专利名称：：一种重组人生长激素基因的杆状病毒及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物技术制药工程中的基因工程生产多肽类药物
技术领域：
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背景技术：
：人生长激素(HGH,HumanGrowthHormone)是一种由人体自身分泌的一种多肽，由191氨基酸残基组成的单链球状蛋白，分子量为22000道尔顿，由脑下垂体分泌出，经由下丘脑释放，主控生长发育、免疫和人体新陈代谢。HGH刺激骨骺端软骨细胞分化、增殖，刺激软骨基质细胞增长，引起线性生长加速及骨骼变宽；调节生长激素不足或成人的脂肪、骨代谢、心肾功能，改善运动能力和生活质量。HGH对脂肪组织有促进脂肪分解而使血浆游离脂肪酸升高的作用；HGH可促进许多组织中RNA及蛋白质的合成，出现正氮平衡，使软骨、骨骼、肌肉结締组织及内脏皆增长。生长激素通过血液运输到肝脏并刺激肝脏产生一种被称为类胰岛素生长因子的蛋白质分子(IGF-1)，增加软骨中胶原和其他蛋白质、硫酸软骨素、核酸合成的作用，从而促进软骨细胞的分裂和基质增生，促进骨骼和结締组织的生长。除了这些促进生长的作用外，生长激素还参与机体的代谢调控，它在减少存储于脂肪细胞中的大量油脂、促进细胞内蛋白质分子的聚合、调控血糖水平方面都起着重要作用。因此生长激素对正在生长的机体的整体形态和机能有多方面的影响，在成人阶段也会继续发挥作用，在修复和维护机体不同组织的过程中充当着重要角色，但成年后其分泌随年龄增大而减少。人到达30岁后每十年间HGH分泌就以15%的速率递减，从而引起人体老化。尤其今日的生活环境里，各种压力、不良习惯及食物毒素所造成的危害，使得HGH分泌量迅速减少，人类更因此加速衰老。1920年,科学家发现生长激素。1958年，HerberBoyer潜心研究38年的HGH利用基因重组技术成功问世，并于当年获得诺贝尔生物学奖。1996年，美国FDA批准利用基因工程技术合成的HGH用于人体抗衰老。随着这种重组激素的大量出现，用生长激素治疗疾病成为可能，缺乏生长激素的儿童和成人现在可以通过补充生长激素来治疗。由于遭受某种疾病(如艾滋病)导致肌肉萎缩和身体虛弱的患者也可以从这种补充中获益。目前HGH在激素替代疗法中广泛使用，但因其在肠道极易代谢失去活性，巿场上的HGH制剂主要是注射剂。杆状病毒表达系统这一生物反应器是八十年代建立起来的。自从1983年首次利用杆状病毒表达系统高效表达了人的a-干扰素以来(smith,MolCellBiol.，3:2156.2165，1983),已有数十个外源基因得到了高效表达，仅我国就有a-干扰素(杨冠珍等，生物化学与生物物理学报，22:355-361，1990)、慈菇蛋白酶抑制剂(季平等，蚕业科学，21:223-227,1995)、马立克氏病毒糖蛋白B(肖庆利等，蚕业科学，23:104-108，1997)等多种。杆状病毒包括BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BssNPV、EOSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、UpMNPV、S1MNPV、SeMNPV、TnNPV等，昆虫宿主包括家蚕、野蚕等。目前，杆状病毒表达系统，尤其是其中的家蚕杆状病毒表达系统是世界上最具有商业开发价值的真核生物个体表达系统之一。
发明内容本发明的一个目的在于提供一种重组杆状病毒及其制备方法以及其在制备重组HGH蛋白中的应用。本发明提供的重组杆状病毒，该病毒含有HGH基因，所述HGH基因序列见SEQIDNO.l所示，此重组病毒可接种家蚕，表达重组HGH蛋白。当然，本发明的重组杆状病毒不仅可以接种家蚕，还可接种其它昆虫细胞。在一个具体实施方式中，本发明提供的重组杆状病毒为家蚕杆状病毒。利用本发明的家蚕杆状病毒接种家蚕，可获得家蚕生物反应器。该反应器可大规模生产，具有资源优势和成本优势。该病毒保藏在中囯微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京巿海淀区中关村北一条13号，保藏编号为CGMCCNo.2031,分类命名为家蚕核型多角体病毒Bombyxmorinucleopolyhedrovirus，保藏日期为2007年4月28日。一方面，本发明提供一种制备重组杆状病毒的方法，该方法包括制备人生长激素HGH基因；将制备的含HGH基因的融合基因导入杆状病毒中，形成重组杆状病毒。在一个具体实施方式中，本发明提供制备重组杆状病毒的方法，是通过PCR扩增人生长激素HGH基因，经酶切后导入转移载体获得重组转移载体。然后使该重组转移载体与线性化杆状病毒同源重组，将外源基因插入杆状病毒中，得到含有HGH基因的重组杆状病毒。另一方面，本发明提供一种重组杆状病毒在制备重组HGH蛋白中的应用。另一方面，本发明提供一种利用本发明所述的重组杆状病毒制备重组HGH蛋白的方法。该方法包括将本发明所述的重组杆状病毒接种家蚕，大量表达后，分离纯化，冷冻干燥。在一个具体实施方式中，将本发明所述的重组杆状病毒接种家蚕，接种后5-7天，收集蚕体，-2(TC冻存。取冻存蚕蛹样品，粉碎并离心过滤。取过滤后的匀浆液，离心去除病毒粒子，-50°0冷冻干燥，即得HGH冻干粉。本发明中优化的杆状病毒表达系统为家蚕杆状病毒表达系统，通过基因重组，将HGH基因重组进家蚕杆状病毒BmBacPAK6，获得重组家蚕杆状病毒BmBacHGH，使携带HGH基因的BmBacHGH在不同发育阶段的家蚕(幼虫、蛹等)中繁殖，应用家蚕作为宿主的生物反应器生产HGH。同样，利用别的杆状病毒表达系统，如AcMNPv、ApNPv、等也可按同样的方法表达生产。用基因重组技术，将HGH基因在多角体启动子或别的病毒和真核生物的强启动子的控制之下，通过体内或体外重组，将HGH基因整合到杆状病毒的基因组上，得到重组病毒。重组病毒可通过经口食下或采用各种手段透过表皮感染1-5龄(最优时间为四或五龄)的昆虫幼虫或蛹体，表达生产重组HGH蛋白。本发明中最优化的方案是将HGH基因插入到pAcHLT-B杆状病毒转移载体上，再通过体内重组将HGH基因转移到家蚕杆状病毒BmBacPAK6的基因组上，通过口藍斑筛选技术，获得携带HGH的大量重组家蚕杆状病毒BmBacHGH。将其接种l-5龄的家蚕幼虫或蛹，可大量繁殖。当在蚕体内复制时，HGH基因在多角体蛋白基因启动子控制下表达，产生HGH。在感染5-7天后收集含有HGH的家蚕幼虫或蛹，冻存，粉碎并通过100目网离心过滤，离心去除病毒粒子，取上清，-50匸冷冻干燥，即得重组HGH蛋白冻干粉。HGH基因得到高表达，每个蛹体重组HGH蛋白的产量可达到0.5mg,活性大于1xl07IU/ml。而常规的原核表达，其表达量是0.05-0.3mg/ml菌液。利用此系统来生产的优点在于1.这一表达系统的表达效率极高，重组HGH蛋白产量可达0.5mg/虫的水平，因而可大大降低生产成本，并进行大规模生产。2.这一表达系统为真核表达系统，其表达的外源蛋白质可进行翻译后修饰，使其在生化性质和生物活性等与天然产品相似，这为表达出的HGH具有正常的生物学活性提供了保证。3.用此系统生产的HGH无需经过繁复的纯化步骤，只需将表达HGH的幼虫或蛹初步加工，即可得有生物活性的重组HGH蛋白，大大降低了生产成本。在一个具体实施方式中，本发明利用家蚕为生物反应器，表达具有临床应用价值的重组HGH蛋白。本方法生产的重组HGH蛋白冻干粉经口服、鼻词、灌胃用药具有生物活性，在大鼠、猕猴中鼻饲和灌胃试验证实重组HGH蛋白冻干粉无毒害作用；在小鼠和果蝇口服进行的药效学实验证实其具有延缓衰老作用。本方法适用于大规模生产，成本低，产量高，具有广泛的临床应用前景。图l.重组转移质粒pAcHLT-HGH环状图谱；图2.家蚕血淋巴样品中的重组HGH蛋白的鉴定(A)SDS-PAGE电泳分离M.分子量标准品；1.感染野生杆状病毒BmBacPAK6的对照组；2.感染重组病毒BmBacHGH组，箭头示重组HGH蛋白。(B)Westernblot鉴定1.感染野生杆状病毒BmBacPAK6的对照组；2.感染重组病毒BmBacHGH的样本组。具体实施例方式为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的1.设计引物，从重组质粒PWR-HGH中PCR扩增人生长激素HGH基因。2.构建pAcHLT-HGH载体。经EcoRI与SacI双酶切的HGH基因片段通过T4DNA酶连接克隆至经EcoRI与SacI双酶切的pAcHLT-B杆状病毒转移载体中，使HGH基因置于多角体蛋白(polyhedrin,ph)基因启动子控制之下，构建成重组转移质粒pAcHLT-HGH。3.制备含HGH基因的家蚕重组杆状病毒BmBacHGH。在事先培养的BmN细胞中逐滴加入pAcHLT-HGH转移质粒、经线性化病毒BmBacPAK6DNA和Dosper混合物，27t:培养4-5天，收取上清进行第一轮噬斑筛选和第二轮噬斑筛选。取阳性克隆的上清感染家蚕细胞扩增，即可得到大量的含HGH基因的重组杆状病毒BmBacHGH。4.在家蚕幼虫和蛹中表达重组HGH蛋白。将重组病毒接种于表面消毒过的蚕幼虫或蚕蛹，接种后5-7天，收集蚕蛹，-20^冻存。取冻存蚕蛹样品，粉碎并通过100目网离心过滤。取过滤后的匀浆液，离心去除病毒粒子，取上清，-50°(:冷冻干燥，即得重组HGH蛋白冻干粉。下面结合实施例详细阐述本发明的具体内容实施例l.HGH基因的扩增以HGH基因为模板设计一对引物，上游引物含EcoRI酶切位点，下游引物含SacI酶切位点，引物设计如下上游引物Pl:5，GGGAATTCAGTTTCCTAC-TATACCAC3，(SEQNO.2);下游引物P2:5，TTGAGCTCCTAGAAGCC-ACAGCTGCC3，(SEQN0.3)。从重组质粒PWR-HGH(上海生化所吴祥甫老师惠赠)中PCR扩增人生长激素HGH基因。以重组质粒PWR-HGH为模板，94°C预变性5min后，94°C变性lmin;57。C退火lmin;72。C延伸lmin,30个循环;72。C延伸10min。扩增得到目的HGH基因片段。实施例2，构建含HGH基因的pAcHLT-HGH载体经EcoRI与SacI双酶切的HGH基因片段通过T4DNA酶(MBI)连接克隆至经EcoRI与Sacl双酶切的pAcHLT-B杆状病毒转移载体(购自BDBiosciencesPharmingen)中，使HGH基因置于多角体蛋白(polyhedrin,ph)基因启动子控制之下，构建成重组转移质粒pAcHLT-HGH(如图1)，经酶切分析以及测序鉴定基因序列正确。在家蚕表达体系中重组蛋白HGH以融合蛋白的形式表达。实施例3.家蚕重组杆状病毒BmBacHGH的制备取5μ1重组转移质粒pAcHLT-HGHDNA和6μ1经线性化病毒BmBacPAK6DNA(购自上海生化细胞所)，加入100μl无血清的TC-100培养基(购自GIBCOBRL公司)混勾。取6μ1Dosper(宝灵曼公司)加入100μ1无血清的TC-100培养基混均。将事先培养在35mm平皿中的BmN细胞(购自上海生化细胞所)用无血清的TC-100培养基洗涤两次，并逐滴加入pAcHLT-HGH转移质粒和Dosper混合物，27。C培养4-5天，收取上清进行第一轮噬斑筛选。取5μl上清感染35mm平皿中的BmN细胞，1小时后弃去上清加入等量混合的TC-100培养基和低熔点琼脂糖。4-5天后挑取噬斑，感染BmN细胞3-4天，保存上清，细胞用NaOH裂解用于Southernblot斑点杂交，以HGH基因作模板用随机引物探针标记试剂盒(宝灵曼公司)标记探针，杂交方法按照《分子克隆》(科学出版社，1995)。取阳性克隆的上清进行第二轮噬斑筛选。取阳性克隆的上清感染家蚕细胞扩增。即可得到大量的含HGH基因的重组杆状病毒BmBacHGH。该病毒感染家蚕细胞后，在显微镜下细胞呈发病状。该重组杆状病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏曰期为2007年4月28曰，保藏编号为2031。实施例4.重组HGH蛋白的表达及鉴定约10、fU重组病毒通过接种针感染每条五龄蚕，接种后约120小时幼虫或蛹几乎全部发病，釆取蚕体液和蛹体，经高速离心(12000rpm，30min),取上清测血淋巴中重组HGH蛋白的表达。蛋白样品于15%SDS-PAGE上进行电泳分离。结果显示在约27KDa处感染重组病毒的血淋巴样品有一明显条带(图2，A)，大小与重组HGH蛋白的理论值相当，而在感染野生病毒的对照蛋白样品中并不存在这一条带。为了验证这一特异性蛋白是否可以与HGH抗血清发生特异性免疫反应，我们进行了Westernblot印迹反应，如图2(B)所示，2为感染重组病毒BmBacHGH的家蚕样本，显示该蛋白条带可以与HGH抗血清发生特异性反应，由此可以判断该蛋白为重组HGH蛋白。实施例5.重组HGH蛋白生物活性测定将HGH标准品配制成自2.5pg/ml至62ng/ml—系列浓度的溶液，参照分子克隆一书所示方法进行ELISA检测。4'C过夜的条件下蛋白样品被包被到96孔上，用PBST洗涤后用含1。/。BSA的PBS溶液封闭，37°Clh;HGH抗血清按1:3000稀释后,与包被蛋白37。C孵育2h;PBST溶液洗涤3次，每次5-10min;加入1:2000稀释的二抗(兔抗HGH抗血清，购自sigma公司)37°C孵育lh;OPD柠檬酸钠缓冲液显色后测OD492，并以此建立标准曲线表示蛋白浓度与吸光度的关系。细胞表达蛋白样品与蚕血淋巴在同样的条件下进行ELISA,分别测得OD492值，根据标准曲线可以计算样品中重组HGH蛋白的含量和效价。。每个蛹体重组HGH蛋白的产量可达到0.5mg,活性大于1x107IU/ml。实施例6.重组HGH口服药物的制备及动物实验蚕蛹在接种BmBacHGH前经70%食用酒精浸泡3min,进行表面消毒。感染5-7天，收集蚕蛹，-20'C冻存。取适量冻存蚕蛹样品，用二级胶体磨粉碎并通过IOO目网离心(600rpm，10min)过滤。取过滤后的匀浆液，12000rpm离心20-60min,取上清，再30000rpm离心30-90min，去除病毒粒子，离心结束后，取上清，真空冷冻干燥机中冷冻干燥(-5(TC),制成冻干粉。辅料制造正常9曰龄蚕蛹，用70%食用酒精浸泡3分钟进行表面消毒。经低温(0~-20°C)粉碎匀浆，过100目网筛(600rpmx30min)，取上清液冷冻干燥(冻干条件与HGH原料相同)。冻干粉留样检定，其余冷藏于fC,检定合格后作为辅料。根据HGH含量，按比例加入辅料使HGH含量在13Mg/100mg以上。充分混匀后填装胶囊，包装后为成品。以下动物实验，剂量均是HGH的实际含量计算。实施例7.重组HGH口服药物的毒性实验及药效实验实验动物猕猴(Macacamulatta)由福建省计划生育科学技术研究所非人灵长类实验中心提供，实验动物质量合格证(生产猕猴)闽实动质准第12号。猕猴16只，体重3.6-5.8kg,雌雄各半，随机分为4组，重组人生长激素(HGH)低、中、高三个剂量组分别100-300jug、400-800jug、1100-1300ng/kg/d,，另设蒸馏水作溶剂对照组，釆用鼻饲灌胃给药，连续给药52天，剖杀8只动物(雌雄各半)，其余动物停药30天作恢复期观察，分别对给药期和恢复期各剂量组猕猴体重、进食量、呼吸、血压、心电图、血液学、尿液、血液生化学、脏器系数等各项指标进行检测，结果表明，各用药组上述检测指标与用药前比较均未见明显异常。对各组猕猴主要脏器进行病理组织学检查，未发现有毒理意义的组织学改变。猕猴灌胃给予重组人的生长激素(HGH)高剂量，连续52天，未发现明显毒性反应，多项检测均属正常。长毒实验SD大鼠灌胃给药重组人生长激素胶囊1250Mg/kg/d,连续60天，结果显示毒性反应为血糖含量增高，停药30天恢复正常水平，毒性反应系可逆性。重组HGH蛋白的大鼠灌胃实验结果显示，无毒副反应的安全剂量为250jug/kg/d以下。急毒结果显示，重组HGH对NIH小鼠和SD大鼠经灌胃给药的最大耐受量均大于3300ug/kg。小鼠的重组HGH给药的药效学实验(参见表1):小鼠口服给予该胶囊50天后与空白对照组相比，低剂量组(0.05g/日/60kg)心脏脂褐素含量下降22%,肝脏SOD比活力提高16%，中剂量组(0.1g/日/60kg)心脏脂褐素含量下降13%(PO.05),肝脏SOD比活力提高19%(PO.01),高剂量组(0.3g/日緣g)心脏脂褐素含量下降12%(P<0.05)，肝脏SOD比活力提高28%(PO.OOl)。果蝇实验结果表明与空白对照组相比(参见表2)，低剂量组雄性果蝇平均寿命延长了11%(PO.05),中剂量组雄性果蝇平均寿命延长了12%(PO.05),半数死亡时间延长8天，雌性果蝇平均寿命延长8%,高剂量组雄性果蝇平均寿命延长了14%(P<0.05)，半数死亡时间延长7天，雌性果蜷平均寿命延长10%。<table>complextableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表2.果绳的不同剂量重组HGH蛋白的药效结果可见，该重组HGH蛋白制品在动物体内无毒副作用，安全可靠，口服吸收效果好，可延缓衰老。SEQUENCELISTING序列表<110>浙江中奇生物药业股份有限公司<120>—种重组人生长激素基因的杆状病毒及其制备方法与应用<130>081003-I-CP-NZJ<160>3<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>654<212>DNA<213>HGH<400>1atggctacaggctcccggacgtccctgctcctggcttttggcctgctctgcctgccctgg60cttcaagagggcagtgccttcccaaccattcccttatccaggctttttgacaacgctatg120ctccgcgcccatcgtctgcaccagctggcctttgacacctaccaggagtttg犯gaagcc180tatatcccaaaggaacagaagtattcattcctgcagaacccccagacctccctctgtttc240tcagagtctattccgacaccctccaacagggaggaaacacaacagaaatccaacctagag300ctgctccgcatctccctgctgctcatccagtcgtggctggagcccgtgcagttcctcagg360agtgtcttcgccaacagcctggtgtacggcgcctctgacagcaacgtctatgacctccta420aaggacctagaggaaggcatccaaacgctgatggggaggctggaagatggcagcccccgg480actgggcagatcttcaagcagacctacagcaagttcgacacaaactcacacaacgatgac540gcactactcaagaactacgggctgctctactgcttcaggaaggacatggacaaggtcgag600acattcctgcgcatcgtgcagtgccgctctgtggagggcagctgtggcttctag654<210>2<211>26<212>DNA<213〉引物Pl<400>2gggaattcagtttcctactataccac26<210>3<211>26<212>DNA<213>引物P2<400〉3Ttgagctcctagaagccacagctgcc2权利要求1.一种重组杆状病毒，其特征在于，该病毒含有人生长激素HGH基因。2.根据权利要求l所述的重组杆状病毒，其特征在于，所述的HGH基因如SEQIDNO.l所示。3.根据权利要求l所述的重组杆状病毒，其特征在于，所述病毒为家蚕杆状病毒。4.根据权利要求所述的重组杆状病毒，其特征在于，所述病毒为BmBacPAK6。5.根据权利要求4所述的重组杆状病毒，该病毒保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.2031。6.—种制备权利要求l所述重组杆状病毒的方法，该方法包括a)制备HGH基因；b)将所制备的HGH基因导入到转移载体中，获得重组转移载体；c)将步骤(2)所获得的重组转移载体DNA与杆状病毒DNA同源重组，获得重组杆状病毒。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述转移载体为pAcHLT-B质粒。8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述杆状病毒为家蚕杆状病毒BmBacPAK6。9.一种制备HGH冻干粉的方法，该方法包括用权利要求1至5任一项所述的重组杆状病毒接种家蚕，经高效表达后，收集蚕体粉碎、离心、过滤去除病毒粒子、冷冻干燥，即获得含重组HGH蛋白冻干粉。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述家蚕可为蚕幼虫或蚕蛹。11.一种昆虫，其特征在于，感染如权利要求5所述重组杆状病毒并表达重组HGH蛋白。12.根据权利要求11所述的昆虫，其特征在于，所述昆虫为家蚕。13.—种药物，其特征在于，其活性成分含有根据权利要求9或10所述方法制备的重组HGH冻干粉。14.根据权利要求13所述药物，其特征在于，其辅料为蚕或蚕蛹的冻干粉。15.根据权利要求13或14所述的药物，其特征在于，所述药物用于口服。全文摘要本发明涉及一种重组杆状病毒及其制备方法和应用。本发明构建含有人生长激素基因HGH的重组杆状病毒，可在家蚕中高效表达重组HGH蛋白，经药物实验证明所述重组HGH蛋白制品在动物体内无毒副作用，安全可靠，口服吸收效果好，可延缓衰老。本发明原料易得，生产成本低，具有重要的产业化价值，并具有作为口服药物和食品的前景。文档编号C12N7/01GK101343624SQ20081012750公开日2009年1月14日申请日期2008年6月25日优先权日2008年6月25日发明者飞任,何春波,昆杨,陈国刚申请人:浙江中奇生物药业股份有限公司