成像用荧光纳米探针及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及纳米探针技术领域，特别是指一种成像用荧光纳米探针及其制备方 法。
【背景技术】
[0002] 近年来，近红外荧光成像成为国外前哨淋巴结活检的新技术和新趋势，有代 替放射性核素的应用前景。近红外荧光成像是利用生物体组织在近红外（发射波长 650-1000nm)区域自体光吸收或荧光强度小、致密介质（如组织）的光散射低、激发光的穿 透性强、自发荧光的背景干扰小等特点，能对生物体较深部组织进行有效成像的一种影像 学新技术。近红外荧光染料吲哚菁绿经美国食品和药物管理局批准可用于淋巴流和前哨 淋巴结成像的临床实验。临床实验结果表明，近红外成像系统以低剂量（l〇-l〇〇yg)吲哚 菁绿可以高效且准确的检出乳腺癌和黑色素瘤患者的前哨淋巴结。然而由于吲哚菁绿缺 乏反应基团，很难通过将其与其他材料接合，来增加其分子粒径大小，以此延迟成像维持时 间。随着纳米技术的成熟，多种纳米粒子已被用于前哨淋巴结定位研究，如量子点、金纳米 笼、近红外发光纳米胶聚合物和超顺磁性纳米粒子等，但均处于临床前研究阶段，且都有还 未攻破的缺陷，如潜在的生物毒性、昂贵的价格、不适合术中前哨淋巴结定位、制作工艺复 杂等。
[0003] 由于纳米级聚合物的灵活性和可调节性，近年来，该体系用于生物成像的研究受 到研究者们的重视。纳米级聚合物包括共轭聚合物、纳米胶聚合物、纳米复合物、脂质体纳 米聚合物等，可以选择不同的骨架物质（支链淀粉、Y-谷氨酸和磷脂等无毒物质），通过在 其内部或表面接上不同显像剂来达到作为前哨淋巴结示踪剂所需的要求，也可为其接上多 种显像剂用于多模式成像，但是现有的聚合物粒径都较大，大于50nm，不能即时成像SLN。 虽然它们具有良好的生物兼容性，为低毒物质，但是掺杂入显像剂的它们很可能变成带有 毒性的物质。
【发明内容】
[0004] 本发明提出一种成像用荧光纳米探针及其制备方法，该纳米探针用作SLN示踪 剂，通过巯基化小分子葡聚糖，再接上疏水的脱氧胆酸，在水溶液里自组装成纳米级葡聚糖 胶，通过化学反应引入荧光染料Cy7,该探针具有良好的生物相容性、在SLN内长滞留时间、 高效率、高分辨率、高耐光漂泊性和无毒无害等特性。
[0005] 本发明的技术方案是这样实现的：
[0006] -种结构式如式（I)所示的物质作为成像用荧光纳米探针使用；
[0007]
[0008] 作为优选的技术方案，所述式（I)所示的物质携带荧光基团。
[0009] 作为优选的技术方案，所述荧光基团为Cy7。
[0010] -种成像用荧光纳米探针的制备方法，包括：
[0011] 葡聚糖与对硝基苯基碳酸酯（PNC)反应得到Dextran-PNC;
[0012] 所述Dextran-PNC与巯基乙胺反应得到巯基化葡聚糖（Dextran-SH);
[0013] 所述Dextran-SH与2-吡啶半胱氨盐酸盐（PDA)反应得到Dex-SS-NH2;
[0014] 运用EDC法活化激活脱氧胆酸（DCA)的羧基；活化后的所述脱氧胆酸在室温条件 下与Dex-SS-NH2 反应，得到Dex-SS-DCA;
[0015] 所述Dex-SS-DCA和荧光染料Cy7溶于二甲基亚砜，室温避光反应，之后透析、冻干 即得Dextran_Cy7粉末。
[0016] 作为优选的技术方案，所述葡聚糖与对硝基苯基碳酸酯的质量比为3-5:1-3;反 应条件为：温度25°C，反应时间30_50h。
[0017] 作为优选的技术方案，所述Dextran-PNC与巯基乙胺的质量比1-2:4-5;反应条件 为：温度25°C，反应时间20-30h。
[0018] 作为优选的技术方案，所述Dextran-SH与2-吡啶半胱氨盐酸盐的质量比 1-2:2-3;反应条件为：温度25°C，反应时间20-30h。
[0019] 作为优选的技术方案，所述脱氧胆酸与Dex-SS-NH2的质量比10-20:1-3;反应条 件为：温度25°C，反应时间30-50h。
[0020] 作为优选的技术方案，所述Dex-SS-DCA与荧光染料Cy7的质量比35-40:1;反应 条件为：温度25°C，反应时间30-50h。
[0021] 作为优选的技术方案，所述透析使用截流3500分子量的透析袋。
[0022] 作为优选的技术方案，所述冻干的条件为0.lmbar的负压。
[0023] 有益效果
[0024](1)本发明的成像用荧光纳米探针与量子点相比，这探针几乎是由无毒物质组成， 对机体无害；与ICG相比，探针粒径较大，可以在淋巴结内驻留更长时间，可以提供更长的 手术时间和手术准确率；与美兰相比，可以成像定位深部淋巴结，准确性高，再加之近红外 成像，对机体无辐射。
[0025] (2)本发明的成像用荧光纳米探针具有较好生物相容性、适合术前及术中同时定 位前哨淋巴结、制备方法简单且廉价的纳米级探针，借助近红外成像系统该探针能够高效 且清晰的定位深埋在组织下的前哨淋巴结，并且能够维持较长时间的成像，且对机体无毒 害作用、放射性损伤等不良副作用。
[0026] 探针进入机体后，在体内还原环境的作用下，连接DCA和葡聚糖间的二硫键被快 速代谢分解，探针分解成几乎无毒的葡聚糖和脱氧胆酸，再经肝肾等排泄器官代谢出体 外。
[0027] (3)本发明制得的纳米探针粒径控制在10_50nm，表面结构含有可修饰基团，易于 连接其他功能基团。
【附图说明】
[0028] 为了更清楚地说明本发明实施方案或现有技术中的技术方案，下面将对实施方案 或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅 是本发明的一些实施方案，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提 下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0029] 图1为实施例lDextran_Cy7的电学显微镜照片。
[0030]图2为实施例lDextran-Cy7的荧光分光光度计绘制的荧光光谱；1为Cy7, 2为Dex-Cy7〇
[0031] 图3为实施例lCy7标准曲线图，及所得回归方程。
[0032] 图4为实施例lDextran_Cy7活体成像小鼠腋窝淋巴结。
【具体实施方式】
[0033] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施 例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通 技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范 围。
[0034] 如何构建巯基化葡聚糖是本发明的一个关键技术难点；另外，还要活化脱氧胆酸 (DCA)的羟基，并通过控制硝基苯基碳酸酯（PNC)和葡聚糖的投料比来得到不同分子量 的带有二硫键及脱氧胆酸的葡聚糖分子（Dextran-SS-DCA)，使得合成产物将粒径控制在 10-50nm、表面结构含有可修饰基团，易于连接其他功能基团。下面详述之。
[0035] 下述实施例中使用的原料均为市售。下述制备过程中的原料之间的比例可以在 所给的范围内进行选择，所得DeXtran-Cy7粉末均可作为成像用纳米探针使用。葡聚糖 与对硝基苯基碳酸酯的质量比为3-5:1-3 ;Dextran-PNC与巯基乙胺的质量比1-2:4-5 ; Dextran-SH与2-吡啶半胱氨盐酸盐的质量比1-2:2-3 ;脱氧胆酸与Dex-SS-NH2的质量比 10-20:1-3 ;Dex-SS-DCA与荧光染料Cy7 的质量比 35-40:1。
[0036] 实施例1
[0037] 葡聚糖50mg与对硝基苯基碳酸酯（PNC) 30mg，在25°C温度反应40h，得到 Dextran-PNC，D