专利名称：一种检测广州管圆线虫病的金标试剂盒和制备方法
技术领域：
本发明涉及一种检测广州管圆线虫病的金标试剂盒和制备方法，可实现广 州管圆线虫病的快速诊断和疗效考核。
背景技术：
广州管圓线虫(J"g/oy/rawgy/wj ca"to"ms&)是1933年由我国学者陈心陶 在广州的家鼠肺部发现并命名的，属圆线虫目、后圓线虫科、后圆线虫亚科、 管圆线虫属。其主要分布在太平洋、印度洋某些岛屿和东南亚国家。广州管圆 线虫的中间宿主主要为螺类和蛞蝓，终宿主主要为啮齿动物尤其是鼠类。成虫 寄生在肺动脉血管内，人主要因生食或半生食含有该虫第III期幼虫的螺类、鱼、 蚱以及被第m期幼虫污染的蔬菜、瓜果、和饮水等而感染的，幼虫侵入中枢神 经系统可致嗜酸粒细胞增多性脑膜脑炎。
近年来，由于广州管圆线虫病的中间宿主东风螺和福寿螺的大量养殖及食 用，其分布范围不断扩大，再加上人们对生鲜食品的不断追求，因而此病的感染 急剧地上升，并曾在浙江、辽宁、福建、云南、北京等地暴发过多次。1997年 10~11月在浙江省温州市105人因吃"凉拌螺肉"造成65人发病；1999年在 辽宁省盘锦市5人在餐馆吃过螺肉后，5人均得病；2002年，在福建省福州长 乐市，8名11~13岁的学生因吃烧烤福寿螺而得病；同年，福州市某单位职工 20人食用"爆炒美国蜗牛肉，，，2天后13人陆续发病；2004 ~ 2005年间，云南 昆明累计报道病例34例；规模最大的一次是06年6 ~ 9月间暴发于北京的福寿 螺事件，前后累计报道病例达160例。目前，全球已报道病例3000多例，自06 年北京"福寿螺事件，，后，我国大陆已报道的病例已超过300例。由于广州管圆线虫虫体寄生在脑部，病原学诊断十分困难，脑脊液的^r出率不到10%，误 诊、漏诊较多，实际病例远不止此。卫生部对此表示高度的重视，并于2006年 第15号公告中把此虫列为对人类健康危害最严重的食源性寄生虫之一。
此前，国内外尚无一种理想的方法来诊断广州管圆线虫病，其诊断主要依 靠临床症状、流行病史，如患者是否来自本病流行区，有无生吃或半生吃或接 触中间宿主或转宿宿主史，再结合血常规嗜酸粒细胞变化和实验室血清免疫学 作为重要的辅助诊断。由于广州管圓线虫的病原学诊断十分困难，且很多广州 管圆线虫感染者症状不明显，只能依靠病人自述吃生史和医院血常规检查很难 对此病作出正确的诊断，因此，实验室血清免疫学诊断就显得尤其重要，而国 内外许多专家学者也都致力于此血清免疫学的研究。
Eamsobhana等(1995 )用单克隆抗体AW-3C2夹心ELISA法检测了 10例广 州管圆线虫病病人和53例健康对照者血清，敏感性为50%，特异性为100%。 Chye等(1997 )用单抗ACJ1和ACJ20夹心ELISA法检查42例EM病人的血清 CAg，敏感性为81%，特异性为100%。周成业等(2001 )采用ELISA检测法对 34例广州管圆线虫病患者进行血清抗体早期诊断的敏感性为94.12%，而特异性 仅为82. 35 % 。梁韶晖等(2005 )用单克隆抗体3F1 、 4H2建立了双抗体夹心ELISA 法检测广州管圆线虫循环抗原，实验感染广州管圆线虫大鼠、小鼠血清和广州 管圆线虫病人血清检出率分别为84.2%(48 / 57)和87. 2 % (41 / 47)和86.4% (19/22)，特异性为100%。干小仙等(2007 )用金标法检测广州管圆线虫特异 性IgG抗体，检测广州管圆线虫病人血清敏感性为90. 5% (19/21),但与健康人 群血清的假阳性率为2% (2/100),且与旋毛虫病人和血吸虫病人血清均有交叉 反应。这些专家、学者们为广州管圆线虫病的诊断做出了巨大的贡献，探索了 许多免疫学检测方法，并一步步地往此病的理想诊断方法靠近，但均无法达到广州管圆线虫病检测的敏感性与特异性的完美统一。
近十年来，通过专家、学者们的不断努力，ELISA法开始广泛用于广州管圆 线虫病的检测。此法是利用酶反应测定抗体或抗原特异性反应方法，应用较广。 但传统的EIISA法存在一些不足(1)检测的敏感性和特异性需要进一步提高， 且重复性也不够好(2)需要专门的仪器设备如酶标仪、培养箱等来配合使用；
(3)操作人员需要经过专门培训，操作过程相对较为复杂，检测时间比较长；
(4 )检测过程局限在实验室内，不适合现场样品的分析。
本发明应用单克隆抗体技术和胶体金免疫技术研制出了 一种检测广州管圆 线虫病的金标快速诊断试剂盒。该试剂盒操作简便、快速，只需5~15min;敏 感性高、特异性强、重复性好，检测实验感染广州管圓线虫大鼠血清和广州管 圓线虫病人血清，检出率均为100%。本发明非常适合医院检验科、疾病防控中 心、社康中心、私人诊所等部门用于广州管圆线虫病的临床诊断、疗效考核和 流行病学调查，具有很高的实用价值和可观的经济及社会效益。
发明内容
本发明的第一目的是为了提供一种检测广州管圆线虫病的金标快速诊断试 剂盒，此试剂盒操作简便快速(只需5~15min)、敏感性高、特异性强、重复性 好、结果直观、无需专门设备、不受环境条件的干扰等优点，非常适合医院检 验科、疾病防控中心、社康中心、私人诊所等部门用于广州管圆线虫病的临床 诊断、疗效考核和流行病学调查，具有很高的实用价值。
本发明的第二目的是在于提供一种检测广州管圆线虫病的金标快速诊断试 剂盒的制备方法，它包括广州管圆线虫可溶性抗原的制备，抗广州管圆线虫单克隆抗体的制备和纯化，以及广州管圆线虫金标快速诊断试剂盒的制备。该法
灵敏度最低;险测限达到lng/ml，特异性高达100%。 本发明的第一目的可通过如下措施来实现
一种检测广州管圆线虫病的金标快速诊断试剂盒内设广州管圆线虫金标检 测板(1 )。所述广州管圆线虫金标检测板(1)是在PVC垫板(10 )上设有样品 端吸水垫(4 )、硝酸纤维膜检测层(6 )和末端吸水垫(9 )，在样品端吸水垫(4 ) 和硝酸纤维膜检测层(6)之间设有金标抗广州管圆线虫单克隆抗体垫(5),在 硝酸纤维膜检测层(6 )上包被有检测线(7 )和质控线(8 )。
本发明的第二目的可通过如下措施来实现
一种检测广州管圆线虫病的金标快速诊断试剂盒的制备方法主要包括
(一) 广州管圆线虫可溶性抗原的制备
从褐云玛瑙螺或福寿螺体内分离广州管圆线虫3期幼虫，按80 ~ 100条/只的 量人工感染SD大鼠，33~35天后从鼠肺动脉中分离得广州管圓线虫成虫，生理 盐水漂洗后冰冻干燥，研磨成粉，冷丙酮脱脂2~3次，经超声粉碎后反复冻融， 14 OOOrpm 4'C离心20min,上清液即为广州管圆线虫可溶性抗原，-20。C保存 待用。
(二) 抗广州管圆线虫单克隆抗体的制备和纯化
用广州管圆线虫成虫蛋白免疫BALB/c小鼠后，取免疫脾细胞与骨髓瘤细胞 SP2/0融合，用广州管圆线虫可溶性抗原进行筛选，并克隆化得到针对广州管圆 线虫的单克隆细胞林，将此单克隆细胞注入小鼠腹腔生产出大量的单克隆抗体， 用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化得到IgG类单克隆抗体，对于IgM类单抗，则用优球 蛋白沉淀法，该法适用于IgM和IgG3型单抗的提取，所获制品的抗体活性几乎 保持不变。(三) 胶体金的制备 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，在烧瓶加入100Qml双蒸水和10ml
1%氯金酸，加热至沸腾，加入20ml 1%柠檬酸三钠，继续煮沸约10-20min, 直到液体呈亮红色，将烧杯置于室温中冷却，冷藏保存；
(四) 胶体金标记抗体的制备
标记前，先1500rpm离心胶体金并去沉淀，后将月交体金和抗体分别以 0. lmol/L 1(20)3调pH至7. 4，在胶体金溶液中按20 ~ 80pg/ml加入抗广州管圓线 虫单克隆抗体，电》兹搅拌30min后加入5 %胎牛血清(BSA )，使溶液中BSA终浓 度为1 % ，以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀，静置后先1 200 ~ 1 800r/min 低速离心20min,弃去凝聚的沉淀，接着6 000 ~14 OOOg 4。C离心lh，吸出上 清，将沉淀用含1 % BSA和0. 02 % NaN3的Tr i s-HC 1緩冲液重悬为原体积的1 / 10 ， 4'C保存；
(四) 金标垫的制备
用二维喷动仪将标记好胶体金的抗广州管圆线虫单克隆抗体均匀地喷在玻 璃纤维膜上，喷液量为0. 8~2. O^il/cm, 37'C烘干过夜，封袋备用；
(五) 硝酸纤维膜检测层中检测线和质控线的制备
调试二维喷动仪，将浓度为0. 8 ~ 1. 5mg/ml的抗广州管圆线虫单克隆抗体 用1~3°/ 的曱醛固定后，均匀地喷在硝酸纤维膜中段，得到检测线(7);用1~ 3%的甲酪固定浓度为2~2. 5mg/ml的羊抗鼠IgG或IgM后，均匀地喷在硝酸纤 维膜上，距离检测线0. 5 ~ 1 cm处得到质控线(8 ),喷液量均为0. 8 ~ 2. Opl/cin, 37'C烘干过夜，封袋备用。
(六) 广州管圆线虫金标快速诊断试剂盒的组装与包装 将样品端吸水垫(4 )、金标垫(5 )、硝酸纤维膜检测层(6 )、末端吸水垫(9 )粘贴在PVC垫板(10 )上，用切条机将试纸裁剪成6 ~ 8cm长、3 ~ 5mm宽 规格试纸条，将试纸条装入广州管圆线虫循环抗原金标检测板内，加样孔(2) 正对样品端吸水垫(4 ),观察孔(3 )正对硝酸纤维膜;f企测层(6 )。将试纸条与 干燥剂封装在铝箔袋内，4 3(TC避光保存，切勿冻存。铝箔袋打开后应尽快使 用试纸条，受潮后试纸条将失效。
本发明试剂盒的工作原理当液体标本滴加在样品端吸水垫(4)上时，液 体即向质控线(8)处不断扩散，当液体到达金标垫(5)处时，抗广州管圆线 虫单克隆抗体金标记物被溶解，同时与标本中的循环抗原反应而形成复合物， 液体继续前移至检测线(7)处，金标记的复合物再与膜上检测线的抗广州管圓 线虫单克隆抗体结合形成金标单抗-循环抗原-单抗夹心复合物而呈现红色的 线条，多余的金标抗体继续前移至质控线(8)处与羊抗鼠IgG或IgM结合而呈 现红色的线条，最后残余的液体被末端吸水垫(9)吸收。
本发明与现有技术相比具有如下优点
( 一 )本发明的检测广州管圆线虫病的金标试剂盒，具有操作简便快速(只 需5 15min)、敏感性高(100%)、特异性强(100%)、重复性好、结果直观、 无需专门设备、不受环境条件的干扰、易于在广大群众中推广等优点，非常适 合医院检验科、疾病防控中心、社康中心、私人诊所等部门用于广州管圆线虫 病的临床诊断、疗效考核和流行病学调查，具有很高的实用价值和广阔的应用 前景。
(二)本发明的金标试剂盒的制备方法简便、稳定性好、重复性好，适合 高校和科研机构参考学习。
图l是广州管圆线虫金标检测板的外观结构示意图
1一检观J板；2—力口才羊孑L; 3-》见察孑L。
图2是广州管圆线虫金标检测板的内部结构示意图
4-样品端吸水垫；5-金标垫；6-硝酸纤维膜检测层；7-检观'J线；8-质控线； 9-末端吸水垫，IO-PVC垫板
图3是广州管圆线虫金标快速诊断试剂盒的阳性结果，样品液为广州管圆线虫 病人血清；
图4是广州管圆线虫金标快速诊断试剂盒的阴性结果，.样品液为正常人血清。
具体实施例方式
本发明还将结合实施例作进一步详述
实施例一 一种检测广州管圆线虫病的金标快速诊断试剂盒
参照图1,广州管圆线虫金标快速诊断试剂盒内设广州管圆线虫金标检测板
(1)
参照图2 ，所述广州管圆线虫金标检测板(1)是在PVC垫板(10 )上设有 样品端吸水垫(4 )、硝酸纤维膜检测层(6 )和末端吸水垫(9 )，在样品端吸水 垫(4)和硝酸纤维膜4企测层(6)之间设有金标抗广州管圆线虫单克隆抗体垫 (5),在硝酸纤维膜检测层(6)上包被有检测线(7)和质控线(8)。其中样品端吸水垫(4)和末端吸水垫(9)由多层滤纸制成，金标垫(5)为玻璃纤维 浸泡金标抗广州管圆线虫单克隆抗体制成。
所述的抗广州管@]线虫单克隆抗体的制备方法如下
(一)用广州管圆线虫成虫蛋白免疫BALB/c小鼠后，取免疫脾细胞与骨髓 瘤细胞SP2/0融合，杂交细胞通过在含有次黄噤呤(hypoxanthine， H)、氨基 喋呤(aminopterin， A)和胸腺嘧咬核苷(thymidine, T)的培养基(HAT)中 进行选择生长，用广州管圆线虫成虫蛋白分泌物包被EL ISA板进行筛选，并不断 克隆化得到针对广州管圆线虫成虫蛋白分泌物的单克隆细胞抹；
(二 )将此单克隆细胞注入BALB/c小鼠腹腔内，1 ~ 2周后腹腔产出大量的 单克隆抗体，小心抽取腹水，离心得到大量单克隆抗血清。 所述的抗广州管圆线虫单克隆抗体的纯化方法如下
(一) 用辛酸-碌u酸铵沉淀法纯化得到IgG类单克隆抗体，该法简单易行， 适合于提纯IgGi和IgG2b,其主要步骤如下取1份预处理过的腹水加2份 0. 06mol/L PH5. 0醋酸緩沖液，用lmol/L HC1调pH至4. 8;按每毫升稀释腹水 加lljul辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30min内加完，4。C静置2 小时，取出15 OOOg离心30min，弃沉淀；上清经尼龙筛过滤(125|iin)，加入 1/10体积的0. Olmol/L PBS,用lmol/L NaOH调pH至7. 2;在4。C下加入硫酸 铵至45%饱和度，作用30min，静置1小时；10 OOOg离心30min,弃上清；沉 淀溶于适量PBS (含137mmol/L NaCl， 2. 6mol/L KCl， 0. 2腿ol/L EDTA )中， 对50~100倍体积的PBS透析，4'C过夜，其间换水3次以上；取出10 OOOg离 心30min,除去不溶性沉渣，测定蛋白质含量后，分装，冻存备用。
(二) 对于IgM类单抗，则用优J求蛋白沉淀法，该法适用于IgM和IgGs型 单抗的提取，所获制品的抗体活性几乎保持不变。其操作步骤如下取一定量的预处理过的腹水，先后加入NaCl和CaCl2,使各自的浓度分别达0. 2mol/L和 25mmol/L,随之可见纤维蛋白的产生；经滤纸过滤后，滤液对100倍体积的去 离子水在4。C透析8 15小时，其间换水1~2次；取出后22 000g离心30min, 弃上清；将沉淀溶于pH8. 0 lmol/L NaCl, 0. lmol/L Tris-HC1溶液中，重复上 述的透析与离心；将沉淀的优球蛋白浓度调至5 10mg/ml，分装冻存备用。
实施例二广州管圆线虫金标快速诊断试剂盒的制备方法主要包括如下步
骤
(一) 广州管圆线虫可溶性抗原的制备
从褐云玛瑙螺或福寿螺体内分离广州管圆线虫3期幼虫，按80 ~ 100条/只的 量人工感染SD大鼠，33~35天后从鼠肺动脉中分离得广州管圆线虫成虫，生理 盐水漂洗后水冻干燥，研磨成粉，冷丙酮脱脂2~3次，经超声粉碎后反复冻融， 14 000rpm 4。C离心20min,上清液即为广州管圆线虫可溶性抗原，-20。C保存 待用。
(二) 抗广州管圆线虫单克隆抗体的制备和纯化方法与例一同
(三) 40nm胶体金的制备
① 1 %氯金酸的配制用1000ml双蒸水溶解10g氯金酸，0. 22^un滤膜过滤， 置4'C备用。
② 1°/。柠檬酸钠的配制用1000ml双蒸水溶解10g柠檬酸钠，0. 22拜滤膜 过滤，置4'C备用。
③ 方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，在烧瓶加入1000ml双 蒸水和10ml 1%氯金酸，加热至沸腾，加入20ml 1%柠檬酸三钠，继续煮沸约 10~20min，直到液体呈亮红色，将烧杯置于室温中冷却，制成颗粒直径为40nm的胶体金颗粒。4。C冷藏保存，注意避免污染及强光照射。
(四) 胶体金标记抗体的制备
① 0. 1M碳酸钾的配制用1000ml双蒸水溶解13. 8g碳酸钾，0. 22声滤膜 过滤，置4。C备用。
② 方法标记前，先1500rpm离心胶体金并去沉淀，后将胶体金和抗体分 别以0. 1Mol/L〖2(:03调pH至7. 4,在胶体金溶液中按20 ~ 80吗/ml加入抗广州 管圆线虫单克隆抗体，电磁搅拌30min后加入5%胎牛血清(BSA)，使溶液中 BSA终浓度为1 % ,以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀，静置后先1 200 ~ 1 800r/min低速离心20min，弃去凝聚的沉淀，接着6 000 ~ 14 OOOg 4°C离心lh, 吸出上清，将沉淀用含1%BSA和0. 02%NaNj々Tris-HCl緩沖液重悬为原体积 的1/10， 4'C保存;
(五) 金标垫的制备
用二维喷动仪将标记好胶体金的抗广州管圆线虫单克隆抗体均匀地喷在玻 璃纤维膜上，喷液量为0. 8~2. (Vl/cm, 37。C烘干过夜，封袋备用；
(六) 硝酸纤维膜检测层中检测线和质控线的制备
调试二维喷动^f义，将浓度为0. 8 ~ 1. 5 mg/ml的抗广州管圆线虫单克隆抗体 用1~3°/。的曱醛固定后，均匀地喷在硝酸纤维膜中段，得到检测线(7);用1~ 3%的曱醛固定浓度为2 ~ 2. 5mg/ml的羊抗鼠IgG或IgM后，均匀地喷在硝酸纤 维膜上，距离检测线0. 5 ~ 1 cm处得到质控线(8 ),喷液量均为0. 8 ~ 2. 0 pl/cm, 37'C烘干过夜，封袋备用。
(七) 广州管圆线虫金标快速诊断试剂盒的组装与包装 将样品端吸水垫(4 )、金标垫(5 )、硝酸纤维膜检测层(6 )、末端吸水垫(9 )
粘贴在PVC垫板(10 )上，用切条机将试纸裁剪成6 ~ 8cm长、3 ~ 5mm宽规格试纸条，将试纸条装入广州管圓线虫循环抗原金标检测板内，加样孔(2)正对样 品端吸水垫(4),观察孔(3)正对硝酸纤维膜检测层(6)。将试纸条与干燥剂 封装在铝箔袋内，4 30。C避光保存，切勿冻存。铝箔袋打开后应尽快使用试纸 条，受潮后试纸条将失效。
实施例三广州管圆线虫金标快速诊断试剂盒的使用
取出检测试剂盒，平放于操作台上，在加样孔内加入2滴(约100^1)人或 鼠类的脑脊液、血清等待测样品，5~15min可判定结果。结果判断在观察孔 内，检测线(T) A^控线(C)均出现紫红色线(如图3),判为阳性，循环抗 原的浓度越高，检测线(T)颜色越深；而在观察孔内，只有质控线(C)出现 一条紫红色线(如图4)时，则判为阴性；当观察孔内结果质控线(C)和检测 线(T)都不出现紫红色线或l义检测线(T)出现色线时，则为试剂盒失效。
实施例四广州管圆线虫金标快速诊断试剂盒特异性、灵敏度和稳定性的检
测
特异性试验选用68份实验感染广州管圓线虫SD大鼠血清、50份正常SD 大鼠血清、18份广州管圆线虫病病人血清、80份正常人血清、2份广州管圆线 虫成虫抗原稀释液、2份日本血吸虫抗原稀释液、2份人蛔虫抗原稀释液、2份 肝吸虫抗原稀释液、24份肺吸虫病病人血清、18份日本血吸虫病病人血清、38 份肝吸虫病病人血清、27份蛔虫病病人血清、12份嚢虫病病人血清、7份包虫 病病人血清、5份丝虫病病Ajk清，采用实施例二制备的广州管圆线虫循环抗原 金标快速诊断试剂盒进行检测，结果除了 68份实验感染广州管圆线虫SD大鼠 血清、18份广州管圓线虫病病人血清、2份广州管圆线虫成虫抗原稀释液在检测线(T)及质控线(C)均出现紫红色线而显阳性外，其余对照和病人血清均 只在质控线(C)出现一条紫红色线而显阴性。至此为止，此广州管圓线虫金标 快速诊断试剂盒检测的特异性为100%。
灵敏度试验取实施例二制备的广州管圓线虫金标快速诊断试剂盒，用于检 测稀释液倍比稀释的广州管圆线虫成虫可溶性抗原，10分钟判定结果(见表1), 广州管圓线虫金标快速诊断试剂盒可检测出浓度低至lng/ml的循环抗原量，显 示出较高的检测灵敏度。
表l SEA胶体金检测试纸敏感性的测定结果
成虫抗原0. 5ng/mllng/ml2ng/ml4ng/ml8ng/ml
检测结果—++++
稳定性试验将实施例二制备的广州管圆线虫金标快速诊断试剂盒分别放 置于4。C和室温(20~25°C) 3个月，取出后分别用广州管圆线虫病人血清进行 检测，测试的结果与敏感性和特异性测试结果一致。
权利要求
1、一种检测广州管圆线虫病的金标试剂盒，其外包装主要由加样孔(2)和观察孔(3)顺次分布于检测板(1)上，其检测板(1)特征在于在PVC垫板(10)的两端分别设有样品端吸水垫(4)和末端吸水垫(9)，在PVC垫板(10)中部设有硝酸纤维膜检测层(6)，在硝酸纤维膜检测层(6)与样品端吸水垫(4)交接处设有包被金标标记抗广州管圆线虫单克隆抗体的金标垫(5)，此金标垫(5)分别与样品端吸水垫(4)和硝酸纤维膜检测层(6)叠连相接，在离接口不远处的硝酸纤维膜检测层(6)上设有检测线(7)和质控线(8)，在检测线(7)和质控线(8)上分别包被有抗广州管圆线虫单克隆抗体和羊抗鼠IgG或IgM。
2、 如权利l所述的一种检测广州管圆线虫病的金标试剂盒，其特征在于所 述单克隆抗体为两种针对广州管圆线虫成虫抗原上不同决定簇的抗广州管圆线 虫单克隆抗体。
3、 如权利l所述的一种检测广州管圆线虫病的金标试剂盒的制备方法，包 括下列步骤A、 广州管圆线虫可溶性抗原的制备从褐云玛瑙螺或福寿螺体内分离广州管圆线虫3期幼虫，按80 ~ 100条/只的 量人工感染SD大鼠，33 - 35天后从鼠肺动脉中分离得广州管圓线虫成虫，生理 盐水漂洗后冰冻干燥，研磨成粉，冷丙酮脱脂2~3次，经超声粉碎后反复冻融， 14 OOOrpm 4。C离心20min，上清液即为广州管圆线虫可溶性抗原，-20。C保存 待用。B、 抗广州管圆线虫单克隆抗体的制备和纯化用广州管圓线虫成虫蛋白免疫小鼠后，取免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合， 用广州管圆线虫成虫抗原进行筛选，得到针对广州管圆线虫成虫的单克隆细胞 林，将此细胞注入小鼠腹腔生产出大量的单克隆抗体，用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化得到IgG类单克隆抗体，对于IgM类单抗，对于IgM类单抗，则用优球蛋白 沉淀法，该法适用于IgM和IgG3型单抗的提取，所获制品的抗体活性几乎保持 不变。C、 胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，在烧瓶加入1000ml双蒸水和10ml 1%氯金酸，加热至沸腾，加入20ml 1%柠檬酸三钠，继续煮沸约10~2Qmin, 直到液体呈亮红色，将烧杯置于室温，水浴中冷却，冷藏保存；D、 胶体金标记抗体的制备将胶体金和抗体分别以0.1Mol/LK2C03调pH至7.4，在胶体金溶液中按20 80pg/ml加入抗广州管圆线虫单克隆抗体，电石兹搅拌30min后加入5 %胎牛血清 (BSA ),使溶液中BSA终浓度为1 % ,以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀， 静置后先l 200 ~ 1 800r/min低速离心20min,弃去凝聚的沉淀，接着6 000 ~ 14 000g4。C离心lh，吸出上清，将沉淀用含1。/。BSA和0. 02。/。NaN3的Tris-HCl 緩冲液重悬为原体积的1/10, 4'C保存；E、 金标垫的制备用二维喷动仪将标记好胶体金的抗广州管圆线虫单克隆抗体均匀地喷在玻 璃纤维膜上，喷液量为0. 8~2. Onl/cm， 37。C烘干过夜，封袋备用；F、 硝酸纤维膜检测层中检测线和质控线的制备调试二维喷动仪，将浓度为0. 8~1.5mg/ml的抗广州管圆线虫单克隆抗体 用1~3°/。的甲醛固定后，均匀地喷在硝酸纤维膜中段，得到检测线(7);用1~ 3%的曱醛固定浓度为2 ~ 2. 5mg/ml的羊抗鼠IgG或IgM后，均匀地喷在硝酸纤 维膜上，距离检测线0. 5 ~ lcm处得到质控线(8 )，喷液量均为0. 8 ~ 2. Opl/cm, 37'C烘干过夜，封袋备用。G、广州管圆线虫金标快速诊断试剂盒的组装与包装将样品端吸水垫(4 )、金标垫(5 )、硝酸纤维膜检测层(6 )、末端吸水垫(9 ) 粘贴在PVC垫板(10 )上，用切条机将试纸裁剪成6 ~ 8cm长、3 ~ 5mm宽规格试 纸条，将试纸条装入广州管圆线虫金标检测板内，加样孔(2 )正对样品端吸水 垫(4),观察孔(3)正对硝酸纤维膜检测层(6)。将试纸条与干燥剂封装在铝 箔袋内，4-3(TC避光保存，切勿冻存。铝箔袋打开后应尽快使用试纸条，受潮 后试纸条将失效。
全文摘要
本发明涉及一种检测广州管圆线虫病的金标试剂盒和制备方法，包括广州管圆线虫可溶性抗原的制备，单克隆抗体的制备和纯化，胶体金标记抗广州管圆线虫单克隆抗体，以及广州管圆线虫金标快速诊断试剂盒的制备。该试剂盒包括广州管圆线虫金标检测板；此检测板由PVC垫板、吸水垫、涂覆胶体金标记广州管圆线虫单克隆抗体的金标垫、包被有广州管圆线虫单克隆抗体的检测线和羊抗鼠IgG或IgM的质控线构成。该试剂盒操作简便、快速，只需5～15min；敏感性高、特异性强，检测实验感染广州管圆线虫大鼠血清和广州管圆线虫病人血清，检出率均为100％。本发明将在广州管圆线虫病的快速诊断和考核疗效方面起到重要作用。
文档编号G01N33/569GK101408547SQ20081014274
公开日2009年4月15日 申请日期2008年8月5日 优先权日2008年8月5日
发明者张仁利, 朱兴全, 陈木新 申请人:深圳市疾病预防控制中心