一种基于分子转子的用于成像组织中细胞膜的双光子深红发射的荧光探针的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于分子转子的高信噪比细胞膜探针及其应用，尤其涉及一种适 用于双光子显微镜近红外激发光源深红发射的细胞膜荧光探针及其在标记或显示组织中 的细胞膜形态和活细胞中的应用。
【背景技术】
[0002] 细胞膜作为真核细胞的第一屏障，通过选择性地调节某些物质的进出，保证了细 胞内环境的相对稳定，使各种生化反应能够有序进行。同时，细胞膜与信号传导，细胞分化， 细胞融合，细胞识别等细胞活动息息相关。据我们所知，相比人工体外培养的细胞，许多细 胞的状态及基本功能在组织中能更好地反应其真实自然的情况。比如在体外培养的细胞的 细胞膜形态与其在真实组织中的形态存在着很大的不同。因此原位实时地可视化细胞膜对 于我们理解其相关的生理过程及形态是非常必要的。目前，荧光探针由于非侵入性、原位实 时快速检测的特点已成为一种非常有利的生物成像工具。因此，开发一种能够在细胞中特 别是组织中准确勾勒细胞边缘的细胞膜荧光探针是十分必要的。
[0003] 大量的研究已经表明双光子显微镜(TPM)比单光子显微镜在生物成像方面特别是 厚的或高散射的组织样品的成像更具有优势。因为使用长波长的近红外光作为激发源和更 小的激发面积，TPM大大减小了对样品光漂白作用。同时长波长的激发源也有效地避开了细 胞的自吸收和光散射，从而增大了样品的穿透深度。因此，一些用于TPM的细胞膜探针已经 被成功开发。Laurdan是早期开发的可用于成像细胞膜的双光子探针，但是对细胞膜磷脂较 弱的亲和力导致它们内在化极其严重(Y.X.Zeng.et al.，2014.Proc.of SPIE Vol.9230)。 近期，Chi-Kin Koo et al.等人报道了一个大双光子吸收截面的细胞膜探针，然而细胞图 片的保真度较低（Chi-Kin，K. et al ·，2009，Inorg · Chem. ,48，7501)。相比普通的双光子细 胞膜探针，基于转子型的双光子细胞膜探针有利于增强信噪比，提高照片质量。分子转子的 荧光强度强烈地依赖于环境的粘度，在高粘度环境下，其自由旋转受阻，辐射跃迀增强，导 致荧光增强。分子转子的这一性质正好可以应用到具有高粘度的细胞膜，从而使探针一旦 靶向到细胞膜后荧光显著增强，实现荧光的turn-on效果，提高照片的信噪比。
[0004]在生物成像中，红光或深红光发射也是十分有利于厚组织样品内信号的检测。首 先，长波长的红光或深红光比短波长的蓝绿光穿透力更强，能够提高对生物样品的探测深 度。其次，红光或深红光的波长处于生物光学窗口，光毒性低，大大降低了对样品的光损伤。 而且，长波长的红光或深红光发射有效地避开了细胞的自吸收和自发荧光，有利于提高信 噪比。因此，开发双光子红光或深红光发射的膜探针对于成像组织中的细胞膜探针十分有 利。然而，双光子红光或深红光的细胞膜探针却鲜有报道。据我们所知，只有两个基于纳米 粒子的红发射的双光子细胞膜探针被Liu et al.所报道（P.Liu，et al.，2015， Appl .Mater · Interfaces，7,6754)。这两个探针都是通过焚光能量共振转移将一个绿色的 荧光团共辄地连接到一个红色的荧光团，进而实现了长波长的红光发射。无疑，这样一方面 增大了合成的难度，另一方面这样大的分子结构限制了其在组织样品中的应用。基于此，研 究和开发新型的能够清晰可视化细胞内特别是组织中的细胞膜的荧光探针具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种基于分子转子的用于成像 组织中细胞膜的双光子深红发射的荧光探针。
[0006] 本发明所述基于分子转子的用于成像组织中细胞膜的双光子深红发射的荧光探 针为转子型的双光子深红发射细胞膜荧光探针，为三苯胺衍生物，其特征在于:所述荧光探 针的化学名称为:N，N-二（（4-(2'-(4"-十二烷基)吡啶-4"碘化物）乙烯)苯基)苯胺，其化学 结构通式如式(I)所示：
[0007] V. X
〇
[0008] 上述转子型的双光子深红发射细胞膜荧光探针的制备方案概述如下：
[0009] 以红发射的苯乙烯吡啶盐分子进行改造。为了使该分子有大的双光子吸收截面， 将两个这样的结构通过三苯胺连接起来，这样可在两个方向实现光场极化，大大增强了分 子的双光子吸收截面。本发明经大量的试验筛选将连接体确定为三苯胺，是由于三苯胺本 身具有转子的性质，这一特性正好可以应用于具有高粘度的细胞膜，实现荧光的turn-on效 果，提高信噪比。在两个吡啶盐处各接十二个碳原子的亲脂性的长烷基链能够保证很好地 绑定到磷脂双分子层中，减小内在化。基于以上方案和反复试验，深红发射的双光子的三苯 胺衍生物ΤΙ (N，N-二（（4-( 2 ' -(4" -十二烷基)吡啶-4"碘化物)乙烯)苯基)苯胺)最终形成。 [0010]具体的，上述深红发射的双光子的三苯胺衍生物τι的制备反应式如下：
[0011]
[0012] 本发明所述转子型的双光子深红发射细胞膜荧光探针在标记或显示组织中的细 胞膜形态和活细胞中的应用。
[0013] 其中，所述组织为小鼠肌肉组织和肝脏组织;所述活细胞为永生化细胞和正常细 胞。所述永生化细胞是HeLa细胞和SiHa细胞，所述正常细胞是HUVEC细胞。
[0014] 实验结果证实，本发明所述的转子型的双光子深红发射的细胞膜荧光探针(T1)在 高粘度环境(甘油）中的荧光强度明显高于普通的有机溶剂。高的信噪比使它能够清晰地染 色永生化细胞(HeLa细胞和SiHa细胞)和正常细胞(HUEVC细胞）的细胞膜，并且发出明亮的 深红色荧光。将本发明公开的荧光探针T1与鉴别凋亡或死细胞的商业化染料SYT0X蓝色核 酸染料(S-11348)进行共染实验的结果表明T1能够染色活细胞。在TPM下，T1也能够均匀连 续地染色组织(小鼠肌肉组织或肝脏组织）中的细胞膜。同时细胞实验也证实了该探针具有 低的毒性、优秀的光稳定性以及和其他探针很好的兼容性，提示该探针有望为研究与细胞 膜相关的生理和病理活动提供直观的和有利的影像证据。
[0015] 本发明提供的基于分子转子的用于成像组织中细胞膜的双光子深红发射的荧光 探针是首次报道的可成像组织中细胞膜的双光子深红发射的探针分子。与功能相近的其他 细胞膜荧光探针相比，本发明所述探针具有分子结构小、光稳定性强、兼容性好、斯托克斯 位移大、激发能量低、双光子吸收截面大的特点。本发明的荧光探针T1是一个转子型的探针 分子，能够在高粘度的细胞膜上实现荧光turn-on效果，预示其作为细胞膜荧光探针具有很 好的前景，有望填补细胞膜探针在组织成像方面的空缺。
【附图说明】
[0016] 图1:染色He La细胞的照片。
[0017] (I)用T1染色后在800nm激光辐照下得到的双光子照片。其中a图为双光子荧光照 片;b图为明场激光扫描的微分干涉照片;c图为a、b的叠加图。
[0018] (II)分别用T1和S-11348染色细胞后的共聚焦荧光照片。其中d图为用T1染色后在 488nm激光辐照下得到的照片;e图为用S-11348染色后的在405nm激光辐照下得到的照片;f 图为d、e的叠加图。
[0019] (III)分别用T1和Hoechst 33342染色细胞后的共聚焦荧光照片。其中g图为用T1 染色后在488nm激光辐照下得到的照片;h图为用Hoechst 33342染色后的在405nm激光辐照 下得到的照片；i图为g、h的叠加图。
[0020] 图2: T1分别染色SiHa细胞(I)和HUVEC细胞(II)的共聚焦荧光照片。
[0021] 其中a、d为488nm激光辐照下得到的照片;b、e图为明场激光扫描的微分干涉照片； c图为a、b的叠加图，f图为d、e的叠加图。
[0022]图3:T1染色HeLa细胞的共聚焦（I)和双光子(II)荧光照片。
[0023] 其中la图为488nm激光辐照下得到的照片，lid图为800nm激光辐照下得到的双光 子照片;b、e图为明场激光扫描的微分干涉照片;c图为a、b的叠加图，f图为d、e的叠加图。T1 染色HeLa细胞后在488nm和800nm激光连续辐照下获得的一系列不同时间的共聚焦（III图） 和双光子(IV图）荧光照片。
[0024]图4:用T1染色小鼠肌肉组织（I图）和肝脏组织（II图）后在800nm激光辐照下得到 的双光子荧光照片。
[0025]其中a、d图为双光子荧光照片;b、e图为明场激光扫描的微分干涉照片；c图为a、b 的叠加图，f图为d、e的叠加图。
【具体实施方式】 [0026] 实施例1:
[0027] N，N_二甲酰基苯胺的合成
[0028] 将干燥的DMF(3 · 7mL)和三氯氧磷（3 · 7mL，40 · 7mmo 1)混合加入三口烧瓶，在0°C下 搅拌。30min后，将溶于氯仿中的三苯胺（1.0g，4. Ommol)逐滴加入上述混合物中，加热搅拌 24h。反应结束后冷却至室温，加入适量的氢氧化钠和水，然后用二氯甲烧萃取，水洗。用无 水硫酸钠进行干燥。最后用石油醚和乙酸乙酯的混合物进行柱层分析获得最终产物。
[0029] ΧΗ NMR(400MHz,DMS0-d6)：5(ppm)9.88(s,2H),7.85(d,J =