一种荧光探针HSeSeH的制备及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及荧光探针领域，具体涉及一种可用于选择性检测硫化氢的荧光探 针。在二硒化物焚光母体上引入2-(2-羟基苯基）苯并噻唑（2-(2-hydroxypheny 1) benzothiazole)，二硒键和酯键是反应活性中心，探针与H2S作用后荧光发生明显的增强， 以实现对H 2S的选择性检测，尤其可应用于检测生物体系内的H2S。
【背景技术】
[0002] 硫化氢（H2S)是一种广泛存在于哺乳动物体内的有毒气体，除了具有毒性外，硫化 氢还具有保护细胞，传导信号的功能。它的代谢正常与否与心脏病、高血压、唐氏综合症、老 年痴呆症等多种疾病相关联。也因此，如何及时准确地检测细胞内硫化氢的代谢情况对于 生理学和病理学来讲就显得尤为重要。
[0003] 荧光探针是有效检测生命体内硫化氢的手段之一。一个具有应用前景的荧光探针 应具有作用前后荧光变化明显、对目标分子响应快、选择性好、合成简单等优点。近年来，能 够应用于检测活细胞中硫化氢的荧光探针不在少数，但绝大多数合成响应较慢，且在可见 光区更长区段内（对生物组织伤害更小）用来检测硫化氢的荧光探针仍寥寥无几。
【发明内容】
[0004] 本发明就是针对上述问题，提供了一种可以用于选择性检测细胞内硫化氢的荧光 探针。此类荧光探针，其本身具有较弱的荧光，与H 2S作用后荧光发生增强，且荧光强度正 比于H2S浓度，从而指示H2S的存在或定量测定H 2S的浓度。尤其可以应用于检测细胞内的 h2s〇
[0005] 本发明采用如下技术方案：采用二硒化物作为荧光母体，在二硒化物母体上引入 2-(2-羟基苯基）苯并噻唑（2-(2_117(11'(?7。1161171)&6112〇1：11丨32〇16)利用反应前后焚光性质 的差异，指示H 2s的存在或定量测定H2S的浓度，尤其可用于检测细胞内的H2S。
[0006] 所述荧光探针的结构式如结构式I下：
[0007]
[0008] 结构代号：HSeSeH。
[0009] 所述荧光探针的制备方法为：以二硒化物作为荧光母体，在二硒化物母体上引入 2_ (2_羟基苯基）苯并噻唑（2_ (2-hydroxyphenyl) benzothiazole)，具体制备步骤如下：
[0010] 1)重氮盐的制备：取邻氨基苯甲酸与稀盐酸和水配成稀溶液，用冰盐浴冷却至 5°C，向稀溶液中加入亚硝酸钠溶液，进行反应，得到相应的重氮盐；
[0011] 2)二硒化二钠的制备：将硒粉与硼氢化钠溶液于室温下搅拌反应至硒粉溶解，得 到的反应液用氢氧化钠水溶液进行碱化，得相应的二硒化二钠；
[0012] 3)二苯基二硒的制备：将步骤2中得到的二硒化二钠用冰浴冷却至5°C，将步 骤1)中得到的重氮盐加入其中，边滴加边搅拌，滴加的过程中要保证溶液的温度在l〇°C 以下，滴加完毕后60°C继续搅拌3h，接着常温下继续搅拌3h，之后对反应液进行酸化，过 滤，得到固体，对固体洗涤、除杂，进一步酸化后，过滤得到固体用水洗涤至中性，烘干得到
[0013] 4)酰氯的制备：取二苯基二硒和苯混合，加热至80°C，向其中加入氯化亚砜，继续 搅拌加热至80°C，直至原料完全溶解，真空旋干混合液，利用二氯甲烷对产物进行重结晶， 得到酰氯；
[0014] 5)探针的制备：将步骤4)所得的酰氯与2_(2' -羟基苯基）苯并噻挫、三乙胺常 温下在二氯甲烷中反应l〇h，得到相应的荧光探针。
[0015] 步骤1)中所述的邻氨基苯甲酸与亚硝酸钠加入量的摩尔比为1 :1 ;
[0016] 步骤2)中所述的硒粉与硼氢化钠加入量的摩尔比为1 :1，加入的氢氧化钠与硒粉 的摩尔比为1. 9 :1 ;
[0017] 步骤3)中重氮盐与二硒化二钠加入量的摩尔比为1 :1 ;
[0018] 步骤4)中二苯基二硒与苯加入量的摩尔比为1 :60,加入的氯化亚砜与二苯基二 硒的比例为2. 5 :1 ;
[0019] 步骤5)中所述的酰氯与2_(2'_羟基苯基）苯并噻挫、三乙胺的摩尔比为1 :2. 5 : 2〇
[0020] 所述的荧光探针HSeSeH可用于硫化氢的定性或定量检测。
[0021] 所述的荧光探针应用于检测硫化氢时，其是生成具有结构II和结构III的化合物， 从而导致荧光变化；
[0022]
[0023] 结构II的名称：2_ (2-羟基苯）苯并噻唑；
[0024] 结构III的名称：苯邻位含硒与硫酯键的五元环；
[0025] 所述的荧光探针用于定量检测硫化氢时，荧光探针与硫化氢作用后，460nm处测得 的荧光强度正比于硫化氢的浓度。
[0026] 所述的荧光探针可用于检测活体细胞内内源性硫化氢，同时也可以检测外源性硫 化氢。
[0027] 本发明的有益效果：该化合物在H2S存在下荧光发生显著增强，可用于高选择性、 高灵敏性地定性及定量检测H 2S。尤其是，该化合物可用于生物体系内H2S的检测，这对于 深入研究H2S在生物体内生理和病理过程的动力学机理具有重要意义。
【附图说明】
[0028] 图1本发明提供的荧光探针检测硫化氢的原理示意图；
[0029] 图2本发明合成的探针的4 NMR谱图；
[0030] 图3本发明合成的探针的13C NMR谱图；
[0031] 图4实施例2中荧光探针的光谱图：紫外可见吸收光谱（a)、荧光发射光谱（b);
[0032] 图5实施例3中9?光探针对硫化氣的选择性不意图；
[0033] 图6实施例4中焚光探针对过量硫化钠的检测示意图；
[0034] 图7实施例5中荧光探针对硫化钠的定量检测；
[0035] 图8实施例6中荧光探针在不同PH条件下的荧光强度；
[0036] 图9实施例7中9?光探针的动力学不意图；
[0037] 图10实施例8中荧光探针在RAW264. 7细胞中成像示意图。
【具体实施方式】
[0038] 实施例1 (探针的合成）：
[0039] 邻氨基苯甲酸的制备：
[0040] 取30. llg(0. 2mol)邻氨基苯甲酸甲酯、200mL甲醇、100mL四氢呋喃、含有9. 12g 氢氧化锂的100mL水溶液，41°C反应，用TLC追踪，用乙酸乙酯：石油醚=1:1作为展开剂 进行追踪，直至反应结束。溶液由无色透明的液体变为浅黄色液体，当反应完成后，将溶剂 旋干。用50mL水和30mL乙醚萃取三次，将水相用1M的盐酸调至PH = 4左右，抽滤，烘干。 得到26. 3g浅黄色固体邻氨基苯甲酸，产率为96%。探针的合成：
[0041] (1)重氮盐的合成：将18.0(^(0.130111〇1)邻氨基苯甲酸加入到由3811^36%的盐 酸和100mL水配成的稀溶液中，用冰盐浴冷却至5°C ;将含8. 99g亚硝酸钠（0. 130mol)的 30mL水溶液向其中滴加，边滴加边搅拌，待反应液为土黄色澄清的液体时，停止搅拌，得到 相应的重氮盐。
[0042] ⑵Na2Se2的合成：在N2保护下，向含有35mL水和5. 10g(0. 065mol)硒粉的三口 瓶中滴加含4.45g(0. 130mol)硼氢化钠的水溶液100mL。等硒粉溶解，分批加入另一部分 5. 13g(0. 065mol)硒粉。得到的反应混合液继续搅拌和加热30min以保证硒粉完全溶解。 产生的棕红色反应液用25mL浓度为10mol/L的氢氧化钠水溶液碱化，得到相应的Na 2Se2。
[0043] 3)二苯基二硒的制备：将步骤2)中得到的反应液用冰浴冷却至5°C以下，将步骤 1)得到的重氮盐全部滴加到Na2Se2S应液中，在滴加的过程中，一定要保证慢慢的滴加，反 应温度必须控制在l〇°C以下，在滴加的过程中会产生气泡，必须保证气泡消失后方可继续 滴加。滴加完毕后继续搅拌，反应液呈现红褐色，60°C下继续搅拌3小时，接着常温下搅拌 3小时。待反应结束后，混合液用稀盐酸酸化，使得混合液的PH在3-4,然后过滤。得到棕 红色固体用水洗涤，然后用碳酸氢钠水溶液溶解，过滤除去不溶的杂质，得到的棕红色液体 用稀盐酸酸化至PH〈1。过滤的棕红色的固体，用水充分洗涤至中性。紫外烘干，得到的相应 棕红色固体二苯基二硒9. 86g，产率为37. 92%。用熔点仪测定熔点为285°C。
[0044] 4)在队保护下，取上述化合物2.5g(6.22mmol)至于100mL三口瓶中，加入33mL 苯，加热至85°C，待苯回流后，缓慢滴加1. 85g(15. 68mmol)氯化亚砜，继续搅拌加热，直至 原料完全溶解。反应结束后，将反应混合液在真空状态下旋干。利用二氯甲烷对产物进行 重结晶，得到浅黄色菱形的晶体酰氯。
[0045] 5) ^
的合成：
[0046] 在N2保护下，取菱形的晶体1. 96g(4. 47mmol)，加入0· 90g(8. 95mmol)三乙胺， 17mL二氯甲烧，加入2. 54g(ll. 2mmol)2(2-羟基苯基）苯并噻挫，室温下反应，TLC追踪，二 氯甲烷：石油醚=2 :1 (体积比）的展开剂分离。得到纯白色的固体粉末探针HSeSeHl. 57g， 产率为43%，熔点为295°C。制得的探针的iNMR和13CNMR如下：
[0047] iNMR (400MHz，d6-DMS0) δ (ppm) : 8. 53-8. 48 (d，1H)，8. 37-8. 32 (d，1H)，8. 15-8. 0 8 (d, 1H), 7. 81-7. 77 (d, 1H), 7. 77-7. 74 (d, 1H), 7. 75-7. 69 (d, 1H), 7. 66-7. 62 (d, 2H), 7. 61- 7. 55 (m，2H)，7. 54