生长激素化合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明的领域是主要通过重组方法制备的生长激素化合物。作为野生型生长激 素，运样的化合物可用来治疗其中具有生长激素活性的化合物的血浆浓度增加对患者有益 的疾病或病症。
[000引背景 生长激素（GH)是由哺乳动物垂体前叶分泌的多肤激素。取决于物种，GH是一种包含 大约190个氨基酸残基（相当于大约22kDa的分子量）的蛋白。GH结合于细胞表面受 体（GH受体（GHR))，并通过细胞表面受体发出信号。GH在促进生长，维持正常的身体成 分，合成代谢和脂质代谢中起重要作用。它还具有对中间代谢的直接作用，例如降低葡萄 糖摄取，增加脂肪分解，增加氨基酸摄取和蛋白合成。激素也对其它组织包括脂肪组织、 肝、肠、肾、骨骼、结缔组织和肌肉发挥作用。重组hGH(生长激素）是可市售获得的，例 如作为：Geno1:;ropin? (Pfizer)、Nirtropin?和Protropin? (Genentech)、Humatrope? (EliLilly)、Serostim? (Serono)、Norditropin(NovoNordisk)、0mnitrope(Sandoz)、 NutropinD巧ot(GenentechandA化ermes)。另外地，在N-末端具有另外的甲硫氨酸残 基的类似物也作为例如：Somatonorm?(PharmaciaUpjohn/Pfizer)上市。
[0003]GH与細-蛋白家族的其它成员，催乳素（P化）和胎盘生乳素（PU,共享一种共 同的拓扑结构。GH被分类为一种四螺旋的束蛋白，其呈现一种具有两个保守的二硫键的 "上-上-下-下"拓扑结构。特别地，成熟野生型人GH(由SEQIDNO: 1鉴别的hGH)包 含191个氨基酸残基并在53、165、182和189位置含有4个半脫氨酸残基，其通过形成分别 连接C53与C165和C182与C189的两个分子内二硫键，稳定蛋白的S维结构。hGH的结构 已通过X射线结晶学在游离形式（QiantaletL等（1995)ProteinandPeptideLetters 3，333-340)和在与其结合蛋白（人GHR化GHR)的细胞外结构域）的复合物中（deVos,A. M.等（1992)Science255，306-312)经实验确定。运些结构已存入蛋白质数据库（PDB) 且为公众可获得的（PDB检索码分别为IHGU和1HWG)。因此，可W从公布的hGH结构，鉴定 对结合于hG皿的hGH为重要的残基。研究证实，各种突变体具有对生长激素受体的较低的 亲和力（化nnin曲amBC,Proc化tlAcadSciUSA. 1991Apr15;88(8): 3407-11 和 Cunnin曲amBC,WellsJA,Science. 1989 化n2;244(4908): 1081-5)。此外，h細的动 态特性已通过核磁共振（NMOLR)光谱研究化asimovaM.R.等J.Mol.Biol. (2002) 318， 679-695)。成熟人GHR在此由SEQIDNO: 2 (包含由信号肤去除生成的GHR基因编码蛋 白的AA19-638)鉴定。也称为生长激素结合蛋白的细胞外部分构成AA19 - 256。
[0004]hGH已经受广泛的诱变并被修饰W试图产生具有改变的化学或生物学特性的hGH 类似物及其缀合物，包括生长激素的半脫氨酸突变体、蛋白酶稳定的突变体和聚乙二醇化 形式，如在例如US2003/0162949、W0 02/055532 和W02006048777 中描述的。
[0005] 在具有增加功能性的生长激素化合物的探索中，需要具有增加的半寿期的化合 物，W减少所需化合物的量和给予治疗剂的频率。
[0006] 受抗体治疗的巨大成功的启发，使用抗体免疫球蛋白Fc区域作为延长 子（protractor)的深入研究提供了具有增加半寿期的生长激素化合物，如描述于W02012/008779 和W02006/107124、W02005 047334/35/36/37 中的化合物，其中Fc区 域经由非肤基聚合物（PEG)共价连接于生长激素，和生长激素融合物，例如如描述于WO 01/03737、W0 200814743、US7404956、W0 04101739 和W02005001025 中的Fc融合物。 US2012/0116056描述人生长激素化GH)的Fc融合蛋白和旨在减少不需要的Fc-介导的副 作用的特定人IgGFc变体的选择。
[0007] 虽然运样的方法适合于增加hGH的半寿期，但增加生长激素化合物的半寿期和稳 定性的愿望甚至更加保持高优先级，W便能够提供给患者便利的治疗剂。
概述 本发明的主要方面设及具有延长的半寿期的生长激素化合物，如本文通过与免疫球蛋 白Fc区域的融合物所举例的。所述化合物的特征与人生长激素比较还在于改变的氨基酸 序列，改变一个或多个氨基酸残基。运样突变的不寻常的特征旨在部分地改变与人生长激 素比较的功能。
[0011] 运样的生长激素变体在延长的生长激素化合物的情况下提供甚至进一步延长的 半寿期，同时保留人生长激素的生物学活性。因此，运样的化合物可有助于解决提供治疗的 生长激素化合物的问题，所述化合物可W低频率和W低剂量给予，W提供给患者能够增加 在血液中的生长激素活性的便利的产品。在一个实施方案中，本发明设及包含连接于抗体 Fc-结构域的生长激素变体（GH-变体-Fe)的生长激素化合物。在一个运样的实施方案中， 所述化合物由两个多肤组成，一个是GH-变体-Fe多肤融合物和一个是与GH-变体-Fe多 肤融合物的Fe序列连接的Fe-多肤。在一个实施方案中，生长激素化合物包含在GH变体 的序列中的1-5个点突变，其减少对生长激素受体的亲和力。依据本发明的生长激素化合 物显示出体内延长的半寿期灯1/2)W及诱导延长的IGF-反应的能力。
[0012] 本发明的其它方面设及生产运样的化合物，特别是编码GH-变体-Fe融合多肤的 DNA序列和载体和包含运样的编码GH-变体-Fe融合多肤的载体任选与编码Fe多肤的载体 组合的宿主细胞的方法和工具。
[0013] 附图简述 图1显示4个生长激素变体Fe-融合化合物的药代动力学曲线图。每个生长激素Fe-融 合化合物具有相同的一般结构：hGH-接头-Fe(IgGl)/Fe(IgGl)。生长激素序列中的突变在 每个分子的图例中指明。
[0014] 图2显示，在单剂量静脉内给予Sprague Dawley大鼠后，生长激素变体Fe-融合 化合物的IGF-I血浆浓度-时间曲线图。图2A显示IGF-I的总浓度，而图2B显示基线校 正的IGF-I血浆浓度。生长激素序列的突变在每个分子的图例中指明。
[0015] 图3显示，在单剂量静脉内给予15nmolol后，生长激素变体Fe-融合化合物对垂 体切除的SpragueDawley大鼠体重的影响。生长激素序列的突变在每个分子的图例中指 明。
[001引定义 术语"结合亲和力"在此用作两个分子（例如受体和配体）之间的非共价相互作用的 强度的量度。术语"结合亲和力"被用来描述单价相互作用（固有活性）。
[0017] 术语"核巧酸序列"被用来限定编码多肤的DNA(或RNA序列）。
[0018] 术语"氨基酸"包括由遗传密码编码的氨基酸组，其在此称为标准氨基酸。还包括 的是不由遗传密码编码的天然氨基酸，W及合成氨基酸。
[0019] 本文所用的术语"多肤"和"肤"意指由至少两个通过肤键连接的氨基酸组成的化 合物。
[0020] 本文所用的术语"蛋白"意指由一个或多个多肤组成的指生物化学化合物。
[0021] 术语"药物"、"治疗剂"、"药剂"或"药品"当在此使用时，指用于药用组合物的活 性成分，其可用于疗法中。
[0022] 术语"生长激素变体"在此用来描述生长激素蛋白的类似物，其具有不同于由SEQ IDNO1鉴定的成熟人生长激素的序列的氨基酸序列。
[0023] 术语"Fe-结构域"在此用来描述两个Fe多肤的复合物。
[0024] 术语"复合物"在此用来描述至少两个多肤的结合，运两个多肤并不通过在编码核 巧酸序列的翻译期间建立的肤键连接。所述结合可W是共价的或非共价的。
[0025] 术语"延长的部分"在此用于定义具有延长蛋白的体内半寿期的能力的单位。术语 因此包含熟知的实体，例如Fc-结构域、PEG分子、血清白蛋白、白蛋白粘合剂、生长激素结 合蛋白、AA聚合物（如用于XTEN技术（Amunix,MountainView,CA),和用于PASylation? 狂L-蛋白GMBH,化eising,德国）），和碳水化合物组例如径乙基淀粉和细菌肝素前体 化ep曰ros曰n)。
[0026] 描述 本发明设及包含连接于抗体Fc-结构域的生长激素变体的生长激素化合物，运样的化 合物可W简称为"GH-变体-Fc"。
[0027] 生长激素化合物 成熟人生长激素蛋白包含用3个环（环1-3或L1-3)连接的4个螺旋（螺旋1-4或 化-4)，和C-末端区段。在人生长激素中，螺旋1由AA残基6-35限定，螺旋2由AA残基 71-98限定，螺旋3由AA残基107-127限定和螺旋4定义为AA残基155-184。通过生长激 素受体的相互作用，生长激素介导其生物学活性。
[0028] 如将在本文下面所描述的，依据本发明的生长激素化合物包含生长激素部分和延 长的部分，生长激素部分被认为负责化合物的生物学功能性，而延长的部分至少部分地负 责延长生长激素化合物的半寿期。
[0029] 因此，生长激素化合物通常包括生长激素多肤，例如具有与如通过SEQIDNO1鉴 定的人生长激素的高水平同一性的氨基酸链。如在本文下面所描述的，依据本发明的生长 激素化合物包含如由不同于人生长激素的序列的蛋白序列所限定的生长激素变体。
[0030] 依据本发明的生长激素化合物涵盖生长激素融合物和生长激素缀合物二者。如 从措辞上显而易见的，生长激素融合化合物包括借助于至少一个肤键连接于第二蛋白序列 的生长激素序列，而生长激素缀合物指生长激素部分和延长的部分通过化学修饰的共价连 接。融合蛋白的生成是本领域熟知的且通常经使用重组表达载体表达融合蛋白而获得，所 述载体将编码所述生长激素序列的DNA序列与编码所述第二蛋白的第二DNA序列（任选地 包括接头序列）连接。生长激素融合物包括，但不限于，包含抗体Fc-结构域的融合物。
[0031] 同样地，生长激素部分和延长的部分的缀合可通过本领域已知的方法获得，其中 Fc-结构域共价连接于生长激素变体。连接可W是在N-末端或C-末端氨基酸残基或在生 长激素变体的链中氨基酸残基上。点突变可被引入生长激素W促进延长部分的运样的连 接。
[0032] 在一个实施方案中，本发明设及包含连接于抗体Fc-结构域的生长激素变体的生 长激素化合物，其可通过GH-变体-Fc描述。
[0033] 生长激素变体 依据本发明的生长激素变体具有不同于由SEQIDNO. : 1鉴定的成熟人生长激素序列 的序列。
[0034] 所述差异可通过与天然存在的人生长激素序列比较，添加和/或缺失和/或替代 至少一个氨基酸残基而引起。该术语是用于突变生长激素蛋白的，其中生长激素序列的一 个或多个氨基酸残基已被另一个氨基酸残基替代和/或其中一个或多个氨基酸残基已从 生长激素缺失和/或其中一个或多个氨基酸残基已经添加和/或插入生长激素中。
[0035] 在一个实施方案中，依据本发明的生长激素变体包含相对于人生长激素的少于8 个修饰（替代、缺失和/或添加）。在一个实施方案中，生长激素变体包含相对于人生长激 素的少于7个修饰（替代、缺失和/或添加）。在一个实施方案中，生长激素变体包含相对 于人生长激素的少于6个修饰（替代、缺失和/或添加）。在一个实施方案中，生长激素变 体包含相对于人生长激素的少于5个修饰（替代、缺失和/或添加）。在一个实施方案中， 生长激素变体包含相对于人生长激素的少于4个修饰（替代、缺失和/或添加）。在一个实 施方案中，生长激素变体包含相对于人生长激素的少于3个修饰（替代、缺失和/或添加）。 在一个实施方案中，生长激素变体包含相对于人生长激素的少于2个修饰（替代、缺失和/ 或添加）。在一系列的实施方案中，生长激素的生长激素变体与由SEQIDNO: 1鉴定的人 生长激素有至少95、96、97、98或99 %同源性。
[0036] 在一个实施方案中，生长激素变体包含正好7个氨基酸修饰。在一个实施方案中， 生长激素变体包含正好6个氨基酸修饰。在一个实施方案中，生长激素变体包含正好5个 氨基酸修饰。在一个实施方案中，生长激素变体包含正好4个氨基酸修饰。在一个实施方 案中，生长激素变体包含正好3个氨基酸修饰。在一个实施方案中，生长激素变体包含正好 2个氨基酸修饰。在一个实施方案中，生长激素变体包含正好1个氨基酸修饰。
[0037] 如上所述，生长激素的总体结构是众所周知的和二维和=维结构识别可至少被部 分地分配不同的功能的各个区域。二级结构限定螺旋1-4和插入的环1-3。生长激素受体 结合已被分配至称为位点1和位点2的=维位点，其各自跨多个不连续的氨基酸序列段。如 本文描述的，与包含由SEQIDNO1鉴定的人生长激素的hGH或GH化合物比较，由于在位 点1或位点2的点突变或AA缺失，GH化合物/GH变体优选地具有经由位点1或位点2与 hGHR较低的结合亲和力。
[0038] 在一个实施方案中，生长激素变体在位点1 (螺旋1巧-35)和环1 (36-71)和螺 旋4 (155-184))具有至少一个点突变，例如在螺旋1，在对应于Metl4、Hisl8、His21、Gln22 和化e25的位置。
[0039] 在一个实施方案中，生长激素变体在环1，例如在对应于Lys41、Tyr42、Leu45、 Gln46、Asn47、P;ro48、Gln49、Ser51、Leu52、ProSg、ProGI、Ser62、Asn63、Ar挑 4、Glu65、！'虹 67 和Gln68的位置或例如在对应于Lys41、Leu45、Pro59、Pro61、Arg64和Glu65的位置具有 至少一个点突变。
[0040] 在一个实施方案中，生长激素变体在螺旋4,例如在对应于Tyr164、Argl67、 Lysl68、Aspl71、Lysl72、Glul74、T虹 175、Phel76、A巧 178、Ilel79、Cysl82、切sl89 和 Glyl90的位置或例如在对应于Lysl72、Glul74、T虹175、化6176和Argl78的位置具有至 少一个点突变。
[0041] 在一个实施方案中，生长激素变体在位点2 (N-末端和螺旋1 (1-35)和/或环2/ 螺旋3 (99-127))具有至少一个点突变。
[0042] 在一个实施方案中，生长激素变体在N-末端和螺旋1，例如在对应于化el、Pro2、 1164、？'〇5、1^6116、4'妍、1^6119、431112、41日13、1^61115、4'邑16和4'邑19的位置具有至少一个点 突变。
[0043] 在一个实施方案中，生长激素变体在环2/螺旋3例如在对应于Vall02、Tyrl03、 Asnl09、Aspll6、Leull7、Glull9、Glyl20 和！'虹 123 的位置具有至少一个点突变。
[0044] 在一个实施方案中，生长激素变体在螺旋3 (AA107-127)，例如在对应于Asnl09、 Asplie、Leull7、Glull9、Glyl20和！'虹123的位置具有至少一个点突变。
[0045] 在一个实施方案中，生长激素变体在对应于G120的位置具有点突变。
[0046] 在一个实施方案中，生长激素变体在对应于Lys41、Ar挑4、Lysl72和/或Glyl20 的位置具有至少一个点突变。
[0047] 在一个实施方案中，生长激素变体在对应于Lys41、Ar挑4、Lysl72和/或Glyl20 的位置具有至少两个点突变。
[0048] 在一个实施方案中，生长激素变体在对应于Lys41、Ar挑4、Lysl72和/或Glyl20 的位置具有至少3个点突变。
[0049] 在一个实施方案中，生长激素变体在对应于Lys41、Arg64和/或LyS172的位置具 有至少一个点突变。
[0050] 在一个实施方案中，生长激素变体在对应于Lys41、Arg64和/或LyS172的位置具 有至少两个点突变。
[0051] 在一个实施方案中，生长激素变体具有正好1、2或3个点突变。在一个实施方案 中，生长激素变体在对应于Lys41、Arg64或LyS172的位置具有单一的突变。
[0052] 在一个实施方案中，生长激素变体具有选自K41A、R64A和K172A的1个点突变。 在一个实施方案中，生长激素变体具有选自K41A、R64A和K17