lncRNAs筛选方法、ADSCs、软骨细胞诱导分化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体的涉及一种IncRNAs筛选方法、存在差异表达的 ADSCs所含的IncRNAs、高软骨分化能力的ADSCs、软骨细胞的诱导分化方法。
【背景技术】
[0002] 关节软骨的损伤和病变是临床常见疾病，可以发生于任何年龄和性别。由于关节 软骨组织缺少血管系统，淋巴系统和神经支配，本身不含祖细胞，软骨细胞又被包围在致密 细胞基质中，组织损伤后自行修复能力很差，一旦发生损伤，会导致关节肿胀和疼痛，加速 骨关节炎的进展。
[0003]目前，临床上的关节软骨损伤的修复方法主要有软骨清理成形术、软骨下钻空术 等关节表面重建方法，以及骨膜移植等生物治疗方法。它们对延缓关节退化和修复关节一 定功能具有重要作用，但修复后的软骨组织无论在生物学还是在生物力学上均与原来的软 骨有所不同，并易发生软化退变，导致疗效下降。近年来随着细胞培养技术、移植技术及生 物材料科学的发展，组织工程学得到了迅速发展，为修复关节软骨缺损提供了一个新的治 疗途径。软骨组织工程技术是在体外培养、扩增软骨种子细胞，并且以较高浓度将其种植于 具有良好的生物相容性和降解性的支架材料上构建组织工程软骨，然后植入到组织缺损部 位，完成组织的修复和重建。
[0004] 种子细胞是软骨组织工程学中的基本要素之一也是首要环节，选择理想的种子细 胞是组织工程学中的关键。理想的种子细胞需具备以下条件：①来源广泛、取材方便、对机 体损伤少。②在体外培养中具有较强的增殖传代能力、保持良好的生物学活性和表型表达 稳定。③植入体内能耐受机体免疫、高质量地修复关节软骨缺损并能保持良好的远期疗效。 目前用于软骨组织工程的种子细胞主要有软骨细胞、胚胎干细胞以及间充质干细胞等。
[0005] 软骨细胞由于增殖能力较低，体外培养扩增困难且极易发生去分化现象，限制了 其在临床上的应用。
[0006] 胚胎干细胞虽然具有高度的分化潜能，体外能诱导分化成软骨细胞，但是将胚胎 干细胞应用于软骨组织工程需要解决如下问题：①保证足够细胞数目和细胞活性的同时防 止其致瘤性。②影响胚胎干细胞分化的条件，提高定向分化效率以及分化可控性。③胚胎 干细胞衍生物移植导致的免疫排斥。④胚胎干细胞的临床应用所面临的伦理学问题。
[0007] 间充质干细胞是具有向多种细胞系分化潜能的间充质前体细胞，与其它来源间充 质干细胞相比，脂肪来源间充质干细胞（ADSCs)具有以下优点：①不涉及伦理问题；②取材 方便，来源充足，通过抽脂术即可大量获取，对供区影响小，并发症少；③分离培养简单，容 易获得，可在体外大量快速增殖；④在一系列诱导因子作用下可定向分化为软骨细胞；⑤ 免疫原性低，组织相容性好，能适应体内环境，ADSCs生成的软骨可以避免免疫排斥反应。
[0008] ADSCs在体外需要经过诱导才能分化为软骨细胞。这种诱导包括添加许多不同的 生长因子、分化因子、激素和细胞因子。主要的有转化生长因子（TGF-βΙ，TGF-0 3)，胰岛 素样生长因子（IGF-I)，地塞米松，骨形态发生蛋白家族（BMPs)等。ADSCs向软骨细胞分化 过程中的细胞内的作用机制目前还不是很清楚。目前ADSCs体外成软骨诱导分化方法还有 许多需要完善的地方，主要缺点有：体外诱导分化时间长；诱导分化获得的软骨细胞成熟 度不高。因此，本领域迫切需要开发出快速、高效地诱导脂肪干细胞成软骨分化的方法。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种IncRNAs筛选方法、存在 差异表达的ADSCs所含的IncRNAs和高软骨分化能力的ADSCs。以克服现有体外定向诱导 分化成软骨细胞方法存在诱导分化时间长，获得的软骨细胞成熟度不高的缺陷。
[0010] 本发明另一目的在于提供一种软骨细胞的诱导分化方法，以克服现有体外定向诱 导分化成软骨细胞方法存在诱导分化时间长，获得的软骨细胞成熟度不高的缺陷。
[0011] 为了实现上述发明目的，作为本发明的一个方面，提供了一种IncRNAs筛选方法， 包括如下步骤：
[0012] 将ADSCs进行定向诱导分化成软骨细胞处理，并分别取样所述定向诱导分化第X 天、Y天、Z天的细胞；其中，X < Y < Z，且X彡0 ;
[0013] 利用转录组学RNA-seq深度测序技术分别对所述定向诱导分化第X天、Y天、Z天 的所述细胞和成熟软骨细胞进行IncRNAs测序；
[0014] 利用生物信息学分析方法对所述IncRNAs测序的结果进行分析，筛选出ADSCs与 成熟软骨细胞存在差异表达的IncRNAs。
[0015] 作为本发明的另一方面，提供了一种ADSCs所含的IncRNAs，所述IncRNAs为H19、 Scube3、N0NRATG00281 中的至少一种。
[0016] 作为本发明的再一方面，提供了一种高软骨分化能力的ADSCs。所述ADSCs含有 IncRNAs，且所述IncRNAs是由本发明IncRNAs筛选方法筛选出存在差异表达的IncRNAs或 为本发明所述的ADSCs所含的IncRNAs ;
[0017] 其中，所述存在差异表达的IncRNAs为H19、Scube3、N0NRATG00281中的至少一种。
[0018] 作为本发明的又一方面，提供了一种软骨细胞的诱导分化方法，包括对本发明高 软骨分化能力的ADSCs进行成软骨分化的步骤。
[0019] 与现有技术相比，本发明IncRNAs筛选方法采用RNA高通量测序和生物信息学方 法能有效筛选出ADSCs与成熟软骨细胞存在差异表达的特定IncRNAs，以便被作为基因修 饰的研究目标，为获得具有高软骨分化能力的ADSCs提供了基础。
[0020] 本发明 ADSCs 所含的 IncRNAs 为 H19、Scube3、N0NRATG00281 中的至少一种，优选 为H19。因此，采用其修饰其他该ADSCs，能获得具有高软骨分化能力的ADSCs，使得被修饰 后的ADSCs具有快速高效的分化成软骨细胞，使得诱导分化获得的软骨细胞成熟度高。
[0021] 本发明高软骨分化能力的ADSCs由于被本发明IncRNAs筛选方法筛选出的存在差 异表达的IncRNAs或者直接采用本发明ADSCs所含的IncRNAs修饰，因此，其能在体外快 速、高效地分化成软骨细胞，使得诱导分化获得的软骨细胞成熟度高。
[0022] 本发明软骨细胞的诱导分化方法是以上述本发明高软骨分化能力的ADSCs为基 础进行诱导分化，从而有效提高了其诱导分化成软骨细胞的速率，并提高了分化获得的软 骨细胞成熟度高。
【附图说明】
[0023] 图1为发明实施例将ADSCs成软骨诱导第0、3、7天的样本层次聚类分析及热图绘 制；
[0024] 图2为发明实施例筛选出的3个IncRNA在诱导第0天、3天、7天的差异表达；
[0025] 图3为本发明实施例将筛选出的含lncRNA-H19的ADSCs在功能缺失性研究中成 软骨诱导分化第7天的阿尔辛蓝染色结果；其中，图a.对照ADSCs ;图b. RNAiH19-ADSCs ;
[0026] 图4为本发明实施例将筛选出的含lncRNA-H19的ADSCs在功能缺失性研究中成 软骨诱导分化第7天细胞表面II型胶原表达百分比；
[0027] 图5为本发明实施例将筛选出的含lncRNA-H19的ADSCs在功能获得性研究中成 软骨诱导分化第7天的阿尔辛蓝染色结果；其中，图a.对照ADSCs ;图b. H19-ADSCs ;
[0028] 图6为本发明实施例将筛选出的含lncRNA-H19的ADSCs在功能缺失性研究中成 软骨诱导分化第7天细胞表面II型胶原表达百分比。
【具体实施方式】
[0029] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不 用于限定本发明。
[0030] -方面，本发明实施例提供了一种IncRNAs筛选方法，包括如下步骤：
[0031] 步骤SOl :将ADSCs进行定向诱导分化成软骨细胞处理，并分别取样所述定向诱导 分化第X天、Y天、Z天的细胞；其中，X < Y < Z，且X彡0 ;