专利名称：检测汞离子的花菁染料荧光探针及合成方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测技术领域，尤其涉及用于检测细胞及海洋生物体内汞离子的花 菁染料荧光探针；本发明还涉及该荧光探针的合成方法；另外，该发明还涉及该荧 光探针的用途。
背景技术：
汞是毒性最大的重金属之一，并且汞元素的存在形式多样化(如汞单质，汞离子， 有机、无机的汞盐及其化合物)。溶剂化的无机汞离子(Hg2+)是汞元素最稳定的一种无 机存在形式，具有腐蚀性和致癌性,会对人体心脏,肠胃，肾脏等器官造成严重的损伤。 更为严重的是,水溶性环境中的细菌能把无机的汞转化成为有机的甲基汞，甲基汞容 易在海产品中累积并进入食物链。 一旦被人体吸收,会引起一些急性和慢性的疾病。 因此迫切需要发展高灵敏度高选择性的方法来检测细胞及生物体内的汞。目前，许多方法可用于检测汞离子。比如原子吸收光谱法，电感耦合等离子体质 谱法等，这些技术具有较高的灵敏度和选择性并常用于定量分析，但是这些方法仪器 昂贵，测定时样品的预处理比较复杂，并且不能够对生物体内金属离子进行实时、原 位动态检测，所以应用受到一定的限制。与以上这些技术相比，荧光方法具有非入侵 的性质、高的灵敏度和专一性，而且，荧光显微成像技术通过使用荧光探针能够捕捉 到生物体内汞离子的时空分辨，因而荧光方法已经成为研究细胞生物学的有力工具。 目前，已有的能够进行细胞及生物体内汞离子检测用的荧光探针主要有以下两 禾中第一类是罗丹明类荧光探针(S. -K. Ko， Y.陽K. Yang and J. Tae， I. Shin. In Vivo Monitoring of Mercury Ions Using a hodamine-Based Molecular Probe. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128， 14150-14155.);另一类是EPNP荧光分子探针(Z. Zhang, X. Guo, X. Qian, Z. Lu and F. Liu. Fluorescent imaging of acute mercuric chloride exposure on cultured human kidney tubular epithelial cells. Kidney International. 2004, 66, 2279-2282.)。然而，目前可用的汞离子荧光探针有以下缺点灵敏度低，激发波长 处于紫外区或可见区，激发时会对细胞产生损伤，且由于其发射波长位于可见区，生 物本体自荧光干扰严重，使其受到了一定的限制。本发明的目的之一旨在克服现有技术荧光探针的不足之处，提供一种化学、光 稳定性高，对汞离子有高的选择性和好的灵敏度，对细胞本身没有毒副作用，适用 于检测汞离子的花菁染料荧光探针；目的之二是提供该花菁染料荧光探针的合成方 法；目的之三是提供该花菁染料荧光探针的用途。本发明的目的之一可通过如下技术措施来实现-该花菁染料荧光探针具有下列结构通式通式中R= -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, -CH2CH2CH2CH2S03-; 『0或1。本发明的目的之二可通过如下技术措施来实现 该检测汞离子的花菁染料荧光探针合成方法按如下步骤进行a. 先将花菁染料Cy.7和汞离子响应基团按照花菁染料Cy.7:汞离子响应基团= 1: 5 15的重量份配比分别溶解于有机溶剂N,N-二甲基甲酰胺中，混合后在惰性气 体保护和70-85'C下反应3 5小时；b. 将a工序所得反应混合物冷却至室温，再于搅拌下加入无水乙醚中，经过滤， 减压干燥，得粗品；C.硅胶柱层析分离得结构通式为通式中R= -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, -CH2CH2CH2CH2S03-; n = 0或1的产品。发明内容:
本发明的目的之二还可通过如下技术措施来实现a工序中所述的花菁染料Cy.7选自甲基花菁、乙基花菁、丙基花菁或磺酸基丁 基花菁；a工序中所述的汞离子响应基团是3， 9-二硫-6-氮杂H^—烷或者3， 6， 12， 15-四硫-9氮杂十七垸；b工序中所述的无水乙醚反应混合物=15 25: l体积比。本发明的目的之三可通过如下技术措施来实现本发明的检测汞离子的花菁染料荧光探针用于化学模拟生物体系中汞离子的检 测，活细胞内和海洋生物体内的汞离子的分析检测和荧光成像检测。本发明代表性的化合物显示在下面的合成方案中。R R R R在惰性气体保护下，花菁荧光染料与3， 9-二硫-6-氮杂十一垸在N，N-二甲基甲酰胺 中反应得到探针分子，最后经过分离得产品。本发明以丙基花菁、3， 9-二硫-6-氮杂十一垸为原料，合成的花菁染料荧光探针 'H画R (CDCl3 300MHz): S 0.96 (t, 6H)， 1.26(t,6H)， 1.69(t， 4H) ， 1.87(t， 2H)， 2. 08(d, 12H)， 2. 55(m， 4H), 2. 70(t， 4H), 2.88—2.96 (m， 8H), 3.92(t' 4H) ， 6. 30(d' 2H), 7. 26 (m, 8H) ， 8. 02 (d， 2H) ESI-MS cal for [M] + = 696. 0， found 696. 4 (M-I—)。本发明检测汞离子的花菁染料荧光探针在使用时没有特殊的限制，通常，可以将 探针分子溶解在生理盐水、缓冲液或由乙醇、乙腈、二甲亚砜等水溶性有机溶剂，然 后加入含有细胞组织的适当缓冲液中进行测试。本发明的花菁染料荧光探针的具体特征如下探针分子激发在670-690范围内，发射在760-780范围内，对溶剂极性不敏感， 并且化学一光稳定性好；探针分子对汞离子有很好的选择性，钠、钾、钙、镁、锌、 锰、铜、铅、镉、钴、镍、铁、银等金属离子对检测没有影响；探针分子对PH变化 不敏感，在pH为7.0到7.8范围内，pH变化对荧光发射没有影响；探针分子细胞渗 透性好，对细胞本身及生物体没有毒副作用，适于细胞及生物体内汞离子的检测。本发明的重要贡献在于合成的荧光探针分子属于近红外荧光探针，可以有效避免
细胞内自发荧光的干扰，提高检测方法的选择性和灵敏度，减少对生命体的损伤，有 利于活体检测；本发明荧光探针分子的设计基于分子内诱导电子转移(PET)，该探针 显示了高的灵敏度和选择性。另外，将本发明的花菁染料荧光探针应用到动物的肝癌 细胞内(H印G2 cells)和斑马鱼体内，通过激光共聚焦显微成像技术进一步证明了 该花菁染料荧光探针的价值。本发明涉及的花菁染料探针分子具有极其重要的应用价值。特别是该系列探针分 子激发和发射波长均位于近红外区，测定灵敏度高，选择性好，对细胞的渗透性和毒 副作用小。另外该系列探针分子结构及合成方法简单，且效率高，使得极易推广应用。
图1是本发明的荧光探针分子的荧光强度和汞离子浓度的关系。横坐标为波长 (nm)，纵坐标为荧光强度。图2是本发明的荧光探针分子对汞离子具有良好的选择性。横坐标为各种离子，纵坐标为加入金属离子与未加金属离子的探针分子溶液的相对荧光强度。图3是本发明的荧光探针分子相对荧光强度与pH变化关系。横坐标为pH，纵坐标为相对荧光强度。图4是本发明实施例的荧光探针分子研究动物的肝癌细胞(H印G2 cells)的激 光共聚焦显微成像。其中(a).动物的肝癌细胞用荧光探针在37'C下孵育20分钟的 激光共聚焦照片；(b).动物的肝癌细胞用荧光探针在37'C下孵育20分钟后，加入汞 离子再孵育20分钟的激光共聚焦照片；(c). b图的亮场照片以表明细胞活力。图5是本发明实施例的荧光探针分子研究出生五天的斑马鱼的激光共聚焦显微成 像。(a).出生五天的斑马鱼用荧光探针在28'C下孵育20分钟的激光共聚焦照片；(b). 出生五天的斑马鱼用荧光探针在28。C下孵育20分钟后，加入汞离子再孵育20分钟的 激光共聚焦照片；(c)b图的亮场照片。
具体实施例方式实施例1:a. 按照丙基花菁3， 9-二硫-6-氮杂十一垸=1: 5的重量份配比分别溶解于有机 溶剂N,N-二甲基甲酰胺中，混合后在氮气保护和7(TC反应5小时；b. 将a工序所得反应混合物冷却至室温，再于搅拌下按照反应混合物无水乙醚
=1: 25体积比将反应混合物加入到无水乙醚中，经过滤，减压干燥，得粗品；C用硅胶柱层析分离组分，洗脱剂为甲醇-乙酸乙酯(1: 4 v/v) , 30°C旋转蒸 发去除洗脱剂，真空干燥得结构通式为通式中R=-CH2CH2CH3; n-O的花菁染料荧光探针产品。实施例2:a. 按照丙基花菁3， 9-二硫-6-氮杂十一烷=1: 15的重量份配比分别溶解于有 机溶剂N,N-二甲基甲酰胺中，混合后在氮气保护和85'C反应3小时；b. 将a工序所得反应混合物冷却至室温，再于搅拌下按照反应混合物无水乙醚 =1: 15体积比将反应混合物加入到无水乙醚中，经过滤，减压干燥，得粗品；c用硅胶柱层析分离组分，洗脱剂为甲醇-乙酸乙酯(1: 4v/v) , 4CTC旋转蒸发去除洗脱剂，真空干燥得结构通式为通式中R=-CH2CH2CH3; n^O的花菁染料荧光探针产品。实施例3:a. 按照丙基花菁3, 9-二硫-6-氮杂十一烷=1: IO的重量份配比分别溶解于有 机溶剂N,N-二甲基甲酰胺中，混合后在氩气保护和8(TC下反应4小时；b. 将a工序所得反应混合物冷却至室温，再于搅拌下按照反应混合物无水乙醚 =1: 20体积比将反应混合物加入到无水乙醚中，经过滤，减压干燥，得粗品；c用硅胶柱层析分离组分，洗脱剂为甲醇-乙酸乙酯(1: 4v/v) , 35°C旋转蒸发去除洗脱剂，真空干燥得结构通式为
通式中R=-CH2CH2CH3; 11 = 0的花菁染料荧光探针产品。 实施例4:分别同实施例l-3，不同的是用R"CH3替换R^-CH2CH2CH3 (即甲基花菁替 换丙基花菁)，真空干燥得结构通式为通式中R=-CH3; n二O的花菁染料荧光探针产品。实施例5:分别同实施例1-3，用R"CH2CH3替换R;CH2CH2CH3 (即乙基花菁替换丙基花菁)，真空干燥得结构通式为通式中R=-CH2CH3; n二O的花菁染料荧光探针产品。实施例6:分别同实施例1-3，用R=-CH2CH2CH2CH2S03-替换R= -CH2CH2CH3 (即磺酸 基丁基花菁替换丙基花菁)，真空干燥得结构通式为
通式中R=-CH2CH2CH2CH2S03—; n = 0的花菁染料荧光探针产品。实施例7:用n-l替换n-0 (即3， 6， 12， 15-四硫-9氮杂十七垸替换3， 9-二硫-6-氮杂十一烷)，其他分别同实施例1-6。 实施例8:花菁染料荧光探针的合成在100mL三口烧瓶中，加入0.333克(0.50 mmol)具有近红外荧光光谱的丙基花菁 染料和0.965克(5.0國o1) 3， 9-二硫-6-氮杂十一烷，加入15 mL N, N-二甲基甲酰 胺至完全溶解，然后在氮气保护和7(TC反应5小时，冷却至室温，后加入到300 mL 乙醚中，过滤，减压干燥得荧光探针粗品，最后用硅胶柱分离组分，洗脱剂为甲醇-乙酸乙酯(1: 4 v/v) , 35°C旋转蒸发去除溶剂、洗脱剂，真空干燥得荧光探针产PI叩o实施例9:花菁染料荧光探针的合成在100mL三口烧瓶中，加入0.333克(0.50 mmol)具有近红外荧光光谱的丙基花菁 染料和0.965克(5. Ommol) 3， 9_二硫-6-氮杂H^—垸，加入15 mL N， N-二甲基甲酰 胺至完全溶解，然后在氮气保护和85'C反应3小时，冷却至室温，后加入到300tnL
乙醚中，过滤，减压干燥得荧光探针粗品，最后用硅胶柱分离组分，洗脱剂为甲醇-乙酸乙酯(1: 4 v/v) ， 35°C旋转蒸发去除溶剂、洗脱剂，真空干燥得荧光探针产
权利要求
1、检测汞离子的花菁染料荧光探针，其特征在于该花菁染料荧光探针具有下列结构通式通式中R＝-CH3，-CH2CH3，-CH2CH2CH3，-CH2CH2CH2CH2SO3-；n＝0或1。
2、权利要求1所述检测汞离子的花菁染料荧光探针的合成方法，其特征在于该 合成方法按如下步骤进行a. 先将花菁染料Cy.7和汞离子响应基团按照花菁染料Cy.7:汞离子响应基团= 1: 5 15的重量份配比分别溶解于有机溶剂N,N-二甲基甲酰胺中，混合后在惰性气 体保护和70-85'C下反应3 5小时；b. 将a工序所得反应混合物冷却至室温，再于搅拌下加入无水乙醚中，经过滤， 减压干燥，得粗品；c. 硅胶柱层析分离得结构通式为通式中R= -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, -CH2CH2CH2CH2S03-; n = 0或1的产品。
3、 根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于a工序中所述的花菁染料Cy.7 选自甲基花菁、乙基花菁、丙基花菁或磺酸基丁基花菁。
4、 根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于a工序中所述的汞离子响应基团是3， 9-二硫-6-氮杂十一垸或者3， 6, 12， 15-四硫-9氮杂十七垸。
5、 根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于b工序中所述的无水乙醚反 应混合物=15 25: 1体积比。
6、 权利要求1所述的检测汞离子的花菁染料荧光探针用于化学模拟生物体系中 荥离子的检测，活细胞内和海洋生物体内的汞离子的分析检测和荧光成像检测。
全文摘要
本发明提供检测汞离子的花菁染料荧光探针及合成方法和用途，该合成方法按如下步骤进行a.先将花菁染料Cy.7和汞离子响应基团按照花菁染料Cy.7∶汞离子响应基团＝1∶5～15的重量份配比分别溶解于有机溶剂N，N-二甲基甲酰胺中，混合后在惰性气体保护和70-85℃下反应3～5小时；b.将a工序所得反应混合物冷却至室温，再于搅拌下加入无水乙醚中，经过滤，减压干燥，得粗品；c.硅胶柱层析分离得产品。探针分子本身具有良好的化学、光稳定性。激光共聚焦显微镜成像实验表明这类探针细胞渗透性好，对细胞本身没有毒副作用。
文档编号G01N33/52GK101149373SQ20071011326
公开日2008年3月26日 申请日期2007年10月26日 优先权日2007年10月26日
发明者波 唐, 崔丽娟, 张文申, 徐克花, 闫从斌 申请人:山东师范大学