一种荧光探针及其制备方法和在检测过氧酸中的应用
【专利摘要】本发明涉及一种荧光探针及其制备方法和在检测过氧酸中的应用。所述的荧光探针是5?二甲胺?苊醌，具有如(Ⅰ)所示的结构。制备方法，包括如下步骤：在N2保护下，将5?溴?苊醌，二甲胺盐酸盐，碘化亚铜和氢氧化钾与N,N?二甲基甲酰胺混合，加热反应2?7h，过滤，干燥，分离，得目标产物。本发明的荧光探针，其本身无荧光，与过氧酸作用后荧光发生增强，且荧光强度正比于过氧酸的浓度，从而指示过氧酸的存在或定量测定过氧酸的浓度。
【专利说明】
一种荧光探针及其制备方法和在检测过氧酸中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及荧光探针领域，具体的涉及一种可用于选择性检测过氧酸的荧光探 针。
【背景技术】
[0002] 烯烃的环氧化为过氧酸的主要应用。例如，在纺织和造纸行业中作为漂白剂。由于 强的抗菌作用，过氧乙酸和过氧柠檬酸被广泛用作消毒剂。其最大的优点为消毒后只剩下 无毒的水和酸，与其他含氯化合物相比更加环保。所以，被广泛的应用在食品饮料，医院和 农业上。但过氧乙酸对于皮肤，呼吸道及眼睛都有强刺激性。也因此，如何准确的检测过氧 乙酸就显得尤为重要。有文献报道指出CEP病人的尿液中发现了卟啉基过氧酸的存在，因此 体内活性氧氧化大分子羧酸变为过氧酸的可能性是存在的。如果有方法可以在人体中准确 的检测过氧酸，这对于深入研究过氧酸在生物体内生理和病理过程的动力学机理具有重要 意义。
[0003] 目前，检测过氧酸的方法甚少，而检测过氧乙酸的方法不在少数，但由于过氧乙酸 常与双氧水共存，双氧水的干扰导致检测准确度不高;有些方法具有局限性，无法检测气相 过氧乙酸;还有方法收集样品后必须立即检测，条件苛刻。因此，研究一种选择性好，应用范 围广，方便可靠的检测过氧乙酸甚至是过氧酸的方法具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明就是针对上述问题，提供了一种可以用于选择性检测过氧酸的荧光探针。 此类荧光探针，其本身无荧光，与过氧酸作用后荧光发生增强，且荧光强度正比于过氧酸的 浓度，从而指示过氧酸的存在或定量测定过氧酸的浓度。
[0005] 本发明采用如下技术方案:一种荧光探针，所述的荧光探针是5-二甲胺-苊醌，具 有如（I)所示的结构：
[0006]
[0007] 上述的荧光探针的制备方法，包括如下步骤:在N2保护下，将5-溴-苊醌，二甲胺盐 酸盐，碘化亚铜和氢氧化钾与N，N_二甲基甲酰胺混合，加热反应2_7h，过滤，干燥，分离，得 目标产物。
[0008] 上述的制备方法，5-溴-苊醌与二甲胺盐酸盐、碘化亚铜、氢氧化钾的摩尔比为1: 1:0.1:2〇
[0009] 上述的制备方法，反应温度为50-100°C。
[0010] 上述的荧光探针在定性或定量检测过氧酸中的应用。其作用机理是：以无荧光的 5-二甲胺-苊醌为荧光探针，与过氧酸作用后，生成强荧光的4-二甲胺-1，8-萘酐，从而通过 反应前后荧光强度的差异，达到指示过氧酸的存在或定量测定过氧酸的浓度的目的。
[0011] 方法如下:于含有过氧酸的溶液中，调节溶液的pH为2.5-10.5，加入上述的荧光探 针，于530nm处测定荧光强度。
[0012] 本发明，所述的过氧酸的结构如（III)所示：
[0013]
[0014] 其中，R为烷基取代基、芳基取代基或
听述的R '为氢或烷基取代基。
[0015] 优选的，所述的烷基取代基是的烷基。
[0016] 优选的，所述的过氧酸是过氧乙酸、过氧丁二酸、过氧苯甲酸、间氯过氧苯甲酸、过 氧氨基酸、过氧肽或过氧蛋白质。
[0017] 本发明，所述的荧光探针应用于检测过氧酸时，其是生成具有结构（II)的化合物， 从而导致荧光变化；
[0018]
[0019]本发明的有益效果是:本发明的荧光探针，在过氧酸存在下荧光发生显著增强，可 用于高选择性、高灵敏性地定性及定量检测过氧酸。尤其是，该荧光探针可用于生物体系内 过氧酸的检测，这对于深入研究过氧酸在生物体内生理和病理过程的动力学机理具有重要 意义。
【附图说明】
[0020] 图1是本发明合成的荧光探针检测过氧酸的原理示意图。
[0021] 图2是本发明合成的荧光探针的咕NMR谱图。
[0022]图3是本发明合成的荧光探针的质谱。
[0023]图4a是实施例2中荧光探针与过氧乙酸响应后的紫外可见吸收光谱。
[0024]图4b是实施例2中荧光探针与过氧乙酸响应后的荧光发射光谱。
[0025]图5是实施例2中荧光探针对过氧乙酸的选择性示意图。
[0026]图6是实施例2中荧光探针对过量过氧乙酸的检测示意图。
[0027]图7是实施例2中荧光探针对过氧乙酸的定量检测。
[0028]图8是实施例2中荧光探针在不同PH条件下的荧光强度。
[0029] 图9是实施例2中荧光探针与过氧乙酸、过氧丁二酸、过氧苯甲酸、间氯过氧苯甲酸 响应后荧光发射光谱。
[0030] 图10是实施例2中荧光探针与各种过氧氨基酸、过氧谷胱甘肽、过氧牛血清蛋白响 应后荧光发射光谱。
【具体实施方式】
[0031] 实施例1 5-二甲胺-苊醌荧光探针的合成
[0032] (一 )5_二甲胺-苊醌荧光探针的合成
[0033] 1、5-溴-苊醌的合成：
[0034] 在氮气保护下，取3g危醌（16.5mmol)、5mL的液溴（180mmol)，加入到50mL的单口瓶 中，搅拌下，缓慢升温至60-70 °C，反应8h。将反应液冷却至室温，向其中滴加饱和Na2S03溶 液，至红色溴全部消耗为止，然后过滤，干燥，得粗产品，并用醋酸重结晶4-5次。得淡黄色的 5-溴-苊醌纯品3.9g，该化合物的产率为90%。
[0035] 2、5_二甲胺-苊醌荧光探针合成：
[0036] 在氮气保护下，分别取208mg 5-溴-苊醌（0.8mmol)，65.2mg二甲胺盐酸盐 (0.8mmol)，15 · 2mg鹏化亚铜（0 · 08mmol)，89 · 8mg氛氧化钟（1 · 6mmol)，50mL干燥的DMF，在80 度油浴中搅拌。反应通过TLC跟踪，至原料消耗完全后停止反应。待反应液冷却，过滤，滤液 旋干得暗红色固体。利用柱层析进行分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇= l:200v/v)，得到暗红 色的固体粉末45mg，产率为25 %。
[0037](二)5_二甲胺-苊醌荧光探针的1H NMR谱和质谱
[0038] 合成的5-二甲胺-苊醌荧光探针的1H NMR谱和质谱如图2和图3所示。
[0039] 1HNMR(400MHz,CDCl3)5(ppm):8.27(d,lH),7.98(d,lH),7.89(d,lH),7.59(dd, lH)，6.98(d，lH)，3.19(s，6H)〇
[0040] HRMS m/z Ci4HiiN02Calcd for 225.0791，Ci4Hi2N02Calcd for 226.0791，found [Ci4Hi2N02]+226.0874。
[0041] 实施例2 5-二甲胺-苊醌荧光探针在定性和定量检测过氧酸中的应用
[0042] ( -)5_二甲胺-苊醌荧光探针的吸收与发射谱图
[0043] 取0.5mL的磷酸缓冲溶液(0.1M pH = 7.40)和10yL 5mM的荧光探针储备液加入到 不同的离心管中，再依次将5mM的体积为0、1、2.5、5、10yL的过氧乙酸溶液和50mM的体积为 1.5、2、2.5、3、4、5、7、9、15、25以1^的过氧乙酸溶液加入到对应的离心管中，最后加入4.511^的 1,4-二氧六环。将溶液依次加入到比色皿中，测其紫外吸光度，设置光栅的宽度为5nm，收集 350-550nm的吸收光谱信息，再用430nm去激发，收集440-700nm的荧光变化情况。测量紫外 可见吸收光谱（图4a)和发射光谱（图4b)。如图4a和4b所示，随着过氧乙酸浓度的增加，吸收 波长的位置发生红移;荧光发射强度逐渐升高，表明探针对过氧乙酸有响应。结果显示荧光 探针响应后的最大激发波长为430nm、最大发射波长为530nm〇
[0044](二)5-二甲胺-苊醌荧光探针对过氧乙酸的选择性
[0045] 取0.5mL的磷酸缓冲溶液(0.1M pH = 7.40)和10yL 5mM荧光探针的储备液加入到 不同的离心管中，再依次取20μΜ过氧乙酸、250μΜ次氯酸、250μΜ过氧化氢、250μΜ单重态氧、 250μΜ次溴酸、250μΜ羟基自由基、250μΜ过氧化亚硝酰加入到相应的离心管中，最后加入 4.5mL 1，4-二氧六环。将溶液依次加入到比色皿中，测其荧光强度，设置激发、发射狭缝为 5nm，用430nm去激发，收集440-700nm的荧光变化情况。结果如图5所示，图5表明荧光探针对 过氧乙酸具有很好的选择性，体系荧光显著增强。测定条件下，相比于过氧乙酸，其他物质 导致的荧光增强可以忽略。
[0046](三)5_二甲胺-苊醌荧光探针对过量过氧乙酸的检测
[0047] 取0.5mL的磷酸缓冲溶液(0.1M pH = 7.40)和10yL 5mM的荧光探针储备液加入到 不同的离心管中，再依次将5mM的体积为0、1、2.5、5、10yL的过氧乙酸溶液和50mM的体积为 1.5、 2、2.5、3、4、5、7、9、15、25以1^的过氧乙酸溶液加入到对应的离心管中，最后加入4.511^的 1，4-二氧六环。将溶液依次加入到比色皿中用430nm去激发，收集440-700nm的荧光变化情 况。结果如图6所示，由图6可见，随过氧乙酸浓度的增长，荧光强度逐渐增大。
[0048](四）5_二甲胺-苊醌荧光探针对过氧乙酸的定量检测
[0049] 取0.5mL的磷酸缓冲溶液(0.1M pH = 7.40)和10yL 5mM的荧光探针储备液加入到 不同的离心管中，再依次将5mM的体积为0、1、2.5、5、10yL的过氧乙酸溶液和50mM的体积为 1.5、 2、2.5、3、4、5yL的过氧乙酸溶液加入到对应的离心管中，最后加入4.5mL的1，4-二氧六 环。将溶液依次加入到比色皿中用430nm去激发，收集440-700nm的荧光变化情况。结果如图 7所示，由图7可见，当过氧乙酸的最终测试浓度在50uM以下，荧光探针的荧光强度与过氧乙 酸的浓度呈现很好的线性正相关关系。相应的线性回归方程为F53Qnm = 0.1809 XC(过氧乙 酸)+6.4306，其线性相关系数为R = 0.93961。
[0050](五)不同的PH对5-二甲胺-苊醌荧光探针荧光强度的影响
[00511取10yL5mM荧光探针的储备液加入到不同的离心管中，再依次将20yL 5mM过氧乙 酸储备液加入到相应的离心管中，最后加入5mLpH分别为2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、 9.5、 10.5、11.5、12.5的1，4-二氧六环和磷酸盐缓冲溶液的混合液（1，4-二氧六环:磷酸盐 缓冲溶液=9: lv/v)中。将溶液依次加入到比色皿中，测其荧光强度，设置激发、发射狭缝为 5nm，用430nm去激发，对该^ 个不同pH条件下的反应液收集焚光变化情况。结果如8所示， 由图8可见，在pH为2.5到10.5的pH条件下，荧光探针的荧光在过氧乙酸作用下可以显著增 强，pH对该荧光探针有影响，且在PH = 7.4左右的生理PH下荧光强度较强。也说明该荧光探 针较适合应用于生物体内从而进行生物检测。
[0052](六)5_二甲胺-苊醌荧光探针与过氧酸的发射光谱
[0053] 取0.5mL的磷酸缓冲溶液(0.1M pH = 7.40)和10yL 5mM的荧光探针储备液加入到 不同的离心管中，再依次将5μΜ过氧乙酸，过氧丁二酸，过氧苯甲酸，间氯过氧苯甲酸溶液加 入到对应的离心管中，最后加入4.5mL的1,4-二氧六环。将溶液依次加入到比色皿中用 430nm去激发，收集440-700nm的荧光变化情况。结果如图9所示，由图9可见，荧光探针对此 类过氧酸具有很好响应，体系荧光显著增强。说明荧光探针对其他碳链过氧酸同样适用。
[0054](七)5_二甲胺-苊醌荧光探针与过氧酸的发射光谱
[0055] 取0.5mL的磷酸缓冲溶液(0.1M pH = 7.40)和10yL 5mM的荧光探针储备液加入到 不同的离心管中，再依次将5μΜ过氧精氨酸，过氧白氨酸，过氧酪氨酸，过氧色氨酸，过氧苯 丙氨酸，过氧半胱氨酸，过氧蛋氨酸，过氧丙氨酸，过氧异亮氨酸，过氧牛血清蛋白，过氧谷 胱甘肽溶液加入到对应的离心管中，最后加入4.5mL的1,4-二氧六环。将溶液依次加入到比 色皿中用430nm去激发，收集440-700nm的荧光变化情况。结果如图10，由图10可见，荧光探 针对此类过氧氨基酸，过氧肽，过氧蛋白质具有很好响应，体系荧光显著增强。说明探针对 生物体中的过氧酸同样适用。
【主权项】
1. 一种巧光探针，其特征在于，所述的巧光探针是5-二甲胺-起酿，具有如（I)所示的结 构：2. 权利要求1所述的巧光探针的制备方法，其特征在于:包括如下步骤:在化保护下，将 5-漠-起酿，二甲胺盐酸盐，舰化亚铜和氨氧化钟与N，N-二甲基甲酯胺混合，加热反应2-化， 过滤，干燥，分离，得目标产物。3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：5-漠-起酿与二甲胺盐酸盐、舰化亚 铜、氨氧化钟的摩尔比为1:1 :〇. 1:2。4. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于:反应溫度为50-100°C。5. 权利要求1所述的巧光探针在定性或定量检测过氧酸中的应用。6. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于方法如下：于含有过氧酸的溶液中，调节溶 液的抑为2.5-10.5，加入权利要求1所述的巧光探针，于530nm处测定巧光强度。7. 根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述的过氧酸的结构如(III)所示：其中，R为烷基取代基、芳基取代基国斤述的R '为氨或烷基取代基。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于:所述的烷基取代基是Ci-Cio的烷基。9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于:所述的过氧酸是过氧乙酸、过氧下二酸、过 氧苯甲酸、间氯过氧苯甲酸、过氧氨基酸、过氧肤或过氧蛋白质。
【文档编号】G01N21/64GK105837458SQ201610213856
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月7日
【发明人】夏立新, 李亚菲, 宋朋, 王婧
【申请人】辽宁大学