专利名称：TaqMan探针实时荧光PCR检测广州管圆线虫感染性螺类的制作方法
TaqMan探针实时荧光PCR检测广州管圆线虫感染性螺类
1技术领域 本发明涉及一种新型分子生物学检测方法，具体的是建立一种螺类感染广州管圆 _& (Angiostrongylus cantonensis, AC)白勺 PCR 贝
背景技术：
广州管圆线虫病是一种新发食源性人畜共患传染病。人们由于误食带疫福寿螺、 田螺、环棱螺、褐云玛瑙螺等贝类，导致了本病的频繁暴发。到目前为止仍没有从中间宿主 中检测广州管圆线虫的报道。传统的广州管圆线虫检测仍停留在人工分离、显微镜检查、专 家鉴定等阶段，但检测周期较长、且灵敏度极低等缺点不能被广泛应用，本申请人已经成功 运用常规PCR检测方法检测螺类感染广州管圆线虫，但检测周期长、灵敏度低，不利于致病 突发事件的应急处理，不能满足进出境贝类食品检测和疫源地野外疫情监测中快速准确的 需要。
发明内容
本发明针对上述现有技术所存在的不足技术展开的实验研究，旨在提供一种结果 准确性好、灵敏度高、成本低廉的检测方法，推进从广州管圆线虫感染的中间宿主体内快速 检测出虫体的检测方法的推广。所要解决的问题是从感染广州管圆线虫的中间宿主体内快速检测出虫体，从而得 到灵敏度较高、结果准确的PCR检测方法。3. 1发明所使用引物和探针AC的引物和探针 3. 2 扩增反应总体积为 20 μ L，其中 2 X Taq PCR MasterMix 混合液 10 μ L, Taqman 探针1 μ L、上、下游引物各1 μ L，模板1 μ L，余下用灭菌水补足。混勻后放入PCR扩增仪中 进行扩增。经过优化后PCR反应体系中为Mg2+浓度为4mM ；引物浓度为20 μ M ；探针浓度为 10 μ Μ。3. 3两步法扩增反应程序为94°C预变性3min ；94°C 10s，60°C 30s，循环40次。
图1荧光PCR扩增后出现较好的扩增曲线注1 阳性福寿螺
图2电泳后用凝胶成像仪观察出现115bp片段注M lOObp Marker ； 1 阳性福寿螺
具体实施例方式5.1材料的准备采自各主要疫源地，采集地点以城郊垃圾堆旁经常有老鼠出没的沟渠菜地为主。5. 2实时荧光PCR方法的建立5. 2. 1引物和TaqMan探针的设计合成用引物设计软件同时设计TaqMan探针及引物，经NCBIBlast检验其特异性。交由 上海生工生物技术服务有限公司合成。引物和探针见表1，扩增片段长115bp。TaqMan探 针5’端标记荧光报告基团为6-羧荧黄(6-FAM)，3’端标记荧光淬灭基团为四甲基罗丹明 (TAMRA)。表1AC的引物和探针 5. 2. 2中间宿主螺类DNA提取5. 2. 2. 1异硫酸氰胍法将准备好的阳性样品和阴性对照样品，剪碎后分置于研 钵内，加液氮研磨成粉末取50mg，再加入200 u L TE，混勻；加入400 u L裂解液，涡旋混勻， 放置lOmin ；然后加入300 u L Tris-饱和酚和300 y L氯仿异戊醇(24 1)，剧烈震荡 15s，13000r/min离心lOmin ；取上清，加等体积的氯仿异戊醇(24 1)，剧烈震荡15s, 13000r/min离心lOmin ；取上清，加等体积的氯仿，剧烈震荡15s，13000r/min, lOmin ；取上 清，加0. 8倍体积的异丙醇，12000r/min, lOmin,弃上清；取沉淀，加入70%的的无水乙醇 lmL，离心13000r/min，弃上清，后于真空干燥仪中干燥2min，后加入100 u L灭菌双蒸水溶 解。用核酸蛋白分析仪测定DNA的浓度，置于_20°C保存备用。5. 2. 2. 2试剂盒提取法TIANGEN组织基因组DNA提取试剂盒提取，按使用说明书 操作提取DNA。5. 3 扩增反应总体积为 20 ii L，其中 2 X Taq PCR MasterMix 混合液 10 ii L, Taqman 探针1 p L、上、下游引物各1 i! L，模板1 i! L，余下用灭菌水补足。混勻后放入PCR扩增仪中 进行扩增。两步法扩增反应程序为94°C预变性3min ；94°C 10s,60°C 30s，循环40次。5. 5PCR产物检测与鉴定在荧光定量PCR仪上扩增后出现较好的扩增曲线，则说 明样品被广州管圆线虫所感染，且进一步取PCR产物lOy L在1. 5%琼脂糖凝胶(含溴化乙 锭)上以98V电泳40min，用凝胶成像仪观察。如果观察到在115bp的位置出现条带，则说 明所检测的样品为广州管圆线虫所感染。
权利要求
一种用于检测广州管圆线虫(Angiostrongylus Cantonensis，AC)感染中间宿主螺类的快速检测方法，其特征是使用特异性探针对定量分子进行识别，具有很高的准确性。其引物及探针为AC的引物和探针Form 1The probe and primer of AC
2.根据权利要求1所述的用于螺类感染广州管圆线虫的检测方法，经过一系列的优化 后PCR反应体系中引物及探针浓度分别为Mg2+浓度为4mM ；引物浓度为20 y M ；探针浓度为 10 u M。扩增反应总体积为20 ii L，其中2 X Taq PCR MasterMix混合液10 u L, Taqman探针 1 u L、上、下游引物各1 i! L，模板1 i! L，余下用灭菌水补足。
3.根据权利要求1或2所述的用于广州管圆线虫感染中间宿主螺类的检测方法，其实 时荧光PCR两步法扩增反应程序为94°C预变性3min ；94°C 10s,60°C 30s，循环40次，结束 反应。
全文摘要
广州管圆线虫病是一种食源性人畜共患病，主要通过误食疫螺而感染。技术发明“TaqMan探针实时荧光PCR检测广州管圆线虫感染性螺类”是基于现代分子生物学技术，应用于螺类感染广州管圆线虫的检测方法。目的提供一种快速、准确地检测螺类感染广州管圆线虫的方法。技术要点(1)引物-(上)5’-TGA TGC TTG TGC GGT TTT C-3’，引物-(下)5’-CCGAAG GCA AAG CAC ACA C-3’，探针5’-CGC TAT ACA CGC ACA TTT GCC GG-3’；(2)反应体系总体积为20μL，其中2×Taq PCR MasterMix 10μL，Taqman探针1μL、上、下游引物各1μL，模板1μL，余下用ddH2O补足；(3)反应程序94℃预变性3min；94℃10s，60℃30s，循环40次。用途本发明为食品检疫、疫情调查与监测提供了新的技术手段，对于预防和控制广州管圆线虫病的发生具有重要意义。
文档编号G01N21/64GK101875965SQ20091011157
公开日2010年11月3日 申请日期2009年4月28日 优先权日2009年4月28日
发明者佘书生, 周卫川, 王寿昆, 邵碧英, 陈寿玲, 陈文炳, 魏纪玲 申请人:周卫川;魏纪玲;佘书生