专利名称：一种不对称菁染料的制备及其用于牛血清白蛋白检测的方法
技术领域：
本发明涉及一种不对称菁染料，具体涉及一种不对称菁染料的制备及其用于微量牛血清白蛋白检测的方法，属于化工高新技术化学及生物化学分析技术领域。
背景技术：
菁染料是一种商品化的生物荧光标记用染料，自从1856年Williams发现“豆粉”蓝菁染料以来，光导性能优异的各类菁染料一直受到学者们的广泛关注。每年在各种不同的应用领域都有大量的文献相继报道。如用作感光胶片的卤化银乳剂的增感剂及无机半导体材料、光盘的记录介质、太阳能电池光敏剂、激光材料、生物分子的荧光探针等。菁染料的合成开发主要研究组有国外Patonay组和Waggoner组等。厦门大学等对花菁染料所做的研究工作较多，他们主要是借鉴Narayanant和Patonay等人的工作来合成用于标记生物大分子的染料。而姚祖光研究组主要研究其在CD-R光盘介质方面的应用。噻唑橙类染料是由Lee等人发现的一类用于网状红细胞分析的不对称菁染料，该类染料与核酸结合后荧光显著增强，目前已被研究者熟悉和使用。但该类染料与牛血清白蛋白相互作用的文献报道不多。本发明提供了一种不对称菁染料用于牛血清白蛋白分子的检测方法。该方法通过染料与牛血清白蛋白的相互作用，利用荧光分光光度计精确的检测出微量的牛血清白蛋白。本发明简单实用，线性响应范围宽，在牛血清白蛋白的定量分析检测领域具有潜在的实际应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种不对称菁染料的制备方法及其用于牛血清白蛋白分子的检测方法。该发明合成了一类不对称菁染料，该类染料对微量的牛血清白蛋白具有荧光响应，染料溶液自身几乎无荧光，加入微量的牛血清白蛋白溶液后，染料与蛋白分子相互作用，使染料发出强荧光，依据加入蛋白的量和荧光强度之间呈线性关系，可以用于定量检测牛血清白蛋白分子。按照本发明提供的技术方案，一种用于牛血清白蛋白检测的不对称菁染料，结构通式如下
X=S; O; C(CH3)2 Ri=(CH2)mCH3, m=0~7 R2=(CH2)nOH, n=1~6
其中X为硫原子、氧原子或-C (CH3)2，优选硫原子和氧原子况为长链烷基-(CH2)mCH3，m = O 7，优选m = O 2 ;另一端为喹啉环，喹啉环中的氮原子上连接的R2为一端含有羟基的长链烷基-(CH2) ηΟΗ，η = I 6，优选η = I 3。其中m、η为正整数。将不对称菁染料配置成的染料母液加入到pH值4 8的磷酸盐缓冲溶液中，配制成检测牛血清白蛋白的荧光试剂，同时将牛血清白蛋白配制成牛血清白蛋白溶液，然后将牛血清白蛋白溶液加入到荧光试剂中，用荧光光谱仪连续扫描记录下一定浓度的荧光试剂及分批次加入牛血清白蛋白溶液以后的荧光光谱图，记录最大荧光发射强度，以牛血清白蛋白的浓度为横坐标、最大荧光发射强度为纵坐标做成标准曲线；然后将未知浓度的牛血清白蛋白样品，在同样的条件下与牛血清白蛋白溶液作用，测其荧光光谱图，取最大荧光强度值，在标准曲线上即得到未知样品的牛血清白蛋白的浓度。一种用于牛血清白蛋白检测的不对称菁染料的制备方法，由式(2)所示化合物与式(3)所示化合物通过与式(4)所示化合物经缩合反应制得；
权利要求
1.一种用于牛血清白蛋白检测的不对称菁染料，其特征是结构通式如式(I)所示
2.一种用于牛血清白蛋白检测的不对称菁染料的制备方法，其特征是由式(2)所示化合物与式(3)所示化合物通过与式(4)所示化合物经缩合反应制得；
3.如权利要求2所述用于牛血清白蛋白检测的不对称菁染料的制备方法，其特征是步骤(I)所述溶剂为甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、乙醚或乙腈。
4.如权利要求2所述用于牛血清白蛋白检测的不对称菁染料的制备方法，其特征是步骤(I)所述卤代烷为溴代烷、碘代烷或对甲基苯磺酸甲酯。
5.如权利要求2所述用于牛血清白蛋白检测的不对称菁染料的制备方法，其特征是步骤⑶所述溶剂为醋酸、丙酸、甲醇、乙醇或乙腈。
6.如权利要求2所述用于牛血清白蛋白检测的不对称菁染料的制备方法，其特征是步骤(4)所述金属钠盐或钾盐为氯化钠、溴化钠、碘化钠、氟硼酸钠、氯化钾、溴化钾、碘化钾或氟硼酸钾。
7.一种用于牛血清白蛋白检测的不对称菁染料的荧光测试方法，其特征是步骤如下 (1)染料母液的配制精确称取I 50mg菁染料纯品,加入I IOOmL无水乙醇溶解，配制成10_6 10_3mol/L的染料母液冷藏备用； (2)牛血清白蛋白溶液的配制精确称取500mg牛血清白蛋白，加入2mL二次蒸馏得到的蒸馏水中溶解，配制成1(Γ6 l(T3mol/L的牛血清白蛋白母液； (3)缓冲溶液的选择选择pH值在4 8的缓冲液； (4)数据记录精确移取I 3mL步骤(3)配置的缓冲溶液到IcmXIcm的荧光比色皿中，精确移取100 μ L步骤⑴制备的染料母液到比色皿中，将缓冲溶液和染料混合物搅拌均匀；3-5min后，采用荧光光谱仪测量其荧光光谱，记录扫描数据； (5)牛血清白蛋白浓度测定在步骤(4)制备得到的混合物中分次加入10μL步骤(2)制备的蛋白质母液，采用荧光光谱仪分别扫描其荧光光谱图，记录数据；依据蛋白质加入量和总体积换算成浓度后和荧光发射强度最大值之间做曲线，得到标准曲线；标准曲线做好后，相同的条件下，取未知浓度的牛血清白蛋白溶液测量荧光光谱，通过荧光发射最大值，在标准曲线中找到对应的牛血清白蛋白浓度，即测知其浓度值。
8.如权利要求3所述用于牛血清白蛋白检测的不对称菁染料的荧光测试方法，其特征是步骤⑴所述溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、三氯甲烷、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺DMF或二甲基亚讽DMSO。
9.如权利要求3所述用于牛血清白蛋白检测的不对称菁染料的荧光测试方法，其特征是所述缓冲溶液为PH为7、浓度为O. 2mol/L的磷酸盐缓冲溶液、羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液或醋酸-醋酸铵缓冲溶液。
10.如权利要求3所述用于牛血清白蛋白检测的不对称菁染料的荧光测试方法，其特征是所述荧光光谱仪激发和发射的狭缝宽度值选择3 20，选用最大激发波长为400 620nm。
全文摘要
本发明涉及一种不对称菁染料，具体涉及一种不对称菁染料的制备及其用于牛血清白蛋白检测的方法，属于化工高新技术化学及生物化学分析技术领域。本发明提供了实验室定量测量微量牛血清白蛋白的一种简单可操作的方法，普通的实验室科研人员可以依据此原理，合成出合适的染料，并经过配制溶液后作出标准曲线，用于牛血清白蛋白的微量定量分析。其制备2-甲基-3-烷基取代苯并噻唑季铵盐时，收集产物后继续加热回流反应，回流结束后冷却过滤，母液再重复加热回流，冷却过滤，大大提高了产物的产率，其产率由原来的20%提高到95%以上。采用荧光光谱仪对微量牛血清白蛋白进行检测，检测灵敏度高，可以达到微摩尔级的染料浓度；染料合成方法简单，采用重结晶方法，纯化效率高。
文档编号C09B23/06GK102618060SQ20121007086
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月17日 优先权日2012年3月17日
发明者张丹, 郭琳, 陈秀英 申请人:江南大学