内广州管圆线虫循环抗原的量。本发明的第二目的是为了提供一种检测广州管圓线虫循环抗原的酶联免疫试剂盒，此试剂盒操作简便、快速、敏感性高、特异性强、重复性好、结果直观，适合医院4全验科、疾病防控中心、社康中心等部门用于广州管圆线虫病的临床诊断、疗效考核和流行病学调查，具有很高的实用价值。本发明的第一目的可通过如下措施来实现一种检测广州管圆线虫循环抗原的双抗体夹心法(一)采用公知的杂交瘤技术原理制备出抗广州管圆线虫蛋白分泌物的单克隆抗体；(二)选择两个针对广州管圆线虫成虫抗原上不同决定簇的抗广州管圆线虫单克隆抗体，其中抗广州管圆线虫单克隆抗体A用于包被固相载体，抗广州管圆线虫单克隆抗体B用于制备酶结合物；(三)将人或鼠类的脑脊液、血清或全血等待测样品(2)滴于包被好抗广州管圆线虫单克隆抗体A的固相载体(l)中，同时加入或保温反应后加入酶标记抗广州管圆线虫单克隆抗体B(3)，保温反应后，阳性标本形成单抗A-循环抗原-酶标单抗B夹心复合物(4)，加底物显色后形成有色产物，而阴性则无。所述的抗广州管圆线虫蛋白分泌物的单克隆抗体的制备方法如下(一)动物免疫①抗原制备从褐云玛瑙螺或福寿螺体内分离广州管圆线虫3期幼虫，按80100条/只的量人工感染SD大鼠，33~35天后从鼠肺动脉中分离得广州管圆线虫成虫，成虫在生理盐水中室温培养3天，将培养液离心，取上清冻干浓缩后得到一定浓度的广州管圆线虫蛋白分泌物抗原；与此同时，用生理盐水漂洗成虫后冰冻干燥，将其研磨成粉，冷丙酮脱脂2~3次，经超声粉碎后反复冻融，14OOOrpm4。C离心20min，上清液即为广州管圆线虫成虫可溶性抗原，-20。C保存待用。②免疫动物的选择选用68w的雌性BALB/c小鼠。初次免疫将广州管圆线虫成虫可溶性抗原与弗氏完全佐剂混合并乳化完全，按25~10(^g/只剂量皮下多点注射小鼠。每隔2周，用相同剂量的广州管圆线虫成虫可溶性抗原与弗氏不完全佐剂混合乳化进行加强免疫，共加强免疫2次，用ELISA法检测免疫效价，达到1/10000以上时，进行最后一次尾静脉加强免疫，三天后取脾脏融合。(二)细胞融合取骨髓瘤细胞SP2/0与免疫脾细胞按1:5~1:10比例在PEG4000作用下进行融合，融合好后杂交细胞通过在含有次黄嘌呤(hypoxanthine,H)、氨基喋呤(aminopterin，A)和胸腺嘧咬核脊(thymidine,T)的培养基(HAT)中进行选择生长，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。(三)杂交瘤细胞筛选和克隆化杂交瘤细胞在融合后2周左右即用广州6管圆线虫蛋白分泌物抗原进行筛选，挑选出针对广州管圆线虫蛋白分泌物抗原的杂交瘤细胞林进行克隆化，直到获得分泌稳定的针对广州管圆线虫成虫蛋白分泌物的单克隆细胞林。(四)将此抗广州管圆线虫成虫蛋白分泌物的单克隆细胞抹注入BALB/c小鼠腹腔内，1~2周后小鼠腹腔产出大量的抗体，小心抽取腹水，离心得到大量针对广州管圆线虫成虫蛋白分泌物的单克隆抗血清。所述的抗广州管圆线虫蛋白分泌物的单克隆抗体的纯化方法如下①饱和硫酸铵溶液的配制500g硫酸铵加入500ml蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出的结晶任其留在瓶中。临用前取所需的量，用2mol/LNaOH调pH至7.8。②盐析吸取10ml处理好的腹水移入小烧杯中，在搅拌下，滴加饱和碌u酸铵溶液5.Oml;继续緩慢搅拌30min;10000r/min离心15min;弃去上清液，沉淀物用1/3饱和度石克酸铵悬浮，搅拌作用30min，同法离心；重复前一步1~2次；沉淀物溶于1.5mlPBS(0.Olmol/LpH7.2)或Tris-HC1緩冲液中。③脱盐常用柱层析或透析法。柱层析法是将盐析样品过S印hadexG-50层析柱，以PBS或Tris-HC1緩冲液作为平衡液和洗脱液，流速lnil/inin。第一个蛋白峰即为脱盐的抗体溶液。透析法是将透析袋于2%NaHC03，lmmol/LEDTA溶液中煮10min,用蒸馏水清洗透析袋内外表面，再用蒸馏水煮透析袋10min,冷至室温即可使用(并可于0.2mol/LEDTA溶液中，4。C保存备用)。将盐析样品装入透析袋中，对50~100倍体积的PBS或Tris-HCl緩沖液透析(4'C)12~24小时，其间更换5次透析液，用萘氏试剂(多典化汞11.5g,石典化钾8g，加蒸馏水50ml,待溶解后，再加20%NaOH50ml)检测，直至透析外液无黄色物形成为止。④蛋白质含量的测定(Pr)(mg/ml)=(1.45xOD28。-0.74x0D26。)x稀释倍数；或(Pr)H)D環x稀释倍数/3分装冻存备用。所述的标记物的的标记酶为辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)或碱性磷酸酶(alkalinephosohatase,AP),其标记过程如下(一)辣根过氧化物酶(HRP)标记辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体的常用方法是过硤酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。其操作步骤如下①将5mgHRP溶于0.5ml0.lmol/LNaUC03溶液中；加0.5mllOmmol/LNaI04溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时；②加0.75ml10.lmol/L^20)3混匀；(D加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml),混匀；称取SephadexG25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内；随后将上述交联物移入注射器外套；盖紧，室温作用(避光)3小时或4。C过夜；用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4溶液，混匀，室温作用30min;再加入3/20VNaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4。C过夜)；4夺交耳关物过SephadexG200或Sepharose6B(2.5x50cm)层冲斤纯4t,分管收集第一峰；(D酶结合物质量鉴定酶活性和抗体活性的测定，可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H202显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效价、特异性；⑧HRP抗体结合物的保存加入等量甘油后，小量分装-2(TC存放，防止反复冻融；或加入等量60%甘油4。C保存；不宜加NaN3或酚防腐，否则会影响酶活性，必要时还可以冻干保存，以BSA或脱脂牛奶作保护剂。(二)碱性磷酸酶(AP)标记碱性磷酸酶(AP)用于标记抗体，常用戊二醛一步法，将酶和单抗混合，再加入适量戊二醛，^吏酶和抗体蛋白的冊2分别与两个醛基结合，制备成结合物。其程序如下①将5mgAP加入lml抗体溶液(2mg/ml)中溶解，装入透析袋，于4。C对0.01mol/LpH7.2PBS透析18小时，换液三次。(D加入2.5%戊二醛20ul,室温作用、12小时，4'C对PBS透析过夜，其间换液三次。③换用0.05mol/LPH8.0Tris-HCl緩冲液透析，4'C过夜，换液三次。④取出标记抗体，用含l。/。BSA的Tris-HCl緩冲液稀释至4ml，即为AP标记物原液。每毫升中加入0.4ml甘油，小量分装，保存备用。本发明的第二目的可通过如下措施来实现一种检测广州管圆线虫循环抗原的酶联免疫试剂盒，包括包被有包被原的酶标板、酶标记物、浓缩洗涤液、样品稀释液、广州管圆线虫病阳性血清、阴性血清、不同浓度标准品、显色液、终止液。所述的浓缩洗涤液为O.01~0.05mol/LpH值7.4，含有1%吐温20、0.3%叠9氮化钠的磷酸盐緩冲液；样品稀释液为含l%牛血清白蛋白的洗涤緩冲液。所述当酶标记物为辣根过氧化物酶时，显色液为过氧化氢(A液)和四曱基联苯胺(B液)，终止液为2mol/L的硫酸；所述当酶标记物为碱性磷酸酶时，显色液为4-硝基酚磷酸盐緩沖液，终止液为lmol/L氢氧化钠緩冲液。所述的广州管圆线虫病阳性血清为广州管圓线虫病人血清或实验感染广州管圆线虫大鼠血清，所述的广州管圆线虫病阴性血清为健康人血清或SPF级鼠血'漆/3。所述的酶标板为96孔可拆卸聚苯乙烯酶标板；所述的包被緩冲液为pH值9.6，0.05mol/L的碳酸盐緩沖液。本发明与现有技术相比具有如下优点(一)本发明的检测广州管圆线虫循环抗原的双抗体夹心法为一步法和两步法结合，敏感性高、特异性强、重复性好，分别适合批量标本的检测和疗效考核；(二)本发明的一种检测广州管圆线虫循环抗原的酶联免疫试剂盒，此试剂盒操作简便、快速，检测实验感染广州管圆线虫大鼠血清和广州管圆线虫病人血清，检出率均为100%，适合医院检验科、疾病防控中心、社康中心等部门用于广州管圆线虫病的临床诊断、疗效考核和流行病学调查，具有很高的实用价值。W图说明图为检测广州管圆线虫循环抗原的双抗体夹心法的原理图1—包被好抗广州管圆线虫单克隆抗体A的固相载体；2-脑脊液、血清等待测样品(循环抗原)；3-酶标记抗广州管圆线虫单克隆抗体B;4—单抗A一循环抗原-酶标单抗B夹心复合物。具体实施例方式本发明还将结合实施例作进一步详述实施例一一种4全测广州管圆线虫循环抗原的双抗体夹心法参照图，一种检测广州管圆线虫循环抗原的双抗体夹心法包括如下步骤(一)选择两个针对广州管圆线虫成虫抗原上不同决定簇的抗广州管圆线虫单克隆抗体，其中抗广州管圆线虫单克隆抗体A用于包被固相载体，抗广州管圆线虫单克隆抗体B用于制备酶结合物；(二)将人或鼠类的脑脊液、血清或全血等待测样品(2)滴于包被好抗广州管圆线虫单克隆抗体A的固相载体(l)中，同时加入或保温反应后加入酶标记抗广州管圆线虫单克隆抗体B(3),保温反应后，阳性标本形成单抗A-循环抗原-酶标单抗B夹心复合物(4)，加底物显色后形成有色产物，而阴性则无，终止显色后通过酶标议读数，应用标准曲线或回归方程法，还可测知标本中循环抗原的量。所述的抗广州管圆线虫蛋白分泌物的单克隆抗体的制备方法如下(一)动物免疫①抗原制备从褐云玛瑙螺或福寿螺体内分离广州管圆线虫3期幼虫，按80100条/只的量人工感染SD大鼠，33~35天后从鼠肺动脉中分离得广州管圆线虫成虫，成虫在生理盐水中室温培养3天，将培养液离心，取上清冻干浓缩后得到一定浓度的广州管圆线虫蛋白分泌物抗原；与此同时，用生理盐水漂洗成虫后水冻干燥，将其研磨成粉，冷丙酮脱脂2~3次，经超声粉碎后反复冻融，ii14OOOrpm4。C离心20min，上清液即为广州管圓线虫成虫可溶性抗原，-20°C保存待用。②免疫动物的选择选用68w的雌性BALB/c小鼠。初次免疫将广州管圆线虫成虫可溶性抗原与弗氏完全佐剂混合并乳化完全，按25~100pg/只剂量皮下多点注射小鼠。每隔2周，用相同剂量的广州管圆线虫成虫可溶性抗原与弗氏不完全佐剂混合乳化进行加强免疫，共加强免疫2次，用ELISA法检测免疫效价，达到1/10000以上，进行最后一次尾静脉加强免疫，三天后取脾脏融合。(二)细胞融合取骨髓瘤细胞SP2/0与免疫脾细胞按1:5~1:10比例在PEG4000作用下进行融合，融合好后杂交细胞通过在含有次黄噤呤(hypoxanthine,H)、氨基喋呤(ami,terin,A)和胸腺嗜咬核苦(thymidine,T)的培养基(HAT)中进行选择生长，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。(三)杂交瘤细胞筛选和克隆化杂交瘤细胞在融合后2周左右即用广州管圆线虫蛋白分泌物抗原进行筛选，挑选出针对广州管圆线虫蛋白分泌物抗原的杂交瘤细胞抹进行克隆化，直到获得分泌稳定的针对广州管圆线虫成虫蛋白分泌物的单克隆细胞抹。(四)将此抗广州管圆线虫成虫蛋白分泌物的单克隆细胞株注入BALB/c小鼠腹腔内，1~2周后小鼠腹腔产出大量的抗体，小心抽取腹水，离心得到大量针对广州管圆线虫成虫蛋白分泌物单克隆抗血清。所述的抗广州管圆线虫蛋白分泌物的单克隆抗体的纯化方法如下①饱和硫酸铵溶液的配制500g硫酸铵加入500ml蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出的结晶任其留在瓶中。临用前取所需的量，用2mol/LNaOH调PH至7，8。②盐析吸取10ml处理好的腹水移入小烧杯中，在搅拌下，滴加饱和疏酸铵溶液5.Oml;继续緩慢搅拌30min;10Q00r/min离心15min;弃去上清液，沉淀物用1/3饱和度碌u酸铵悬浮，搅拌作用30min,同法离心；重复前一步1~2次；沉淀物溶于1.5mlPBS(0.Olmol/LPH7.2)或Tris-HC1緩沖液中。③脱盐常用柱层析或透析法。柱层析法是将盐析样品过SephadexG-50层析柱，以PBS或Tris-HCl緩冲液作为平衡液和洗脱液，流速lml/min。第一个蛋白峰即为脱盐的抗体溶液。透析法是将透析袋于2%NaHC03，lmmol/LEDTA溶液中煮10min,用蒸馏水清洗透析袋内外表面，再用蒸馏水煮透析袋10min，冷至室温即可使用(并可于0.2mol/LEDTA溶液中，4'C保存备用)。将盐析样品装入透析袋中，对50-100倍体积的PBS或Tris-HCl緩冲液透析(4'C)1244小时，其间更换5次透析液，用萘氏试剂(碘化汞ll.5g,碘化钾8g，加蒸馏水50ml，待溶解后，再加20WaOH50ml)检测，直至透析外液无黄色物形成为止。蛋白质含量的测定:(Pr)(mg/ml)=(1.45xOD28。-0.74xOD26。)x稀释倍数；或(Pr)=0028广稀释倍数/3分装冻存备用。所述的标记物的的标记酶为辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)或碱性磷酸酶(alkalinephosohatase,AP)，其标^己过禾呈如下(一)辣根过氧化物酶(HRP)标记辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过硤酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。其操作步骤如下①将5mgHRP溶于0.5ml0.lmol/LNaHC0r溶液中；加0.5ml10mmol/LNaI04溶液，混勻，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时；②加O.75ml10.lmol/L^03混匀;③加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml),混匀；④称取S印hadexG25千粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内；随后将上述交联物移入注射器外套；盖紧，室温作用(避光)3小时或4'C过夜；用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4溶液，混匀，室温作用30min;再加入3/20VNaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4。C过夜)；4夸交联物过SephadexG200或Sepharose6B(2.5x50cm)层冲斤纯4匕，分管收集第一峰；⑦酶结合物质量鉴定酶活性和抗体活性的测定，可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H202显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效价、特异性；⑧HRP抗体结合物的保存加入等量甘油后，小量分装-2(TC存放，防止反复冻融；或加入等量60%甘油4。C保存；不宜加NaN3或酚防腐，否则会影响酶活性，必要时还可以冻干保存，以BSA或脱脂牛奶作保护剂。(二)碱性磷酸酶(AP)标记碱性磷酸酶(AP)用于标记抗体，常用戊二醛一步法，将酶和单抗混合，再加入适量戊二醛，使酶和抗体蛋白的冊2分别与两个醛基结合，制备成结合物。其程序如下①将5mgAP加入lml抗体溶液(2mg/ml)中溶解，装入透析袋，于4'C对140.Olmol/LpH7.2PBS透析18小时，换液三次。(D加入2.5。/。戊二醛20ul，室温作用1-2小时，4'C对PBS透析过夜，其间换液三次。③换用0.05mol/LPH8.0Tris-HCl緩沖液透析，4。C过夜，换液三次。④取出标记抗体，用含l。/。BSA的Tris-HCl緩沖液稀释至4ml，即为AP标记物原液。每毫升中加入O.4ml甘油，小量分装，保存备用。实施例二一种检测广州管圆线虫循环抗原的酶联免疫试剂盒的制备及检测方法。(一)一种检测广州管圆线虫循环抗原的酶联免疫试剂盒，包括①包被有包被原的酶标板用包被緩沖液(pH值9.6,0.05mol/L的碳酸盐緩沖液)将抗广州管圆线虫成虫蛋白分泌物的单克隆抗体稀释成2pg/ml，在96孔可拆卸聚苯乙烯酶标板每孔加入100^d，37。C孵育2h,倒去包被液，用19倍稀释的浓缩洗涤液洗2~3次，每次30s,拍干，然后加入200^1封闭液(样品稀释液)，37'C孵育lh，倒去孔内液体，千燥后真空密封保存。②酶标记物如例一所述，为HRP标记；③浓缩洗涤液0.01~0.05mol/LpH值7.4,含有1%吐温20、0.3%叠氮化钠的磷酸盐緩沖液；样品稀释液含1%牛血清白蛋白的洗涤緩沖液；广州管圆线虫病人阳性血清、阴性血清阳性血清为广州管圆线虫病人血清或实验感染广州管圆线虫大鼠血清；阴性血清为健康人血清或SPF级鼠血清。不同浓度标准品用稀释液将广州管圆线虫蛋白分泌物稀释成Opg/L、lpg/L、2pg/L、4pg/L、8pg/L、16网/L、32^g/L、64pg/L，3~5ml/瓶；⑦显色液所述当酶标记物为辣根过氧化物酶时，显色液为过氧化氩(A液)51.4ml0.2mol/L的化2线与48.6m10.1mol/L的柠檬酸混合并用HC1调pH至5.1~5.4,最后加入67^il30。/。的H202;四甲基联苯胺(B液)将四曱基联苯胺50mg，无水乙醇5ml,0.1mol/L的4宁檬酸，0.lmol/L的EDTA0,5ml,加蒸馏水至100ml;终止液将纯硫酸与蒸馏水按体积比1:17的比例混合得到2mol/L硫酸溶液。(二)一种检测广州管圆线虫循环抗原的酶联免疫试剂盒的检测方法①一步法将人或鼠类的脑脊液、血清或全血等待测样品和阳性、阴性样品50u1滴于包被有包净皮原的酶标板中，同时加入HRP标记抗广州管圆线虫单克隆抗体，37。C孵育25~30min，倒出孔内液体，用19倍稀释的浓缩洗涤液(0.01~0.05mol/LpH值7.4，含有1°/0吐温20、0.3%叠氮化钠的磷酸盐緩沖液)洗3~5次，每次30s,拍干，加底物显色液100nl后37。C避光显色5~10min,每孔加入终止液(2mol/L石危酸溶液)50jxl,混匀，用酶标i义测定每孔吸光值(0D值)，样品0D值大于规定的阴性对照0D值的2.1倍，即判为阳性；②两步法将人或鼠类的脑脊液、血清或全血等待测样品和阳性、阴性等标准样品50jxl滴于包被有包被原的酶标板中，37。C孵育2530min后，倒出孔内液体，用19倍稀释的浓缩洗涤液液洗3~5次，每次30s,拍干，加入HRP标记抗广州管圆线虫单克隆抗体，37。C孵育25~30min，倒出孔内液体，用19倍16稀释的浓缩洗涤液洗3~5次，每次30s，拍干，加底物显色液10(^1后37。C避光显色5~10min，每孔加入终止液(2mol/L石克酸溶液)50^1,混匀，用酶标j义测定每孔吸光值(0D值)，样品0D值大于规定的阴性对照0D值的2.1倍，即判为阳性，对照不同浓度标准品的0D值，绘制标准曲线图或应用回归方程法，可算出样本溶液中循环抗原的浓度。实施例三试剂盒特异性、灵敏度、精密度、稳定性的检测①特异性检测选用68份实验感染广州管圓线虫SD大鼠血清、50份正常SD大鼠血清、18份广州管圆线虫病病人血清、80份正常人血清、2份广州管圆线虫成虫抗原稀释液、2份广州管圆线虫蛋白分泌物稀释液、2份日本血吸虫抗原稀释液、2份人蛔虫抗原稀释液、2份肝吸虫抗原稀释液、24份肺吸虫病病人血清、18份日本血吸虫病病人血清、38份肝吸虫病病人血清、27份蛔虫病病人血清、12份嚢虫病病人血清、7份包虫病病人血清、5份丝虫病病Ajk清，采用实施例二制备的检测广州管圆线虫循环抗原的酶联免疫试剂盒进行检测，结果除了68份实验感染广州管圆线虫SD大鼠血清、18份广州管圆线虫病病人血清、2份广州管圆线虫成虫抗原稀释液、2份广州管圆线虫蛋白分泌物稀释液成阳性外，其余样品均为阴性，表明检测准确率为100%。②灵敏度检测用实施例二制备的样品稀释液对广州管圆线虫蛋白分泌物抗原进行梯度稀释，用实施例二制备的检测广州管圆线虫循环抗原的酶联免疫试剂盒进行检测，以样品稀释液为空白对照，以实施例二制备的阳性、阴性血清为阳性、阴性对照，结果如表1所示，表明该酶联免疫试剂盒检测广州管圆线虫循环抗原的最低检测值(检测限)为0.5IU/ml。表1.广州管圆线虫循环抗原的酶联免疫试剂盒灵敏度检测<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>(D精密度检测随机抽取按照实施例二的方法制备的10个不同批次的广州管圆线虫循环抗原的酶联免疫试剂盒对同一份阳性血清进行检测，测定吸光值0045。，计算OD45。的变异系数(C.V)值。结果如表2所示，表明变异系数为8.54%。表2.广州管圆线虫循环抗原的酶联免疫试剂盒精密度拾测<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>④稳定性检测将实施例二制备的广州管圓线虫循环抗原的酶联免疫试剂盒分别放置于4。C和37°C5天，取出后同步检测10个不同稀释度的标准阳性血清，检测结果如表3所示，表明其读数变化率<25%,属正常范围内。表3.广州管圆线虫循环抗原的酶联免疫试剂盒稳定性检测<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>权利要求1、一种检测广州管圆线虫循环抗原的酶联免疫试剂盒，包括包被板、包被原和酶标记物；所述的包被原和酶标记物均为抗广州管圆线虫单克隆抗体。2、根据权利要求l所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的酶标板为96孔可拆卸聚苯乙烯酶标板；所述的包被緩冲液为pH值9.6，0.05mol/L的碳酸盐緩冲液。3、根据权利要求l所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的单克隆抗体是通过广州管圆线虫成虫的蛋白分泌物所筛选出来的具有考证现症感染意义的抗广州管圆线虫单克隆抗体。4、根据权利要求1或3所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的包被原和酶标单抗为两个针对广州管圆线虫抗原上不同决定簇的抗广州管圆线虫单克隆抗体。5、根据权利要求l所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)或碱性磷酸酶(alkalinephosohatase，AP)，其中优选为辣才艮过氧化物酶。6、根据权利要求l所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还包括浓缩洗涤液、样品稀释液、广州管圆线虫病阳性血清、阴性血清、不同浓度标准品、显色液、终止液。7、根据权利要求6所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的浓缩洗涤液为O.01~0.05mol/LpH值7.4,含有1%吐温20、0.3%叠氮化钠的磷酸盐緩冲液；样品稀释液为含1%牛血清白蛋白的洗涤緩冲液。8、根据权利要求6所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于当所述的酶标记物为辣根过氧化物酶时，显色液为过氧化氢(A液)和四甲基联苯胺(B液)，终止液为2mol/L的疏酸；当所述的酶标记物为碱性磷酸酶时，显色液为4-硝基酚磷酸盐緩沖液，终止液为lmol/L氬氧化钠緩沖液。9、一种检测广州管圆线虫循环抗原的双抗体夹心法，包括如下步骤第一，选择两个针对广州管圆线虫成虫抗原上不同决定簇的抗广州管圆线虫单克隆抗体，其中抗广州管圆线虫单克隆抗体A用于包被固相载体，抗广州管圆线虫单克隆抗体B用于制备酶结合物；第二，将人或鼠类的脑脊液、血清或全血等待测样品(2)滴于包^f皮好抗广州管圆线虫单克隆抗体A的固相栽体(l)中，同时加入或保温反应后加入酶标记抗广州管圆线虫单克隆抗体B(3)，保温反应后，阳性标本形成单抗A-循环抗原-酶标单抗B夹心复合物(4)，加底物显色后形成有色产物，而阴性则无，终止显色后通过酶标议读数，应用标准曲线或回归方程法，还可测知样本中循环抗原的量。全文摘要本发明涉及一种检测广州管圆线虫循环抗原的双抗体夹心法及其酶联免疫试剂盒，属于酶免疫分析
技术领域：
。该检测广州管圆线虫循环抗原的酶联免疫试剂盒，包括包被有包被原的酶标板和酶标记物；所述的包被原和酶标记物均为抗广州管圆线虫蛋白分泌物的单克隆抗体。本发明试剂盒的检测特异性达到100％；精密性(变异系数C.V)为8.54％。该试剂盒操作简便、快速，一步检测法可在40min内完成，能够实现广州管圆线虫病的大样本量诊断和疗效考核。文档编号G01N33/577GK101644710SQ20081014274公开日2010年2月10日申请日期2008年8月5日优先权日2008年8月5日发明者张仁利,朱兴全,陈木新申请人:深圳市疾病预防控制中心