一组用于表皮葡萄球菌实时荧光pcr检测的特异性引物和探针的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物检测方法技术领域，具体涉及一组用于表皮葡萄球菌实时荧光 PCR检测的特异性引物和探针。
【背景技术】
[0002] 表皮葡萄球菌（在自然界中分布广泛，是一种重 要的机会致病菌，是血浆凝固酶阴性的葡萄糖球菌。SE引起的医院感染是多部位的，其致 病性随细菌侵入途径、菌量、毒力及机体免疫力不同而异，尤其是SE引起的败血症，易被原 发病所掩盖，一旦发现病已危重，预后差。此外，SE引起的临床感染好发于血液病的颗粒细 胞缺乏症及实体恶性肿瘤的病人，主要是由于大量使用免疫抑制剂和广谱抗生素，还与严 重原发病长期住院过程中易发生的呼吸道、手续伤口、气管切开、留置导尿及静脉导管等感 染有关。SE对多种抗菌素具有耐药性，造成临床治疗的困难。近年来随着抗生素的广泛应 用，医疗技术的进步，该菌从各种临床样本的分离率日益升高，甚至超过金黄色葡萄球菌而 居革兰氏阳性菌之首位，成为了医院感染的重要致病菌。
[0003] SE感染的诊断至今仍是一个难题。由于SE广泛存在，为常见的细菌培养的污染 菌，目前主要依靠不同部位感染的临床表现和在血液、脑脊液、尿、分泌物的涂片及培养中 找到的病原菌作为诊断依据。此方法需经过增菌培养、选择筛选、生化鉴定、血清分型等流 程，耗时一周左右，不利于快速、准确的对表皮葡萄球菌进行检测。用免疫酶试验、免疫扩散 法、乳胶凝集试验和免疫荧光法及酶联免疫吸附试验等方法检测SE的结果尚不理想。近年 来发展起来的实时焚光定量PCR (Fluorescence quantitative PCR)技术从常规PCR定性 检测迈上量化的台阶，实现了 PCR技术从定性到定量的飞跃，避免了传统PCR定量鉴定中交 叉污染的问题，它相对于常规PCR技术先进、操作简便，实现了实时监测、绝对定量和快速 检测的目的，同时具有灵敏度高、特异性好、操作便捷等优点。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于设计一组表皮葡萄球菌特异性引物和探针序列，建立一种能 广泛应用于表皮葡萄球菌检测的快速、灵敏、特异性好的荧光定性或定量PCR检测的方 法。本发明采用基因克隆技术，将表皮葡萄球菌聚集相关蛋白（Accumulation associated protein)基因片段插入到载体pMD18-T中，获得含有Aap基因片段的重组质粒，以此作为 标准品。根据表皮葡萄球菌Aap的基因片段编码基因序列设计并合成一组特异性引物和探 针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立 的方法进行评估。
[0005] 本发明通过以下技术方案予以实现： 本发明的第一个目的是提供一组用于表皮葡萄球菌实时荧光PCR检测的特异性引物 和探针，所述特异性引物和探针的核苷酸序列为（1)_(3)中的一种： (1) 、上游引物：5'_ TCGGATCTCCATCAACT -3' 下游引物：5'_ TCAAACAACGCAACCAG -3' 探针：5' - TTTTGTCACATCATCCACTGG -3' 所述引物和探针扩增的目标核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No. 2; (2) 、与（1)所述序列互补的序列。
[0006] 经实验验证，将（1)中所述序列向5'端和3'端方向延伸一至数个碱基或删减一 至数个碱基得到的引物序列也能很好的扩增上述目标核苷酸序列。
[0007] 作为优选，所述探针的5'端荧光报告基团是FAM、TET、JOE、HEX或VIC，3'端标记 的是荧光淬灭基团TAMRA、DABCYL或BHQ。
[0008] 本发明的第二个目的是提供表皮葡萄球菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述 试剂盒为表皮葡萄球菌的定性或定量检测试剂盒；所述试剂盒包括权利要求1所述的引物 和探针； 作为优选，所述定量检测试剂盒还包括标准品，所述标准品的制备方法为：将表皮葡萄 球菌保守基因片段插入到载体PMD18-T中，转化至大肠杆菌中进行诱导表达，获得含有表 皮葡萄球菌保守基因片段的重组质粒，以此作为标准品；所述表皮葡萄球菌保守基因片段 参见序列表中SEQ ID No. 1 ; 作为进一步优选，所述表皮葡萄球菌保守基因片段是以表皮葡萄球菌标准菌株的DNA 为模板，使用下述引物进行PCR扩增获得的： 上游引物：5' -TTTAACACGCTCTTCACCTG-3' 下游引物：5'_ GTAGTCAAACAACGCAACCA -3' ； 作为最优选，所述PCR扩增的条件为：94°C预变性5min;94°C 30s、60°C 30s、72°C lmin，35 个循环；72°C lOmin。
[0009] 本发明的第三个目的是提供上述特异性引物和探针、试剂盒在定性或定量检测表 皮葡萄球菌含量中的应用。
[0010] 本发明的第四个目的是提供表皮葡萄球菌的实时荧光定量PCR检测方法，步骤如 下： (1)制备标准品：将表皮葡萄球菌保守基因片段插入到载体PMD18-T中，转化至大肠杆 菌中进行诱导表达，获得含有表皮葡萄球菌保守基因片段的重组质粒，以此作为标准品；所 述表皮葡萄球菌保守基因片段参见序列表中SEQ ID No. 1 ; (2 )标准曲线绘制； (3) 使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品和标准品采用相同的反应体 系进行实时荧光PCR扩增； (4) 通过标准曲线和待测样品的Ct值进行表皮葡萄球菌的快速定量检测。
[0011] 作为优选，所述表皮葡萄球菌保守基因片段是通过以下引物扩增得到的： 上游引物为 5' -TTTAACACGCTCTTCACCTG-3' ； 下游引物为 5'- GTAGTCAAACAACGCAACCA -3' ； 作为优选，PCR扩增所述表皮葡萄球菌保守基因片段的条件为：94°C预变性5min ;94°C 30s、6(TC 30s、72°C lmin，35 个循环；72°C IOmin; 作为优选，步骤（3)中所述引物和探针的用量均为I. 6 μ I ; 作为优选，步骤（3)中所述实时荧光PCR扩增的反应条件为：94°C预变性2分钟，94°C 15秒、60°C 40s并收集荧光信号，40个循环。
[0012] 本发明的第五个目的是提供表皮葡萄球菌的定性PCR检测方法，步骤如下： (1) 使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品进行实时荧光PCR扩增； (2) 通过待测样品的Ct值对表皮葡萄球菌进行定性检测：当Ct值小于38时，为阳性； 否则，为阴性； 作为优选，步骤（1)中所述引物和探针的用量均为1. 6 μ 1 ; 作为优选，步骤（1)中所述实时荧光PCR扩增的反应条件为：94°C预变性2分钟，94°C 15秒、60°C 40s并收集荧光信号，40个循环。
[0013] 本发明的第六个目的是提供上述试剂盒的使用方法，步骤如下： (1)制备标准品：将表皮葡萄球菌保守基因片段插入到载体PMD18-T中，转化至大肠杆 菌中进行诱导表达，获得含有表皮葡萄球菌保守基因片段的重组质粒，以此作为标准品；所 述表皮葡萄球菌保守基因片段参见序列表中SEQ ID No. 1 ; (2 )标准曲线绘制； (3) 使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品和标准品采用相同的反应体 系进行实时荧光PCR扩增； (4) 通过标准曲线和待测样品的Ct值进行表皮葡萄球菌的快速定量检测。
[0014] 作为优选，所述表皮葡萄球菌保守基因片段是通过以下引物扩增得到的： 上游引物为 5' -TTTAACACGCTCTTCACCTG-3' ； 下游引物为 5' - GTAGTCAAACAACGCAACCA -3'。
[0015] 作为优选，PCR扩增所述表皮葡萄球菌保守基因片段的条件为：94°C预变性5min ; 94°C 30s、6(TC 30s、72°C lmin，35 个循环；72°C IOmin; 作为优选，步骤（3)中所述引物和探针的用量均为I. 6 μ I ; 作为优选，步骤（3)中所述实时荧光PCR扩增的反应条件为：94°C预变性2分钟，94°C 15秒、60°C 40s并收集荧光信号，40个循环。
[0016] 本发明的第七个目的是提供试剂盒的使用方法，步骤如下： (1) 使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品进行实时荧光PCR扩增； (2) 通过待测样品的Ct值对表皮葡萄球菌进行定性检测：当Ct值小于38时，为阳性； 否则，为阴性。
[0017] 作为优选，步骤（1)中所述引物和探针的用量均为1.6μ1 ; 作为优选，步骤（1)中所述实时荧光PCR扩增的反应条件为：94°C预变性2分钟，94°C 15秒、60°C 40s并收集荧光信号，40个循环。
[0018] 本发明提供用于对表皮葡萄球菌进行定性、定量检测的引物和探针，