一种解链式水解探针实时荧光pcr的制作方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于分子生物学及核酸扩增PCR技术领域，具体涉及一种解链式水解探针 及实时荧光PCR技术。
【背景技术】：
[0002] 核酸扩增PCR技术是随着现代分子生物学的进步而一起发展、成熟的，早在1953 年，核酸DNA双螺旋模型及其中心法则开创了现代分子生物学及奠定了聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction，PCR)的基础，甚至Khorana于1971年就直接提出了核酸体 外扩增的设想："经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该 过程便可克隆tRNA基因"。1983年，美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Kary Mullis在 研究核酸测序方法时产生了核酸扩增的灵感：于试管中模拟天然的DNA体内复制过程。提 供一种合适的条件模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复 性及延伸的温度与时间，就可成几何级数地扩增已知两端序列的一段DNA分子。经过一系 列探索、发展和耐热聚合酶、热循环仪的发明、应用，Cetus公司于1987年申请了首个PCR发 明专利（US Patent 4,683,202)〇
[0003] PCR技术以其独有的高灵敏度、强特异性、简便快速和纯度要求低的特点而成为生 命科学研究的核心基础技术。但传统的PCR(又称为终末PCR)需将产物凝胶电泳检测进 行结果分析，传统的PCR由于PCR产物量变异大的局限性，只能检测反应终末产物的定性 而不能精确定量，同时也没有解决气雾胶污染、引物二聚体、非特异性扩增等难题，因此传 统的PCR结合产物凝胶电泳检测方法不适用于临床检验等应用检测。1992年Higuchi等 首次提出了采用动态PCR方法和封闭式荧光检测方式对目的基因数量进行分析，为解决传 统PCR的难题提出了新思路。1996年由美国Applied Biosystems公司推出实时荧光定量 PCR技术，所谓实时荧光定量PCR技术，是指实时荧光PCR定量分析是通过实时检测扩增产 物量（产物标记荧光强度）与起始靶基因量直接相关而定量。扩增产物量增加的荧光信号 达到对数期的循环数Ct值（Cycle threshold)与祀模板起始拷贝数的对数存在负相关线 性关系。即起始模板稀释一倍达到同样对数期荧光强度所需的扩增循环就要增加一个循环 数（Ct)。该技术实行完全闭管式操作，避免了传统PCR开盖引起的产物污染问题，减少了假 阳性结果的出现，同时也避免了对环境的污染。相比于传统PCR电泳的方法，该技术操作简 便，检测结果以更客观的数据形式展现，从而对样本进行阳性、阴性和可疑的判定，保证了 结果的准确性。
[0004] 实时荧光定量PCR扩增产物增加的信号既可通过染料法来显示，又可采用带淬灭 基团的探针法来检测。染料法即在PCR反应体系中，加入过量荧光染料（如SYBR Green I)，荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的染料分子不会发 射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。非特异的染料法 成本较低，但面临着类似于传统PCR非特异性扩增产物干扰的假阳性问题。探针法即PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分 别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被 淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的Y -3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团 和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一 个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。与染料法相比，探针法 在一定程度上避免了假阳性问题的出现，其特异性有引物和探针双重保证，进一步增加了 结果的可信度。
[0005] 被淬灭的荧光探针即可以通过降解而激活，如1995年美国PE公司研制出了 Taq 酶水解的荧光标记探针及实时荧光定量PCR技术（Livak KJ，et al.，1995, Genome Res : 4 :357-362)，于1997年申请了水解探针（商品名：TaqMan) PCR发明专利（US Patent 6, 485, 903)，以及Epoch公司在水解荧光探针基础上增加结合效率的MGB探针（US Patent 7, 205, 105)。相较于TaqMan探针，该探针大大改善了本底信号的干扰，其较短的探针设计 不但增强了淬灭效果，降低了荧光背景，同时能够较好地区分等位基因，可以检测单个碱基 的突变（SNP)。2009年，美国的Igor V. Kutyavin提出了一种新的PCR检测技术-Snake系 统，该系统通过在一条引物5'端添加一段与该条引物扩增产物探针5'端结合位点前面序 列相同的特定碱基片段，使再一次扩增的产物自身3'端能够形成茎环状二级结构，再与探 针结合后可作为Taq酶最佳的水解底物，增强了 Taq酶5' 一 3'外切核酸酶的效率。不同 于TaqMan，Snake系统可以使用较短的探针来改善荧光背景，在信号的产生和序列检测，尤 其是单核苷酸检测方面有较强的优势。
[0006] 被淬灭的焚光探针也可以通过二级结构改变而激活，分子信标Molecular beacon(Tyagi S，et al，1996, Nat Biotechnol 14 :303-308)正是这样一种莖环结构的杂 交探针，于1999年申请了 Molecular beacon发明专利（US Patent 05925517)，这一结构 使荧光基团与淬灭基团紧密接触，从而有效的解决了 TaqMan较高的背景荧光问题。其它双 杂交（FRET)探针，蝎形（Scorpion)探针，Sunrise_Primer，Lux Pimers等使用范围局限于 一定的应用，不明显优于水解探针TaqMan方法，且与本发明路线、原理不同。目前临床检验 使用最广的是水解探针TaqMan实时荧光PCR，而基础科研还是广泛使用基于荧光染料SYBR Green I的实时荧光PCR0
[0007] 常规PCR检测终末反应-平台期扩增产物，一般只需扩增25至30个循环；而实时 荧光PCR检测的是对数初期的循环数Ct值，TaqMan等标记探针PCR至少需要扩增40个循 环，基于荧光染料SYBR Green I的实时荧光PCR为了发挥更高灵敏度通常需要扩增45个 循环。因此实时荧光PCR技术存在着更严重的引物二聚体非特异性扩增问题，过量的一对 引物3'末端互补延伸产生二聚体，再大量被非特异性扩增。引物二聚体一般借助3'末端 多个互补碱基配对、互为引物延伸形成二聚体，引物对之间多个连续互补序列可通过常规 引物设计方法避免，但有1-2个互补序列不可避免，由于DNA链可弯曲转向，末端少数碱基 互补可借助3'末端外的多个不连续互补碱基的合力结合、延伸产生二聚体，在随后热循环 中以二聚体为模板结合引物大量非特异性扩增、并结合染料。在不加模板的基于染料SYBR Green I实时荧光PCR实验中，绝大多数一对引物产生二聚体的循环阈值（Ct值）一般在30 个循环左右（Jannine Brownie，et al，1997，Nucleic Acids Research 25:3235-3241)，严 重干扰低浓度靶分子定量和弱阳性误读。
[0008] 其实常被忽略的是TaqMan等探针实时荧光PCR亦存在引物二聚体问题，只是不见 引物二聚体发射荧光，但会耗尽PCR系统成份，降低扩增效率及灵敏度。更严重的是TaqMan 等探针与过量引物之间亦会杂交互补、延伸，在不加模板，仅加一对引物与TaqMan探针的 SYBR Green I实时PCR的Ct值提前至35~25个循环左右，说明引物加探针PCR会形成一 些"带探针序列的二聚体、三聚体"，随后非特异性扩增的"二、三聚体"竞争结合大量TaqMan 探针，导致弱阳性模板不易结合探针而可能漏检。TaqMan-分子信标的使用，在一定程度上 解决了荧光基线的问题，增加了探针的特异性，但直接首尾端的互补，并没有杜绝引物和探 针的聚合现象（孔德明等，2003,化学学报，755-759)。为了消除或减少引物与探针结合、延 伸的非特异性扩增干扰，本发明"一种解链式水解探针实时荧光PCR"整合了 5'端TaqMan 探针的荧光标记和结合探针中部序列的3'端分子信标Molecular Beacon标记淬灭基团的 技术路线，并对其结构进行调整，使探针分子之间相互结合，从而消除或减少与引物聚合的 非特异性问题。
【发明内容】
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[0009] 为了克服标记探针与引物对间形成聚合体造成的TaqMan实时荧光PCR的非特异 性干扰靶扩增，以及引物非特异性竟争结合导致弱阳性标本容易漏检的局限。本发明"一 种解链式水解探针实时荧光PCR"，其综合了水解荧光探针TaqMan和分子信标Molecular Beacon的原理技术，并对其结构进行调整，探针5'端具有与水解荧光探针TaqMan的相同 作用机理，利用Taq酶5' -3'外切酶活性水解与靶序列杂交的探针而切割释放报告荧光基 团；探针3'端靶序列外添加5~8个与离5'端3~14个后面的中部序列反向互补的碱 基再标记淬灭荧光基团。由于环状结合部分较短杂交使自身较难形成锅柄样结构，但两探 针两段结合力大而很容易互补结合，这样不仅加强抑制本底荧光，也规避了探针与过量引 物间形成非特异性杂交延伸的聚合体，兼容了 Molecular beacon本底低和TaqMan灵敏、 特异的优点，从而消除