专利名称：吲哚类半菁染料的合成与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类吲哚类半菁染料的合成与应用，属于精细化工领域中一类功能染料的合成及其作为荧光染料的应用。
背景技术：
细胞内质子在许多细胞过程中都扮演一个重要的角色，如细胞的成长、钙的调节、细胞内吞作用、细胞粘连等。研究细胞内PH的动力学对理解许多细胞内生理机能的调节机制是至关重要的。检测细胞内pH的方法很多，如微电极、核磁共振等，而荧光显微镜比这些方法更灵敏、更方便，因此近几年荧光PH探针被广泛用于监控细胞内pH 的变化。一般来说，细胞内存在两个较宽的PH范围一个是大约6. 8 - 7. 4，如细胞质；另一个是大约4. 5 - 6. 0，即所谓的酸性细胞器，如溶酶体。以各种荧光团为母体的pH探针已经被报道，有些已被用于组织或活细胞成像，有些也已经商品化。但是具有双发射的PH探针已见报道的很少。特别是酸性PH探针，几乎都是基于光诱导电子转移(PET)机理，因此没有波长的变化。虽然商品化探针DND160是具有双发射的酸性pH探针(Dirni Z, Chen CS, Zhang CChem. Biol. 1999，6 (7) : 411-418)，但其缺点明显探针的吸收和发射波长都很短，容易对细胞造成损伤，而且还会产生生物质自荧光的干扰。因此合成较长波长的双发射、低PKa的探针，将会有更好的应用前景。苯乙烯类吲哚菁染料具有良好的光稳定性，合适的水溶性，很好的细胞膜通透性以及在细胞内具有较强的荧光，而且这类染料的合成非常简单，收率也很高，但是通常对PH不敏感。羟基是一个重要的PH探针官能团，许多含有羟基的pH探针已经被报道(Tang B，Liu X，Xu KH, Huang H，Yang Gff, An LG. Chem. Comm. 2007，3726-3728)。而应用于细胞酸泡成像的PH探针需要具有较低的pKa，在染料分子中引入吸电基团可以降低分子的pKa。近几年，具有固体荧光的有机化合物已经受到广泛关注，因为它们不仅可以用来进行基础研究，而且还可能应用于光电领域，如有机发光二极管，光电转换系统。理解它们的发光行为和固态的性能是非常重要的，因为在实际应用中，这些材料一般是以薄膜的形式应用的。然而，具有固态发射的有机化合物很少。这主要是因为在晶体形态或者无定形的固相(例如薄膜)，荧光团之间堆积得非常紧密，即使具有最亮发射的荧光团，也会导致严重的淬灭。另外，固态的激发光和发射光具有很强的消光系数，这对固体荧光是非常有害的(Ozdemir T, Atilgan S，Kutuk I，Yildirim, LTj Tulek A, Bayindir M, Akkaya EU. Org. Lett. 2009，11 (10) : 2105-2107)，特别当荧光团的斯托克斯位移很小的时候。因此，高效的固态荧光分子的开发是一个具有挑战的课题。最近几年，有很多文献(OoyamaY，Mamura T, Yoshida K. E. J. Org. Chem. 2007，5010 - 5019; Shimizu M, TakedaY，Higashi M. Angew. Chem. Int. Ed. 2009，48 (20): 3653-3656; Shimizu M，TakedaY，Higashi M，Hiyama T. Angew. Chem. Int. Ed. 2009，48 (20) : 1-5)报道固体发射的荧光团结构，阐述其发光机理，它们都是带有较大侧链的共轭体系，这样可以抑制分子间的聚集；而且多数分子是供-受体形式，有较强的分子内质子转移(ICT)效应，可以增大荧光团的斯托克斯位移，减少荧光自淬灭。上述许多研究在X-射线单晶衍射的基础上，阐述了固体荧光性质和分子堆积结构的关系。研究表明分子间的强作用和邻近的荧光团之间连续的分子内氢键是导致固态荧光淬灭的主要因素。因此，设计新型的强固态发射的荧光团首先要减少引起荧光淬灭的分子间作用。当前消除分子间聚集的方法主要是引入大体积取代基或者引入具有位阻的取代基构建非平面结构，以此来解决聚集淬灭荧光的问题。苯乙烯类染料具有较强的ICT效应，通过引入较大的取代基也可以使其具有较强的固态荧光，这类染料的光稳定性好，易于合成与纯化，适于光电领域的研究。荧光染料作为功能性色素在科学技术的各个领域得到广泛应用，尤其在生命科学、临床医疗诊断、免疫分析检测等方面的研究在全世界备受瞩目。目前，菲啶类(EB、PI)、吖啶类(AO)、咪唑类(Hoechst、DAPI)和花菁家族类(Cy、T0T0、SYT0)等商品化荧光染料 在基因组学技术、核酸定量检测、血细胞分析等领域中都起到了重要的作用。然而，这些染料都各自存在着应用的局限性。其一主要表现在大多荧光染料受限于固定细胞样品。例如TOPRO、TOTO家族染料、溴乙锭(EB)、碘化丙啶(PI)等需要通过增大细胞膜的通透性或类似使膜崩解的方法才能对生物样品进行有效的荧光标记。然而，这种固定方法往往对细胞和生物组织真实形态的观察有负面影响[Kozubek S，Lukasova E, Amrichova J,Kozubek M, Liskova A, Slotova J. Anal Biochem 2000; 282:29 - 38] 同时，溴乙淀等吖啶，菲啶类染料有很大的毒性和致癌性。其二，有相当一部分荧光染料的激发光处在紫外光区，如能够专一识别脱氧核糖核酸(DNA)的荧光染料4’，6- 二氨基-2-苯基吲哚啉化合物(DAPI)、Hoechst33258，Hoechst34580等，与DNA结合后，在紫外光激发放下产生蓝色荧光。由于紫外光对细胞内的核酸、蛋白等组分会造成严重的损伤，因此这类荧光在荧光显微技术中的使用受到光激发时间的限制[Davis SK, Bardeen CJ. Photochem Photobiol2003; 77:675 - 679]。因此，研究开发出具有良好荧光光谱性能，毒性小，活细胞通透性的新型荧光染料仍然是推动荧光分析技术和生命科学等领域发展的关键和核心。在众多种类的荧光染料中，菁类荧光染料以其波长范围宽，摩尔消光系数大，荧光量子产率适中等优点，作为生物分子荧光探针、CD和VCD记录材料、感光材料光敏剂、光电转换材料等已被广泛的应用。不对称菁类化合物中最典型的为TOTO及其类似物(YOYO)和衍生物类(TOPRPO)。TOTO (噻唑橙二聚体)、Y0Y0 (恶唑黄二聚体)是由Glazer研究组开发的一类对核酸具有高度亲和力的多正电荷不对称菁类荧光染料，通过改变多亚甲基链的长度和两端的芳香母核(噻唑、恶唑、喹啉、吡啶和吲哚啉)的结构可以得到不同的异二聚体类似物和衍生物。这类染料在溶液中几乎无荧光，降低了检测过程中的荧光背景干扰，与核酸结合后荧光增强。此类染料中的有些品种已经商品化，如SYT0X Blue, T0T0,P0P0,BOBO, YO-PRO等。但这些商品化的染料大部分分子较大，结构复杂，属活细胞非通透性，只能应用于活体外核酸的识别与检测。近几年，一些苯乙烯类半菁染料已经逐渐被用于DNA的测试，其中包括吡啶类、苯并噻唑类、喹啉类以及吲哚类等。虽然前三类半菁染料中出现了由柔性链(带电荷或不带电荷)连接的双染料，但是用于生物分子检测的吲哚类的双半菁染料非常少，而用于蛋白检测的吲哚类双半菁染料未见报道。值得注意的是，上述所有的双菁染料中具有活细胞通透性的结构鲜见报道，可能因为报道的双菁染料多以含有正电荷的碳链作为连接基团，增加了染料的水溶性，降低了细胞膜通透能力，阻碍了这些具有优越性能的染料在活细胞细胞器可视化方面的应用。适当的亲脂性可以使探针穿过细胞膜而不会在膜表面堆积(J Colston, Rff Horobin, F Rashid-Doubell, J Pediani, KK Johal. Biotechnic &Histochemistry 2003, 78(6): 323-332);同时，不含水溶性基团的吲哚类菁染料具有良好的活细胞膜通透性。另一方面，长波长的染料不但可以避开生物体自身的吸收和荧光，而且在应用时还能降低激光对细胞的损伤。因此，以吲哚类半菁染料为荧光团，通过不同连接臂的连接，降低其背景荧光，使其在生物分子识别方面具有更好的应用前景
发明内容
本发明的目的是提供一类结构简单、光稳定性好、易于合成的新的化合物。根据取代基的不同，此类化合物可以用于不同领域的功能荧光染料。本发明采用的技术方案是一类吲哚类半菁染料分子具有结构通式I :
&_ R3_ R3
\代4I1M
R61
IA其中 = H、卤素、硝基、磺酸基，R2= H5^R1R2组成萘吲哚环；RjPR4各自独立选自H、羟基、卤素、硝基、Ch烷基；R5 为 H、羟基、N((CH2)niR7)2,其中=R7 = H、OH、OAc、C00H、COOCH3、苯基；R6 为(CH2)pR8,其中=R8 = H、OH、C=C、炔基、OAc、C00H、COOCH3> COOC2H5' p-(C6H4)R9,其中R9 = H、CH3> 卤素、N02、CN、C00H、L-A ；Y—=卤素离子、ClO4'PFf 或 TsCT;L = -Ch8 烧基 _、p-(CH2)q (C6H4) (CH2)q-;m = I 18, n = I 或 2, p = 0 18, q = 1-6。当n=l、R5为羟基时，具有结构式II
RlxScP^OH
II其中R1 = H、卤素、硝基、磺酸基，R2= H;或R1R2组成萘吲哚环；R3和R4各自独立选自H、羟基、卤素、硝基、Cl_4烷基；R6 为(CH2)pR8,其中R8 = H、OH、C=C、炔基、OAc、C00H、C00CH3、C00C2H5、p-(C6H4)R9，其中R9 = H、CH3、卤素、N02、CN、C00H ;
Y-=卤素离子、C104-、PF6-或 Ts0_，其中P= I 18。当R2= H、n=l时，组成结构式III
权利要求
1.一类吲哚类半菁染料，其特征在于所述染料分子具有如下结构通式IV
2.根据权利要求I所述的一类吲哚类半菁染料，其特征在于所述具有结构通式IV的化合物用作生物荧光探针。
全文摘要
一类吲哚类半菁染料的合成与应用，属于精细化工领域中一类功能染料的合成及其作为荧光染料的应用。这类化合物由吲哚季铵盐与相应的醛缩合而成，具有摩尔消光系数大，光稳定性好，易于合成等优点。该类分子根据其取代基、阴离子的不同，可以具有pH探针性质、固态荧光性质和与生物大分子结合的性能。作为pH探针时，可根据取代基的不同调节探针的pKa，并且可用于双色活细胞成像；作为固态发射染料时，根据取代基与阴离子的不同，可以调节其固态发射波长；作为生物分子探针时，对生物分子有很好的反应，且具有活细胞细胞膜通透能力，可用于细胞染色，而且由于其吸收和发射波长较长，可以避免生物质自荧光的干扰，还能降低激发光对细胞或生物组织的损伤。
文档编号G01N21/64GK102964863SQ20121033096
公开日2013年3月13日 申请日期2010年4月10日 优先权日2010年4月10日
发明者彭孝军, 王炳帅, 樊江莉, 王静云, 吴彤 申请人:大连理工大学