专利名称：检测细胞内氢离子的荧光探针及合成方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测技术领域，尤其涉及用于检测细胞内氢离子的荧光探针；本发 明还涉及该荧光探针的合成方法；另外，该发明还涉及该荧光探针的用途。
背景技术：
氢离子浓度作为一个重要的新陈代谢及细胞内的参数，在许多细胞过程中起到关 键的调节作用，比如细胞生长、钙离子调节、酶活性、信号传导、细胞内吞作用、化 学向性及其他的细胞过程。许多报道认为一些疾病如癌症、肾衰竭、肺病等与细胞质 或者酸性细胞器内的pH异常有关。因此，细胞内pH的精确测量是非常重要的。目前，许多方法可用于检测pH。比如微电极、核磁、吸收及荧光光谱方法。在 这些方法中，荧光法由于其非入侵的性质、高的灵敏度和专一性，以及广泛可用的荧 光染料在测定pH时比其他方法更为优越。而且，荧光显微成像技术通过使用荧光pH 探针能够捕捉到细胞内氢离子的时空分辨。现在，两类荧光pH探针已经被开发， 一类是用于检测细胞质内pH的探针，其 工作pH范围大约是6.8-7.4 (K, M. Sun, C. K. McLaughlin, D. R. Lantero and R. A.Manderville, ■/ ^肌Ou;m. Soc. 2007, 129, 1894 -1895; M. S. Briggs, D. D. Burns, M. E, Cooper and S. J. Gregory, CTzew. Cowwww.， 2000, 2323—2324; J. A. Thomas, R. N. Buchsbaum， A. Zimniak and E. Racker,伤oc/ em. 1979, 18, 2210-2218; A. H. Lee and I. F.Tannock, Cancer Res. 1998, 58, 1901-1908; R. Pal and D. Parker, O^w. Cow附wt 2007， 474476);另一类是用于检测酸性器官如溶酶体，内涵体等的探针，其工作pH范围 大约是4.5-6.0.(H,J. Lin, P. Herman, J. S. Kang and J. R. Lakowicz, jwa/.伤0c/7e肌2001, 294, 118-125; F. Galindo, M. I. Burguete, L. Vigara， S. V. Luis, N. Kabir, J. Gavrilovic and D. A. Russell, Jwgew. Oze附./脱五c/ 2005， 44, 6504-6508.) ; Bo Tang, Xia Liu, Kehua Xu, Hui Huang, Guiwen Yang and Liguo An, (;. .C0/;,w"",200/. i;/i:( — 3/2r: 众所周知，细胞 内pH的微小变化可能引起细胞的功能紊乱，理想的荧光探针应当灵敏的响应细胞内pH的微小变化，并且能够避免来自细胞生物本身的干扰。然而，目前可用的pH荧光探针有以下缺点低的灵敏度，有的激发在紫外区。激发在紫外区能够损伤组织样品 并且引起生物样品自发荧光的干扰。另外，用于检测酸性器官内的理想的pH探针较 少，这被认为是细胞生物学及医学发展的瓶颈。
发明内容
本发明的目的之一旨在克服现有技术荧光探针的不足之处，提供一种具有高的 灵敏度、好的选择性、好的光稳定性以及工作pH在酸性范围、适用于检测细胞内氢 离子的荧光探针；目的之二是提供工艺简单、成本低廉的该荧光探针的合成方法；目 的之三是提供该荧光探针的用途。本发明的目的之一可通过如下技术措施来实现该荧光探针具有下列结构通式<formula>formula see original document page 5</formula>本发明的目的之二可通过如下技术措施来实现 该合成方法按如下步骤进行a. 先将罗丹明类荧光染料溶于有机溶剂中，再按照罗丹明类荧光染料氧氯化磷-l: 2-5重量份配比于搅拌下缓慢加入氧氯化磷，然后于40-6(TC加热回流反应-； 小时；b. 反应完毕后冷却至室温，减压除去溶剂，先加入有机溶剂溶解后，再按照罗丹明类荧光染料氢离子响应基团=1: l-3重量份配比加入氢离子响应基团，混合后于80-10(TC加热回流1-2小时；c. 然后冷却至室温，减压除去有机溶剂得到粗产品；d. 硅胶柱层析分离得结构通式为的产品。本发明的目的之二还可通过如下技术措施来实现所述的罗丹明类荧光染料选自罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明800、罗丹明IIO。 所述的氢离子响应基团选自苯甲酰肼、对甲苯基苯甲酰肼、邻甲基苯甲酰肼、间甲基 苯甲酰肼。所说的有机溶剂选自二氯甲垸、三氯甲垸、乙腈、乙醇。本发明代表性的化合物显示在下面的合成方案中罗丹明类荧光染料与氧氯化磷溶于二氯甲烷中，反应完毕后，减压除去溶剂。产 物溶于乙腈中，不断搅拌下加入苯甲酰肼，混合物加热回流得到探针分子，最后经过 分离得荧光探针产品。本发明检测细胞内氢离子的荧光探针在使用时没有特殊的限制，通常，可以将探 针分子溶解在生理盐水、缓冲液或由乙醇、乙腈、二甲亚砜等水溶性有机溶剂，然后 加入含有细胞组织的适当缓冲液中进行测试。本发明的目的之三可通过如下技术措施来实现 本发明的检测细胞内氢离子的新型荧光探针用于化学模拟生物体系中氢离子的 检测，生物活细胞和活组织内的氢离子的分析检测和荧光成像检测，以及医学上病 变组织中氢离子的检测。本发明以罗丹明类荧光染料、氧氯化磷和苯甲酰肼为原料，合成的荧光探针 NMR (CDC13, 300MHz) S (ppm): 1.71(12H), 3.33(8H), 6.38 (4H), 6.72(2H), 7.18(1H), 7.42(3H), 7.53(4H), 8.00(1H)l3C NMR (CDC13, 300MHz) S (ppm): 12.7, 44.5, 66.5, 97.8， 104.6, 108.2, 123.7, 124.4， 127.6, 128.5， 129,4， 129.5, 131.7, 132.8, 133.3， 149.2, 151.5, 154.0, 165.6.本发明的重要贡献在于合成的荧光探针分子具有高的灵敏度与选择性，好的光稳 定性与细胞通透性，可以有效避免细胞内自发荧光的干扰，减少对生命体的损伤，有 利于活体检测；本发明荧光探针分子的设计基于罗丹明无荧光闭环结构与强荧光的开 环结构。pH滴定实验表明酸性条件下在4.2-6.0的pH范围荧光强度能增加100倍有 余，p《a是4.85，这对研究细胞内的酸性器官是非常有意义的；另外，我们将探针应 用到动物的肝癌细胞内(HepG2 cells)通过激光共聚焦显微成像技术进一步证明了该 探针的价值。本发明的探针分子具有极其重要的应用价值。特别是该探针分子测定灵敏度非常 高，光稳定性非常好；并且具有良好的选择性，细胞的渗透性好和毒副作用小。另外 该系列探针分子结构简单，合成工艺简易且效率高、成本低廉，适用于检测细胞内氢 离子的荧光探针；
图1是该探针的单晶结构。图2是本发明实施例的荧光探针分子在酸性缓冲溶液中，其荧光强度和氢离子浓 度的关系及pH滴定曲线。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。图3是本发明实施例的荧光探针分子的光稳定性。横坐标为时间(s)，纵坐标是荧 光强度。图4是本发明实施例的荧光探针分子对氢离子具有很好的选择性。1: H+;2: H+ + Cu2+;3: H++Zn2+;4: H++Ca2+; 5: 1^++"82+.横坐标为各种离子，纵坐标为加入各 种离子前后探针溶液的荧光强度。
图5是本发明实施例的荧光探针分子研究动物的肝癌细胞(H印G2 cells)的激 光共聚焦显微成像。(左)为动物的肝癌细胞用荧光探针在37'C下孵育30分钟的激光 共聚焦照片，(右)为亮场照片以表明细胞活力。
具体实施例方式探针的合成实施例1:a. 先将罗丹明B溶于有机溶剂中，再按照罗丹明B:氧氯化磷=1: 2重量份配 比于搅拌下缓慢加入氧氯化磷，然后于40。C加热回流反应6小时；b. 反应完毕后冷却至室温，减压除去溶剂，先加入乙腈溶解后，再按照罗丹明B: 苯甲酰肼=1: 1重量份配比加入苯甲酰肼，混合后于10(TC加热回流1小时；C.然后冷却至室温，减压除去有机溶剂得到粗产品；最后用硅胶柱分离组分， 洗脱剂为甲醇三氯甲垸=1: 15 (V/V)，减压蒸发去除残余溶剂，真空干燥得产品。 实施例2:a. 先将罗丹明B溶于有机溶剂中，再按照罗丹明B:氧氯化磷=1: 5重量份配 比于搅拌下缓慢加入氧氯化磷，然后于60。C加热回流反应4小时；b. 反应完毕后冷却至室温，减压除去溶剂，先加入乙腈溶解后，再按照罗丹明B:苯甲酰肼=1: 3重量份配比加入苯甲酰肼，混合后于8(TC加热回流2小时；C.然后冷却至室温，减压除去有机溶剂得到粗产品；最后用硅胶柱分离组分，
洗脱剂为甲醇三氯甲烷=1: 15 (V/V),减压蒸发去除残余溶剂，真空干燥得产品。 实施例3:a. 先将罗丹明B溶于有机溶剂中，再按照罗丹明B:氧氯化磷=1: 3重量份配比于搅拌下缓慢加入氧氯化磷，然后于5(TC加热回流反应5小时；b. 反应完毕后冷却至室温，减压除去溶剂，先加入乙腈溶解后，再按照罗丹明B: 苯甲酰肼=1: 2重量份配比加入苯甲酰肼，混合后于9(TC加热回流1.5小时；C.然后冷却至室温，减压除去有机溶剂得到粗产品；最后用硅胶柱分离组分， 洗脱剂为甲醇三氯甲垸=1: 15 (v/v),减压蒸发去除残余溶剂，真空干燥得产品。 实施例4:将1.0克(2.3mmol)罗丹明B于15mL二氯甲烷溶解后，逐滴滴加氧氯化磷0.4mL， 然后于60'C加热回流反应4小时，冷却至室温，减压除去溶剂，产物溶于25mL乙 腈中，不断搅拌下加入0.31克苯甲酰肼，混合物于10(TC加热回流1小时，冷却至室 温，减压除去溶剂得到荧光探针粗品，最后用硅胶柱分离组分，洗脱剂为甲醇三氯 甲烷=1: 15 (Wv),减压蒸发去除残余溶剂，真空干燥得荧光探针产品。实施例5:将1.0克(2.3 mmol)罗丹明B于15mL 二氯甲烷溶解后，逐滴滴加氧氯化磷0.8mL， 然后于4(TC加热回流反应6小时，冷却至室温，减压除去溶剂，产物溶于125mL乙 腈中，不断搅拌下加入0.93克苯甲酰肼，混合物于8(TC加热回流2小时，冷却至室 温，减压除去溶剂得到荧光探针粗品，最后用硅胶柱分离组分，洗脱剂为甲醇三氯 甲垸=1: 15 (v/v)，减压蒸发去除残余溶剂，真空干燥得荧光探针产品。实施例6:将1.0克(2.3mmol)罗丹明B于15mL二氯甲烷溶解后，逐滴滴加氧氯化磷0.6mL， 然后于50。C加热回流反应5小时，冷却至室温，减压除去溶剂，产物溶于125mL乙 腈中，不断搅拌下加入0.60克苯甲酰肼，混合物于9(TC加热回流1.5小时，冷却至室 温，减压除去溶剂得到荧光探针粗品，最后用硅胶柱分离组分，洗脱剂为甲醇三氯 甲烷=1: 15 (v/v),减压蒸发去除残余溶剂，真空干燥得荧光探针产品。实施例7:将罗丹明6G替换罗丹明B，其他分别同实施例l-6。 实施例8:'.将罗丹明IIO替换'罗丹明B,其他分别同实施例1-6。实施例9:将罗丹明800替换罗丹明B，，其他分别同实施例1-6。 实施例10:将三氯甲烷替换二氯甲垸，其他分别同实施例1-9。实施例11:将乙腈替换二氯甲垸，其他分别同实施例1-9。 实施例12:将乙醇替换二氯甲烷，其他分别同实施例1-9。实施例13:将对甲基苯甲酰肼替换苯甲酰肼，其他分别同实施例1-12。 实施例14:将邻甲基苯甲酰肼替换苯甲酰肼，其他分别同实施例1-12。实施例15:将间甲基苯甲酰肼替换苯甲酰肼，其他分别同实施例1-12。
权利要求
1、检测细胞内氢离子的荧光探针，其特征在于该荧光探针具有下列结构通式
2、权利要求l所述检测细胞内氢离子的荧光探针的合成方法，其特征在于该方 法按如下步骤进行a. 先将罗丹明类荧光染料溶于有机溶剂中，再按照罗丹明类荧光染料氧氯化磷=1: 2-5重量份配比于搅拌下缓慢加入氧氯化磷，然后于40-6(TC加热回流反应4-6小时；b. 反应完毕后冷却至室温，减压除去溶剂，先加入有机溶剂溶解后，再按照罗丹明类荧光染料氢离子响应基团=1: l-3重量份配比加入氢离子响应基团，混合后于80-10(TC加热回流1-2小时；C.然后冷却至室温，减压除去有机溶剂得到粗产品； d.硅胶柱层析分离得结构通式为
3、 根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于所述的罗丹明类荧光染料选自、 罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明800、罗丹明110。
4、 根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于所述的氢离子响应基团选自苯甲酰肼、对甲苯基苯甲酰肼、邻甲基苯甲酰肼、间甲基苯甲酰肼。
5、 根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于所说的有机溶剂选自二氯甲烷、 三氯甲烷、乙腈、乙醇。
6、 权利要求1所述的检测细胞内氢离子的荧光探针用于化学模拟生物体系中氢 离子的检测，生物活细胞和活组织内的氢离子的分析检测和荧光成像检测，以及医 学上病变组织中氢离子的检测。
全文摘要
本发明提供一种检测细胞内氢离子的荧光探针及合成方法和用途，该方法按如下步骤进行a.先将罗丹明类荧光染料溶于有机溶剂中，再按照罗丹明类荧光染料∶氧氯化磷＝1∶2-5重量份配比于搅拌下缓慢加入氧氯化磷，然后于40-60℃加热回流反应4-6小时；b.反应完毕后冷却至室温，减压除去溶剂，先加入有机溶剂溶解后，再按照罗丹明类荧光染料∶氢离子响应基团＝1∶1-3重量份配比加入氢离子响应基团，混合后于80-100℃加热回流1-2小时；c.然后冷却至室温，减压除去有机溶剂得到粗产品；d.硅胶柱层析分离得产品。
文档编号G01N33/52GK101149374SQ20071011326
公开日2008年3月26日 申请日期2007年10月26日 优先权日2007年10月26日
发明者波 唐, 崔丽娟, 张文申, 徐克花, 闫从斌 申请人:山东师范大学