专利名称：用磷酸核酮糖激酶作融合配体的人甲状旁腺素的重组表达载体的制作方法
背景技术：
发明领域本发明涉及用磷酸核酮糖激酶作融合配体的重组表达载体，及用其制备甲状旁腺素的方法，尤其涉及通过将含尿激酶特异性切割位点的人甲状旁腺素基因插入含有球形红色杆菌的磷酸核酮糖激酶基因片段或其突变的基因作为融合配体的L-阿拉伯糖诱导型载体制备的重组表达载体，用所述表达载体转化的重组微生物，及在含L-阿拉伯糖的培养基中培养所述微生物以大规模制备人甲状旁腺素的方法。
现有技术骨质疏松是一种可导致有害影响的疾病，如由于与正常人相比骨质量降低及骨组织薄弱，即使轻微操作也会导致骨折。医学及生物学的发展持续提高人的年龄，其导致越来越多的病人患有骨质疏松。因而当根据核心家庭的趋势单独生活的老年人逐渐增加时骨质疏松成为目前一重大社会问题。
一般地，在正常骨组织中，破骨细胞(一种骨破坏细胞)及成骨细胞(一种形成骨的细胞)活动之间达到平衡，这导致骨组织的不断再造。在正常机体，随着年龄的增长破骨细胞功能超过成骨细胞，这导致骨密度的全面降低。在患骨质疏松的病人，破骨细胞及成骨细胞活动间平衡破坏比正常情况高。
尽管还未十分清楚破骨细胞及成骨细胞活动间平衡破坏的导致原因，但已发现在绝经期后随着雌激素，一种女性激素分泌的减少导致妇女在绝经期后易患I型骨质疏松症。这样，雌激素已被应用于治疗I型骨质疏松，但由于其可导致乳腺癌、子宫内膜癌高发等的明显副作用而难以应用。雌激素也不能用于治疗已知导致原因不同于I型骨质疏松的II型骨质疏松。
抑制破骨细胞对骨组织再吸收作用的除钙素已用作补偿雌激素不足之药剂，及治疗I型骨质疏松及治疗不可由雌激素治愈的II型骨质疏松。但雌激素和降钙素对增加已丢失的骨质量没有作用，只是防止骨密度的进一步降低。因而它们不是骨质疏松的有效治疗剂。
最近由于甲状旁腺素(PTH)可提高骨密度及预防骨密度的降低及未报道有副作用而被注意到作为治疗骨质疏松的良好制剂。含有115个氨基酸的前甲状旁腺素原(前PTH原)在甲状旁腺的主要细胞内产生并在穿经内质网时被加工及转化为含92个氨基酸的甲状旁腺素原(PTH原)。然后在穿经高尔基复合体时PTH原被进一步加工及转化为含84个氨基酸的成熟PTH。经所述步骤合成的PTH被分泌入血液中，并转运至靶器官，即骨及肾。分泌的PTH半衰期只有18分钟。
PTH可激活骨细胞膜内Ca2+泵以促进CaHPO4从骨中转移，导致在几分钟内血中Ca2+水平增高。另外，当PTH持续分泌时，其激活已存在的破骨细胞，刺激新破骨细胞形成，并暂时抑制成骨细胞活性，从而导致抑制Ca2+沉积在骨中并刺激Ca2+释放以增加Ca2+及PO43-分泌入血液。另一方面，PTH的分泌经强反馈机制由血液中Ca2+浓度调节。即在短时间内血液中Ca2+浓度降低10％，PTH分泌加倍。当血液中Ca2+浓度长期较低时，即使血液中Ca2+浓度降低1％，PTH分泌也加倍。
与PTH在活体内如此调节功能不同，已报道当以小剂量间断应用外来PTH时，PTH刺激骨的形成(见Tam，C.S.et al.，Endocrinology，110506～512(1982))。应用PTH治疗骨质疏松是基于所述PTH在骨形成中的刺激功能。尽管还未十分清楚PTH在骨形成中刺激功能的机制，但已有一些假说，如经应用PTH而抑制PTH分泌，成骨细胞的直接刺激及经包括胰岛素样生长因子-I(IGF-1)及转化生长因子-β(TGF-β)的生长因子对骨形成的间接刺激。
为用PTH治疗骨质疏松，长期应用PTH是必需的。但目前为止PTH的大量生产方法还未确立，且PTH治疗骨质疏松的实际应用还存在困难。由于已报道在PTH氨基末端的Ser-Val-Ser氨基酸序列是PTH生物活性所必需的，因而本发明人已研究应用遗传工程技术从重组微生物中大量生产PTH，及在PTH在E.coli中表达期间尝试除去氨基末端甲硫氨酸残基。
甲硫氨酸特异性氨基肽酶，是存在于E.coli中的除去表达蛋白氨基末端的翻译起始甲硫氨酸的酶，E.coli被广泛用作重组蛋白表达的宿主细胞。但当外来蛋白质在E.coli中大量表达时，氨基末端甲硫氨酸的除去偶尔不能完成。如此现象在构建一其氨基末端氨基酸序列影响其自身生理活性的蛋白质，如PTH的表达系统中必须解决。
为解决所述问题，可使用以下所述三种方法首先，以在氨基末端有分泌信号序列的融合形式表达所需蛋白，将所需蛋白以氨基末端加工形式分泌入E.coli的周质或培养基中，所述方法的优点是经细胞内活性获得成熟蛋白质，而不足之处是表达率相对低。其次，在所需蛋白质以氨基末端甲硫氨酸附着形式在E.coli中表达及分离自E.coli之后，将其用氨基肽酶消化以获得成熟蛋白质。此所述方法不足之处是由于难以将甲硫氨酸附着蛋白质与氨基末端甲硫氨酸被除去的蛋白质分开，因而蛋白质的纯化很复杂。再者，所需蛋白质与其它蛋白质融合的融合蛋白质在E.coli中表达并分离后，将融合配体应用酶或化学制剂从融合蛋白中除去以获得成熟的所需蛋白。此所述方法优点是高效表达所需蛋白质及产生氨基末端无甲硫氨酸的蛋白质。
另一方面，从融合蛋白中获得所需蛋白质的方法大致分为用化合物及酶切割法。其中，用化合物切割法优点是由于使用廉价化合物而花费较低。但其不足之处是需要从副产物中纯化所需蛋白质的附加步骤，这是由于使用对切割位点低特异性的化合物产生各种副产物和所需蛋白质。相反地，应用化合物切割法的问题可经应用对切割位点高特异性的酶而解决。但由于酶的价格较高，因而应用酶切割法在工业范围实际应用还有难处。
对此本领域已进行经济应用酶切割融合蛋白的研究。但用于所述目的的酶如因子Xa，凝血酶、肠激酶的大量生产还相当受限。据此不论其各种优点，应用酶切割法还未广泛用于工业范围。由此有充分理由寻求能大量经济生产有效用于应用酶的切割法的第三种酶。由于尿激酶(双链尿激酶型纤溶酶原激活物)的大量生产已充分开发，其是一种用作溶栓剂的丝氨酸蛋白酶，应用原核生物如E.coli表达系统可以大量制备活性尿激酶(见W.E.Holmes et al.，Bio/Technology，3923-929(1985))，与其它酶如因子Xa等相比，可经济地生产并大量获得尿激酶。自然地，尿激酶已被认为用作经济地切割融合蛋白并分离所需蛋白的潜在候选物。
既然这样，本发明人已测定蛋白质内的尿激酶特异切割位点的氨基酸序列，并揭示融合蛋白中所需蛋白及融合配体之间存在氨基酸序列-X-Gly-Arg(其中X代表Pro，Thr，Ile，Phe或Leu)即尿激酶特异性切割位点时切割效率较高。他们还揭示了序列中存在-Thr-Gly-Arg可获得最高切割效率(见韩国专利公开出版物No.97-6495)。
发明概要本发明尝试从重组E.coli中大量制备氨基末端无甲硫氨酸的PTH，并揭示经以下方法可大规模制备具有天然人PTH活性的重组PTH将含尿激酶特异性切割位点，并使用E.coli的通用密码的人PTH基因插入含球形红色杆菌的磷酸核酮糖激酶(“PRK”)基因片段或其突变的基因作为融合配体的L-阿拉伯糖诱导型载体以构建表达载体，用所述表达载体转化E.coli，从所述转化细胞中分离融合蛋白，并用尿激酶切割融合蛋白。
因而本发明一主要目的是提供一种重组表达载体，其经将含尿激酶特异性切割位点的人PTH基因插入含PRK基因片段或其突变基因的L-阿拉伯糖诱导型载体中而制备。
本发明另一目的是提供用所述表达载体转化的重组微生物。
本发明再一目的是提供在含L-阿拉伯糖培养基中经大规模培养所述微生物制备人PTH的方法。
附图描述本发明的上述及其它目的及特征结合以下附图将显而易见。其中
图1示出ΔpMA表达载体的基因图。
图2示出用于制备人PTH基因的寡聚体的核苷酸序列(SEQ IDNo1；SEQ ID No2；SEQ ID No3；SEQ ID No4；SEQ ID No5；SEQ ID No6；SEQ ID No7；SEQ ID No8；SEQ ID No9；SEQ ID No10；SEQ ID No11；SEQ ID No12；SEQ ID No13；SEQ ID No14)。
图3是合成的寡聚体连接的图式。
图4示出pRK表达载体的基因图。
图5示出经PCR扩增本发明PRK基因片段的策略。
图6示出表达人生长激素(hGH)融合蛋白的p153hGH表达载体的基因图。
图7示出表达PTH的融合蛋白的pAI5UP表达载体的基因图。
图8示出制备表达重组人PTH的p153PTH表达载体的构建策略。
图9是示出在L-阿拉伯糖诱导期间用p153PTH转化的E.coli中与PRK片段融合的人PTH蛋白的表达的电泳图式照片。
图10是分离用p153PTH转化的E.coli表达的融合蛋白期间获得的样品SDS-PAGE图的照片。
图11是在尿激酶消化后153PTH融合蛋白的包涵体的SDS-PAGE图的照片。
图12示出经修饰p153PTH制备本发明的人PTH的pm153PTH表达载体的构建策略。
图13是在L-阿拉伯糖诱导期间融合蛋白在用pm153PTH转化的E.coli中表达的电泳图的照片。
图14是分离在用pm153PTH转化的E.coli中表达的融合蛋白期间获得的样品的SDS-PAGE图的照片。
图15是尿激酶消化后153PTH及m153PTH融合蛋白包涵体的SDS-PAGE图的照片。
图16是对比尿激酶消化153PTH及m153PTH包涵体的各种试剂效果的电泳图照片。
图17是纯化的人PTH的SDS-PAGE图的照片。
图18(A)是显示纯化的人PTH与其受体结合的曲线。
图18(B)是显示纯化的人PTH刺激细胞内cAMP产生的曲线。
发明详述首先制备人PTH基因，并翻译成天然人PTH氨基酸序列，并使之具有通常在E.coli中利用的密码的核苷酸序列。另外，为易于从融合蛋白中获得所需蛋白，合成尿激酶特异性切割位点并在人PTH基因前插入，以便尿激酶特异性切割位点即-X-Gly-Arg氨基酸序列(其中X代表Pro，Thr，Ile，Phe或Leu)、最优选-Thr-Gly-Arg位于所需蛋白与融合配体之间(见韩国专利公开出版物No.97-6495)。
然后制备含所述尿激酶特异性切割位点-人PTH基因及编码PRK氨基末端153个氨基酸的DNA片段的p153PTH表达载体。接着从所述表达载体中分离PRK基因片段，并修饰部分PRK氨基酸序列并与人PTH基因再融合以制备表达载体pm153PTH。
由于所述表达载体用编码PRK氨基末端153个氨基酸的PRK片段作融合配体，因而许多融合蛋白(与PRK片段融合的人PTH)在用所述表达载体转化的微生物中表达。在此方面，用pm153PTH转化的E.coli与用p153PTH转化的E.coli相比，表达同量或略多量的融合蛋白，这提示氨基酸取代不影响融合蛋白的表达。另一方面，应用含所述尿激酶特异性切割位点-人PTH基因及全PRK基因的表达载体也使融合蛋白表达。
另外，分别切割由部分修饰的PRK片段及人PTH组成的融合蛋白，及由天然PRK片段及具有尿激酶的人PTH组成的融合蛋白，发现由部分修饰的PRK片段及人PTH组成的融合蛋白，在使用相同数量融合蛋白，在相同切割反应条件下能降低尿激酶非特异性反应，从而可获得更多PTH。
用PRK融合的人PTH在转化体中以包涵体形式表达。在分离包涵体并用尿激酶处理后，从PRK/PTH融合蛋白中纯化分离重组人PTH。
另一方面，已报道PTH在生物体中具有经促进从肾及矿化骨中重吸收钙并提高血钙浓度而调节钙沉积的作用，且所述作用由cAMP(环状AMP)介导，cAMP是一种细胞内二级信号分子，通过PTH与在骨细胞或肾细胞表面的高特异性受体结合而从ATP形成，其导致与受体相关的腺苷酸环化酶激活(见Donahue，H.J.et al.，Endocrinology，1261471-1477(1990))。基于所述知识，本发明人检测了PTH对骨细胞或肾细胞中受体的结合亲和性，及刺激细胞内cAmp形成的水平以研究上述纯化的重组人PTH是否具有天然PTH活性。结果发现上述制备的重组人PTH可与受体结合并刺激细胞内cAMP的产生。
由此，通过培养用本发明的p153PTH或pm153PTH重组表达载体转化的微生物及经L-阿拉伯糖诱导融合蛋白的表达对诱导进行精确调节，可高效制备具有天然人PTH活性的重组人PTH。
本发明经以下实施例进一步例证，该实施例并不限制本发明范围。
实施例1ΔpMA表达载体的构建从鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株中分离DNA，用EcoRI限制性酶消化，并插入pUC19载体中以制备pUC-沙门氏菌文库。将此pUC-沙门氏菌文库导入E.coli DH5α菌株(E.coli DH5αF′endA1 hsdR17(rk-mk+)supE44 thi-1 recA1 gyrA(Nair)U169D(lac ZAY-arg F)deoR)中以获得转化的E.coli菌落。另一方面，合成二种互补于含阿拉伯糖操纵子中araB-c调节位点及氨基末端arac蛋白的3个氨基酸的核苷酸序列的的寡核苷酸，即15mer 5’-GCCATCGTCTTACTC-3’(SEQ ID NO15)及14mer 5’GCGTTTCAGCCATG-3’(SEQ ID NO16)。应用此寡核苷酸作探针进行菌落杂交以从上述制备的pUC-沙门氏菌文库中筛选含araB-A及arac基因的克隆。
将由此选择的pUC-ara质粒用AvaI限制性酶消化，经Klenow酶平端化，并用SalI限制性酶处理以提供2.52kbp的DNA片段。另外，用HindIII消化pUC119载体(见Maniatis et al.，Molecular Cloningznd ed.1989)，经Klenow酶平端化并用SalI处理以提供3.18kbp的DNA片段。将由此获得的两片段，即2.52kbp的DNA片段及3.18kpb的DNA片段用T4DNA连接酶连接以制备5.7kbp的pUC-araBC载体。在从由此获得的载体中获得单链的DNA后，将NdeI限制位点的核苷酸序列，5’-CATATG-3’(SEQ ID NO17)插入位于araB启动子下游的araB蛋白结构基因中的翻译起始密码子中，并进行位点特异性突变以将araB启动子中Shine-Dalgano核苷酸序列转化为5’-TAAGGAGG-3’(SEQ ID NO18)序列。
将由此获得的ara克隆用EcoRI及PvuII消化，再一次提供含araB-C基因的2.61kbp的DNA片段。另外将含源自pUC18的228kbp的多重克隆位点的MpKL10载体用NdeI消化，经Klenow酶平端化并再经T4DNA连接酶连接以除去所述载体中NdeI限制位点。将由此获得的载体用EcoRI及PvuII消化以获得2.7kbp含多重克隆位点，转录终止信号，氨苄青霉素抗性基因及E.coli的DNA复制起点的DNA片段。
将上述制备的2.61kbp DNA片段与上述制备的2.7kbp DNA片段连接，用NdeI及EcoRI消化，并与含NcoI限制位点并在两末端分别具有NdeI及EcoRI限制位点的双链寡核苷酸连接，经T4 DNA连接酶构建大约5.32kbp的ΔpMA载体(见韩国专利公开出版物No.97-5585)。图1示出由此构建的ΔpMA基因图。
实施例2制备人PTH基因为制备编码天然人PTH并具有经常在E-coli中利用的密码子的核苷酸序列的人PTH基因，首先合成相应于PTH有义及反义链的12个寡核苷酸(SEQ ID NO1；SEQ ID NO2；SEQ ID NO3；SEQID NO4；SEQ ID NO5；SEQ ID NO6；SEQ ID NO7；SEQ IDNO8；SEQ ID NO9；SEQ ID NO10；SEQ ID NO11；SEQ IDNO12；SEQ ID NO13；SEQ ID NO14)。(见图2)。将此12个寡聚物应用磷酸化，退火、洗脱及T4DNA连接酶选择性连接。即为防止自身连接，将#2，#4，#5，#8，#9，#12及，#13寡聚体的末端磷酸化，并进行DNA退火以产生#1#2，#3#4，#5#6，#7#8，#9#10，#11#12，及#13#14对。然后在聚丙烯酰胺凝胶电泳之后，只有正确退火的双链寡聚体即I，II，III，IV，V，VI及VII被洗脱。双链寡聚体VII的3’末端具有XbaI限制位点的粘端，其使得易于用表达载体的XbaI位点进行克隆。
将由此洗脱的双链寡聚体的末端磷酸化，并用T4DNA连接酶分别连接II和III，IV和V，VI和VII。在聚丙烯酰胺凝胶电泳后，正确连接的II/III，IV/V及VI/VII DNA片段被洗脱。然后将II/III，IV/V及VI/VII的三片段末端磷酸化，并用T4 DNA连接酶分别连接I和II/III，IV/V和VI/VII。然后，最后将I/II/III与IV/V/VI/VII连接以合成含尿激酶特异性切割位点及具有经常在E.coli中利用的密码子的核苷酸序列的人PTH基因(见图3)。在图3中，括号内数字代表碱基数。双链寡聚体1含有尿激酶特异性切割位点，其合成在以下进一步例证。
为易于从融合蛋白中分离PTH，如下合成尿激酶特异性切割位点，并插入融合配体及PTH基因之间。此尿激酶特异性切割位点含有Gly-Thr-Gly-Arg(见韩国专利公开出版物No.97-6495)，并在所述序列前加入一个相对低分子量的氨基酸以提供柔性。同样，5’末端含SmaI，ScaI及PvuII 3个限制位点以提供平端，如此考虑其开放读框一些靶基因可以容易地被融合。一个BglII限制位点位于连接人PTH基因和尿激酶特异性切割位点的位点。合成符合所述条件的有义寡聚体#1及反义寡聚体#2并连接。在聚丙烯酰胺凝胶电泳之后，正确退火的双链寡聚体1被洗脱。由于双链寡聚体1的两端是平端，只有寡聚体#2在退火前磷酸化以防止寡聚体I的二聚体及三聚体形成。将双链寡聚体经上述T4 DNA连接酶连接以位于合成人PTH基因之前。
实施例3构建含PRK基因的pPRK表达载体从球形红色杆菌菌株中分离染色体DNA，并进行PCR扩增PRK基因。在此方面，为易于将PRK基因亚克隆入实施例1制备的L-阿拉伯糖可诱导表达载体(ΔpMA)中，将翻译起始密码子及NdeI限制位点导入用作5’引物的相应于PRK氨基末端区的引物中，并将翻译终止密码子及XbaI限制位点导入用作3’引物的相应于PRK羧基末端区的引物中(5’引物5’-GGAGCTGAATACATATGAGCAAG-3’(SEQ IDNO19)；3’引物5’-CCCCCGGGTCTAGATCAGGCCA-3’(SEQ ID NO20))。
将PCR反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，分离873bp的PRK基因并用NdeI及XbaI消化并亚克隆入用NdeI及XbaI处理的ΔpMA载体片段以构建pPRK表达载体(见图4)。用由此构建的表达载体转化E.coli MC1061(E.coli MC1061，F-araD139Δ(ara-leu)7696gal E15 gal K16Δ(lac)X74rpsL(Strr)hsdR2(rk-mk+)mcrA mcrB1)，并确认具有32Kda分子量的PRK蛋白从转化子中表达。
实施例4PRK基因片段化由于用全PRK基因作融合配体的缺点是大融合配体产生最终所需蛋白较低，因此将PRK大小降低以降低融合配体的大小从而高产所需蛋白。由于尚未发现PRK结构，应用基于Chou及Fasman的方法(见Adv Enzymol.，4745-148(1978)；Annu Rev Biochem.，47251-276(1978))的计算机程序(PROSIS，Hitachi JAPAN)推断了PRK蛋白的二级结构。然后选择不破坏蛋白质结构稳定性的经推断不形成如α-螺旋或β-链的二级结构的两区域(含PRK氨基末端113和153氨基酸的区域，分别指作“113PRK”及“153PRK”)。
为扩增PRK基因片段，将实施例3中5’引物用作5’引物，将相应于分别含113及153个氨基酸的核苷酸序列，并含易于亚克隆的BamHI限制位点的寡核苷酸用作3’引物(为扩增113PRK的3’引物5’-GGTGAAGGATCCGGGCGCCACGCCGGT-3’(SEQ IDNO21)；扩增153PRK的5’引物5’-CGGAACGGATCCGATCTTGAGGTCGGC-3’(SEQ ID NO22)(见图5)。
将由此扩增的PRK基因片段用NdeI及BamHI消化，并经进行1％琼脂糖凝胶电泳分离。
将由此分离的113PRK及153PRK(基因片段)的PCR产物用NdeI及BamHI消化，并插入用相同酶消化的ΔpMA中以构建p113PRK及p153PRK。分别用所述表达载体即p113PRK及p153PRK转化E.coliMC1061(E.coli MC 1061，F-ara D139Δ(ara-leu)7696 gal E15 glaK16Δ(lac)X74 rpsL(Strr)hsd R2(rk-mk+)mcrA mcrB1)并培养。结果发现113PRK及153PRK蛋白大量正常表达。因此确定编码113PRK及153PRK蛋白质的基因片段可适当用作融合配体。
实施例5表达载体p153PTH的构建及PTH的表达将含尿激酶特异性限制位点及作为融合配体的编码在E.coli中抑制复制开始的IciA蛋白质氨基末端166个氨基酸的DNA片段(见韩国专利公开出版物No.97-6505)的hGH的pAI5UG表达载体用NdeI及BamHI消化，以获得含hGH基因及Thr-Gly-Arg尿激酶(UK)限制位点的载体片段。将实施例4中分离的153PRK基因片段亚克隆入如此获得的载体中以构建表达载体p153hGH(见图6)。
另外，用SmaI及XbaI消化ΔpMA5S获得含500bp IciA基因片段的载体片段，在ΔpMA5S中SmaI限制位点被插入编码在E.coli中抑制复制起始的IciA蛋白的IciA基因氨基末端第166氨基酸密码子位点(见韩国专利公开出版物No.97-6505，KCCM-10072)。将实施例2中合成的含尿激酶特异性切割位点的人PTH基因亚克隆入由此获得的载体片段中，以构建在araB启动子系统控制下可以融合形式表达具有含氨基末端166个氨基酸的IciA蛋白质片段的人PTH(见图7，韩国专利公开出版物No.97-6497。KCCM-10071)。
用BamHI及HindIII消化由此构建的pAI5UP载体，以提供含尿激酶特异性切割位点的人PTH基因片段。将由此获得的片段亚克隆入经用BamHI及HindIII消化p153hGH而制备的载体片段中，以构建在araB启动子系统控制下将能表达含尿激酶特异性切割位点及作为融合配体的153PRK(由PRK氨基末端153个氨基酸组成)的人PTH融合蛋白的p153PTH载体(见图8)。
用由此构建的p153PTH表达载体转化E.coli MC1061(F-araD139Δ(ara-leu)7696 galE15 galK16 D(lac)X74 rpsl(Strr)hsdR2(rk-mk+)mcrA mcrB1)，并将所得转化体接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中(每L培养基含5g NaCl，5g酵母提取物，10g细菌培养用胰化蛋白胨及50mg氨苄青霉素)温育，并在37℃以180rpm培养1天。在含氨苄青霉素的新鲜LB液体培养基中将铺满培养基再接种以至终浓度为1％，并摇合培养直至在600nm吸收达到0.5。然后将L-阿拉伯糖加入培养基至终浓度为1％以诱导153PRK/PTH(后文指作“153PTH”)融合蛋白的表达，并摇合培养细胞大约20小时。
培养的E.coli细胞总蛋白的SDS-PAGE分析结果发现。在L-阿拉伯糖诱导期间，大约26kDa的153PTH融合蛋白在E.coli中高效表达(见图9)。在图9中，1道和2道示出经1％L-阿拉伯糖诱导后培养20小时的p153PTH转化的E.coliMC1061的总蛋白；M道示出标准蛋白标记(BRL 16040-016，USA)。
将用p153PTH表达载体转化的Escherichia coli MC1061标示为Escherichia coli MC 1061p153PTH，并于1997年7月9日保藏于韩国微生物保藏中心(KCCM)，位于134 Shinchon-Dong.Seodaemun-Ku，Seoul，Korea的国际保藏机构，登记号为No.KCCM-10101。
实施例6153PTH融合蛋白包涵体的分离及消化研究如实施例5中在L-阿拉伯糖诱导期间用p153PTH转化的E.coli(KCCM-10101)中表达的153PTH融合蛋白是否可形成包涵体。将离心后获得的培养的E.coli细胞悬浮于Tris缓冲液(含0.1mMEDTA及25％蔗糖的50mM Tris缓冲液(PH7.8))中。向细胞悬浮液中加入溶菌酶并在冰上温育1.5小时。然后向细胞中加入MgCl2和DNaseI并温育1.5小时。接着向细胞中加入含1％脱氧胆酸及1.6％Nonidet P-40的缓冲液，并在冰上搅拌15分钟。经超声处理将细胞裂解。将细胞裂解物离心以从水溶液组分中分离包涵体组分，并用0.5％Triton X-100溶液将包涵体组分冲洗4次。将由此获得的包涵体组分在8M尿素溶液中在4℃缓慢搅动以变性。在包涵体分离期间取样的等份样品进行SDS-PAGE分析(见图10)。
在图10中，2，3，4至7道分别示出细胞裂解物，细胞裂解物上清，包涵体的冲洗液及变性的包涵体；1道示出BRL16040-016的43kD，29kD，18.4kD，14.3kD，6.2kD及3.4kD分子量的标准蛋白大小标记；9道示出NEB 7707L的175kD，83kD，62kD，47.5kD，32.5kD，25kD，16.5kD及6.5kD分子量的标准蛋白标记。如图10所示，揭示153PTH融合蛋白在E.coli中大量表达且能以包涵体方式被分离。
在进行分离的153PTH融合蛋白定量后，将0.5μg尿激酶加入100μg 153PTH融合蛋白中并在25℃反应1小时。然后，经SDS-PAGE研究切割水平(见图11)。在图11中，1道示出未加尿激酶的153PTH融合蛋白作对照；2道示出加入尿激酶的153PTH融合蛋白；M道示出标准蛋白大小标记(NEB 7707L，175kD，83kD，62kD，47.5kD，32.5kD，25kD，16.5kD，6.5kD分子量)。当153PTH融合蛋白被尿激酶切割时，应产生分子量相当于153个氨基酸的融合配体及分子量相当于84个氨基酸的所需PTH蛋白。如图11所示，发现大约10kD的PTH蛋白如期呈现。但期望的大约17kD的153PRK蛋白片段即融合配体几乎未呈现。而各种较小大小的蛋白片段呈现。因而提示在153PRK的12个精氨酸残基中发生一些尿激酶的非特异性切割。
实施例7表达载体pm153PTH的构建及表达为降低尿激酶对153PRK的附加切割，位于附加切割可能位点的精氨酸残基被除去。考虑在经尿激酶切割153PTH期间产生的蛋白质片段的大小，预计附加切割可发生在PRK氨基末端的第30，31，58，59，94及96位精氨酸残基。因此本发明人尝试用其它氨基酸取代那些精氨酸残基。
即，在用ScaII及HindIII消化表达载体p153PTH之后将分离的153PTH基因片段插入用SacII及HindIII消化pBlueScript SK(+)(Stratagene，USA)制备的载体片段中，以提供用于突变的质粒，pSK(+)153PTH，由此获得单链DNA(见图12)。用pSK(+)153PTH转化E.coli CJ236，并根据Kunkel等之方法(见Kunkel T.A.Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，82488-492(1985))进行位点特异性突变。在此方面，所用变构物如下30/31变构物5’-CCTTGACCCCCTCGC(C/G)CACGAAGATCTGGTCGAAC-3’(SEQ ID NO23)；58/59变构物5’-GCCCGCCGCATAGC(G/C)CACGTCCAGCTCGGCCTTC-3’(SEQ ID NO24)；94/96变构物
5’-GACGTAGGTCC(C/G)CGTCACCCCCTGCCCGGTCTCGCC-3’(SEQ ID NO25)。
应用变构物制备第30，58及94位精氨酸被缬氨酸取代，第59及96位精氨酸被甘氨酸取代的突变载体并称作pSK(+)m153PTH。经T4连接酶连接用NdeI/BamHI消化pSK(+)m153PTH而得的突变153PRK片段及含经用NdeI/BamHI消化表达载体p153PTH制备的尿激酶/PTH的载体片段，以构建表达载体pm153PTH(见图12)。
用pm153PTH表达载体转化E.coli MC1061(F-ara D139Δ(ara-leu)7696 galE15 galK16 D(lac)X74 rpsL(Strr)hsdR2(rk-mk+)mcrA mcrB1)，并以实施例5相同方式培养。SDS-PAGE分析揭示m153PRK/PTH(后文称为m153PTH)融合蛋白被表达。在图13中，1道示出用1％阿拉伯糖诱导后培养20小时的表达载体p153PTH转化的E.coli MC1061的总蛋白；2道示出用1％阿拉伯糖诱导后培养20小时的表达载体pm153PTH转化的E.coli MC1061的总蛋白；3道示出在1％阿拉伯糖诱导前用表达载体pm153PTH转化的E.coli MC1061的总蛋白；M道示出标准蛋白质大小标记(NEB 7707L，83kD，62kD，47.5kD，32.5kD，25kD，16.5kD及6.5kD分子量)。如图13所示，发现用pm153PTH转化的E.coli与用p153PTH转化的E.coli相比以同量或略高量表达融合蛋白，示出氨基酸取代不降低表达。
将用pm153PTH表达载体转化的Escherichia coli MC1061标示为Escherichia coli MC 1061pm 153PTH，并于1997年7月9日保藏在韩国微生物保藏中心(KCCM)，位于134 Shinchon-Dong，Seodaemun-Ku，Seoul，Korea的国际保藏机构，登记号No.KCCM-10102。
实施例8m153PTH融合蛋白包涵体的分离与消化为研究m153PTH融合蛋白怎样在E.coli中表达，将在包涵体分离期间取样的等份样品如实施例6相同方式经SDS-PAGE分析(见图14)。在图14中，2，3，4至7和8道分别示出细胞裂解物，细胞裂解物上清，包涵体的冲洗液及变性的包涵体；1道示出BRL 16040-016的分子量为43kD，29kD，18.4kD，14.3kD，6.2kD及3.4kD的标准蛋白大小标记；9道示出NEB 7707L的分子量为175kD，83kD，62kD，47.5kD，32.5kD，25kD，16.5kD及6.5kD的标准蛋白质大小标记。如图14所揭示，如同m153融合蛋白一样，m153PTH融合蛋白在细胞中形成包涵体。
在如实施例6相同方式进行分离的融合蛋白定量后，将0.5μg尿激酶加入100μg 153PTH或m153PTH融合蛋白中并在25℃反应1小时。然后经SDS-PAGE研究切割水平(见图15)。在图15中，奇数泳道示出作对照的未加尿激酶的融合蛋白，偶数泳道示出加入尿激酶的融合蛋白；1道及2道示出153PTH融合蛋白；3道和4道示出m153PTH融合蛋白；M道示出标准蛋白质大小标记(NEB7707L，分子量为175kD，83kD，62kD，47.5kD，32.5kD，25kD，16.5kD及6.5kD)。如图15所示，发现与153PTH融合蛋白相比在m153PTH融合蛋白的切割中尿激酶的非特异性切割降低。由此在相同反应条件及使用同量融合蛋白下，从m153PTH融合蛋白比从153PTH融合蛋白中可获得更多PTH。
另外，为根据切割时间比较153PTH与m153PTH融合蛋白经尿激酶的切割效率，将融合蛋白与尿激酶以200∶1浓度比混合并在25℃反应以切割。然后根据时间收集等分并经SDS-PAGE分析(见图16)。在图16中，1～7道示出用尿激酶分别消化20，30，60，150，190，225及360分钟的样品。
如图16所揭示在反应60分钟后，m153PTH融合蛋白几乎完全切割，而153PTH即使在反应6小时后也未切割。
从所述切割对比试验中发现与153PTH融合蛋白相比，m153PTH融合蛋白示出每单位时间及每单位所用尿激酶获得的PTH的增多的产量。
实施例9重组人PTH的纯化对如实施例8相同方式分离的包涵体中m153PTH融合蛋白进行定量，并用Tris缓冲液稀释至蛋白质浓度为1mg/ml。将尿激酶(蛋白酶)加入溶液中并在25℃反应以从融合蛋白中分离PTH。用离子交换树脂及C18反向HPLC层析纯化分离的PTH蛋白，并经SDS-PAGE分析(4-20％梯度凝胶)，见图17。在图17中，1～3道分别示出15，7.5及3.75μg的纯化的PTH；M道示出标准蛋白分子量标记(Novex LC 5677，200kD，116.3kD，97.4kD，66.3kD，55.4kD，36.5kD，31kD，21.5kD，14.4kD，6kD及3.5kD)。如图17所揭示，以分离的形式纯化出人重组PTH。
实施例10人重组PTH活性的检测UMR106细胞系(大鼠成骨细胞类骨肉瘤细胞)已广泛用于对成骨细胞特征的研究，并已知该细胞系示出碱性磷酸酶的高活性，即成骨细胞特征之一，并产生I型胶原(见Meika A.Fang et al.，Endocrinology，131(5)2113-2119(1992)；Cheryl O.Quinn etal.，The Journal of Biological Chemistry，265(36)22342-22347(1990))。因此用UMR106细胞系(ATCC CRL 1661)经与PTH受体的结合试验及细胞内cAMP产生的刺激试验检测实施例9中纯化的人重组PTH(rhPTH(1-84))的体内活性。在此方面，合成的人PTH(sh PTH(1-84)，Sigma Chemical Co.，USA)用作对照，并用只检定具有氨基及羧基末端的完整PTH的“auegro Intact PTH RIA试剂盒(Nichols Institute，San Juan Capistrano，USA)”进行PTH的定量(见Samuel R.Nussbaum et al.，Clinical Chemistry，33(8)1364～1367(1987))。另一方面，将UMR 106细胞系在含0.2％碳酸氢钠及10％FBS(胎牛血清，在56℃热处理30分钟)的DMEM中(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)在37℃在5％CO2环境中培养(见Ronald J.Midura et al.，The Journal of Biological Chemistry，269(18)13200～13206(1994))。
实施例10-1与PTH受体的结合试验如下进行与PTH受体的结合试验(见Chohei Shigeno et al.，TheJournal of Biological Chemistry，263(8)3864-3871(1988))，将105UMR106细胞/孔加入24孔平板中并培养4～8天。每2天变换一次培养基，并在试验前3天每天变换一次。另外，为制备用放射性同位素标记的(Nle8，18Tyr34)-牛PTH(1-34)-NH2(bPTH(1-34))(见Gino V.Segre et al.，JBC.254(15)6980-6986(1979))，其在羧基末端酪氨酸残基用放射性同位素125I标记，用氯胺T(SigmaChemical Co.，USA)作催化剂用Na125I碘化bPTH(1-34)。将此碘化产物加样于C18Sep-Pak柱。并用50％CAN(乙腈)/0.1％TFA(三氟乙酸)洗脱此碘化的bPTH以除去游离125I。然后将ACN从分离的bPTH中除去。
应用125I-标记的(Nle8，18Tyr34)-bPTH(1-34)作配体，对比rhPTH(1-84)及shPTH(1-84)对配体与受体结合的竞争性抑制，以确定PTH与其受体的结合亲和性。将配体及所述PTHs用结合缓冲液(含100mM NaCl，5mMKCl，2mMCaCl2，50％马血清及0.5％FBS的50mM Tris缓冲液(PH7.7))分别稀释。另一方面，将经如上培养之后获得的24孔平板在冰上冷却，用1ml结合缓冲液冲洗2次，并加入30000～50000cpm的配体及各种浓度的竞争性PTH以至终体积为0.3ml。将每种激素稀释液平行加入3个孔中，并在15℃吸附4小时。在此反应后，将这些孔用结合缓冲液冲洗4次以除去游离放射性同位素。然后，加入0.5ml 0.5M NaOH，在室温下处理16～18小时以提取与细胞结合的放射性同位素。将在提取后获得的溶液与用0.5ml结合缓冲液冲洗后获得的溶液混合，并应用γ-计数仪计数其放射性。
从以上测定的结合放射性数值中扣除经应用1mM每种竞争性激素测定的非特异性结合的数值，以确定特异性结合。将确定的数值表达作相对最大特异性结合的百分率，并使优化曲线，根据Biosoft Co.的fig.P程序确定IC50，IC50(50％抑制浓度∶50％降低配体结合的激素浓度)是一种重要的对比每种竞争性激素的结合亲和性的指数。shPTH(1-84)及rhPTH(1-84)的IC50值分别为18.6±1.5及17.3±3.1nM(平均值±标准偏差)。此结果之一示于图18(A)。如图18(A)所示，发现重组PTH与合成PTH具有相同的与受体的结合性。
实施例10-2细胞内cAMP产生的刺激实验如下进行细胞内cAMP产生的刺激实验(见Thomas J.Gardella etal.，JBC，265(26)15854～15859(1990))将实施例10-1的在24孔平板内培养4～8天的UMR细胞在冰上冷却15分钟，并用0.25ml cAMP缓冲液(含2mM 3-异丁基-甲基黄嘌呤，1mg/ml BSA及35mM HEPES的DMEM(PH7.4))冲洗。然后，向平板中加入0.1mlcAMP缓冲液，并加入0.1ml含各种浓度每种激素的cAMP缓冲液。接着在37℃反应20分钟，并除去缓冲液。然后分别在-70℃冰冻20分钟及在室温下解冻20分钟重复三次以破坏细胞，并在平板的每个孔中加入1ml 50mM HCl。接着在-20℃处理16-18小时提取细胞内cAMP，并用cAMPRIA试剂盒(New England Nuclear，Du Pont，USA)进行提取物内cAMP定量。使优化曲线并根据Biosoft Co.的fig.P程序确立EC50(刺激细胞内cAMP产量提高50％的激素浓度)。shPTH(1-84)及rhPTH(1-84)的EC50值分别为1.9±0.1及1.3±0.2mM(平均值±标准偏差)。此结果之一示于图18(B)，如图18(B)所示，发现重组PTH与合成PTH具有相同刺激腺苷酸环化酶能力。
如以上所清楚描述的，本发明提供了一种重组表达载体，其通过将含尿激酶特异性切割位点的人PTH基因插入含PRK基因片段的L-阿拉伯糖诱导型载体中而制备，本发明还提供了用所述表达载体或其突变基因作融合配体翻译的重组微生物，及提供一种在含L-阿拉伯糖的培养基中培养所述微生物以大规模制备人PTH基因的方法。根据本发明，应用一种生产方法经过诱导的精确控制可高产量制备具有天然人PTH相同活性的重组人PTH，此生产方法包括融合蛋白在用重组表达载体转化的微生物中经L-阿拉伯糖的诱导表达。
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)名称财团法人牧岩生命工学研究所(B)街道341，Pojung-Ri，Koosung-Myun(C)城市Yongin-Kun，Kyonggi-Do(D)州(E)国家韩国(F)ZIP449-910(G)电话02-741-0611(H)传真0331-262-6622(ii)发明名称用磷酸核酮糖激酶作融合配体的人甲状旁腺素的重组表达载体(iii)序列数25(v)计算机可读形式(A)媒介类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0，Version #1.30(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度34碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(vi)原始来源
(A)生物体人(vii)最近来源(B)克隆(xi)序列描述GGGGAGTACT GCAGCTGGAT CCGGTACTGG TAGA 34(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度34碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(vi)原始来源(A)生物体人(vii)最近来源(B)克隆(xi)序列描述TCTACCAGTA CCGGATCCAG CTGCAGTACT CCCC 34(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度41碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA
(vi)原始来源(A)生物体人(vii)最近来源(B)克隆(xi)序列描述TCTGTTTCGG AAATCCAGCT TATGCATAAC CTGGGTAAAC A 41(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度51碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(vi)原始来源(A)生物体人(vii)最近来源(B)克隆(xi)序列描述CGAGTTCAGA TGTTTACCCA GGTTATGCAT AAGCTGGATT TCCGAAACAG A 51(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度45碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA
(vi)原始来源(A)生物体人(vii)最近来源(B)克隆(xi)序列描述TCTGAACTCG ATGGAACGTG TTGAATGGCT GCGTAAAAAA CTGCA 45(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度31碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(vi)原始来源(A)生物体人(vii)最近来源(B)克隆(xi)序列描述GTTTTTTACG CAGCCATTCA ACACGTTCCA T 31(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度49碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA
(vi)原始来源(A)生物体人(vii)最近来源(B)克隆(xi)序列描述GGATGTTCAT AACTTCGTTG CGCTGGGGGC TCCACTGGC 39(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度52碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(vi)原始来源(A)生物体人(vii)最近来源(B)克隆(xi)序列描述TCGCGCGGCG CCAGTGGAGC CCCCAGCGCA ACGAAGTTAT GAACATCCTG CA52(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度46碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA
(vi)原始来源(A)生物体人(vii)最近来源(B)克隆(xi)序列描述GCCGCGCGAA GGCGGGTTCG CAGCGCCCAC GTAAAAAGGA AGATAA 46(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度46碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(vi)原始来源(A)生物体人(vii)最近来源(B)克隆(xi)序列描述TACCAGAACG TTATCTTCCT TTTTACGTGG GCGCTGCTAA CCCGCA 46(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度45碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA
(vi)原始来源(A)生物体人(vii)最近来源(B)克隆(xi)序列描述CGTTCTGGTA GAGTCGCATG AAAAGTCTCT TGGCGAGGCT GATAA 45(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度45碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(vi)原始来源(A)生物体人(vii)最近来源(B)克隆(xi)序列描述TACGTCTGCT TTATCAGCCT CGCCAAGAGA CTTTTCATGC GACTC 45(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度44碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性
(ii)分子类型DNA(vi)原始来源(A)生物体人(vii)最近来源(B)克隆(xi)序列描述AGCAGACGTA AACGTTTTGA CTAAAGCAAA ATCTCAATAA TGAT44(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)长度38碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(vi)原始来源(A)生物体人(vii)最近来源(B)克隆(xi)序列描述CTAGATCATT ATTGAGATTT TGCTTTAGTC AAAACGTT 38(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)长度15碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性
(ii)分子类型DNA(vi)原始来源(A)生物体鼠伤寒沙门氏菌(vii)最近来源(B)克隆探针(xi)序列描述GCCATCGTCT TACTC 15(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)长度14碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(vi)原始来源(A)生物体鼠伤寒沙门氏菌(vii)最近来源(B)克隆探针(xi)序列描述GCGTTTCAGC CATG 14(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)长度6碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性
(ii)分子类型DNA(vi)原始来源(A)生物体(vii)最近来源(B)克隆NdeI限制位点(xi)序列描述CATATG6(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)长度8碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(vi)原始来源(A)生物体(vii)最近来源(B)克隆(xi)序列描述TAAGGAGG 8(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)长度23碱基对(B)类型核酸
(C)链性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(vi)原始来源(A)生物体球形红色杆菌(vii)最近来源(B)克隆5′引物(xi)序列描述GGAGCTGAAT ACATATGAGC AAG 23(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)长度22碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(vi)原始来源(A)生物体球形红色杆菌(vii)最近来源(B)克隆3′引物(xi)序列描述CCCCCGGGTC TAGATCAGGC CA22(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征
(A)长度27碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(vi)原始来源(A)生物体球形红色杆菌(vii)最近来源(B)克隆3′引物(xi)序列描述GGTGAAGGAT CCGGGCGCCA CGCCGGT27(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)长度27碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(vi)原始来源(A)生物体球形红色杆菌(vii)最近来源(B)克隆5′引物(xi)序列描述CGGAACGGAT CCGATCTTGA GGTCGGC27(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)长度35碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(vi)原始来源(A)生物体球形红色杆菌(vii)最近来源(B)克隆变构物(xi)序列描述CCTTGACCCC CTCGC(C/G)CACG AAGATCTGGT CGAAC 35(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)长度34碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(vi)原始来源(A)生物体球形红色杆菌(vii)最近来源(B)克隆变构物(xi)序列描述GCCCGCCGCA TAGC(G/C)CACGT CCAGCTCGGC CTTC 34(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)长度36碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(vi)原始来源(A)生物体球形红色杆菌(vii)最近来源(B)克隆变构物(xi)序列描述GACGTAGGTC C(C/G)CGTCACCC CCTGCCCGGT CTCGCC3权利要求
1.一种重组表达载体，其通过将含尿激酶特异性切割位点的人甲状旁腺素基因插入含有作为融合配体的球形红色杆菌的磷酸核酮糖激酶基因片段或其突变基因的L-阿拉伯糖诱导型载体中额而制备。
2.权利要求1的重组表达载体，其中含有磷酸核酮糖激酶(PRK)基因的L-阿拉伯糖诱导型载体是pPRK，其基因图示于图4。
3.权利要求1的重组表达载体，其中磷酸核酮糖激酶基因片段是编码磷酸核酮糖激酶氨基末端113～153个氨基酸的DNA片段。
4.权利要求1的重组表达载体，其中尿激酶特异性切割位点是从以下氨基酸序列推导的DNA序列-X-Gly-Arg，其中X是Pro，Thr，Ile，Phe或Leu。
5.权利要求1的重组表达载体，其中尿激酶特异性切割位点是从氨基酸序列-Thr-Gly-Arg推导的DNA序列。
6.权利要求1的重组表达载体，其中人甲状旁腺素基因具有以下DNA序列TCT GTT TCG GAA ATC CAG CTT ATG CAT AAC CTG GGT AAA 39CAT CTG AAC TCG ATG GAA CGT GTT GAA TGG CTG CGT AAA 78AAA CTG CAG GAT GTT CAT AAC TTC GTT GCG CTG GGG GCT 117CCA CTG GCG CCG CGC GAG GCG GGT TCG CAG CGC CCA CGT 156AAA AAG GAA GAT AAC GTT CTG GTA GAG TCG CAT GAA AAG 195TCT CTT GGC GAG GCT GAT AAA GCA GAC GTA GAC GTT TTG 234ACT AAA GCA AAA TCT CAA TAA TGA 258
7.一种重组表达载体p153PTH，其含有编码球形红色杆菌磷酸核酮糖激酶氨基末端153个氨基酸的DNA片段；编码尿激酶特异性切割位点-Thr-Gly-Arg的DNA片段；及人甲状旁腺素基因。
8.一种重组表达载体，其依次含有以下基因编码球形红色杆菌磷酸核酮糖激酶氨基末端153个氨基酸的DNA片段，其中位于第30，31，58，59，94及96位的精氨酸残基经用不同氨基酸取代而部分突变；编码尿激酶特异性切割位点-X-Gly-Arg(其中X是Pro，Thr，Ile，Phe或Leu)的DNA片段；及人甲状旁腺素基因。
9.一种重组表达载体pm153PTH，其依次含有以下基因编码球形红色杆菌磷酸核酮糖激酶氨基末端153个氨基酸的DNA片段，其中位于第30，58及94位的精氨酸残基用缬氨酸取代，第59及96位精氨酸用甘氨酸取代而被位点特异性突变；编码尿激酶特异性切割位点-Thr-Gly-Arg的DNA片段；及人甲状旁腺素基因。
10.用权利要求7的重组表达载体p153PTH转化的大肠杆菌MC1061p153PTH(KCCM-10101)。
11.用权利要求9的重组表达载体pm153PTH转化的大肠杆菌MC1061pm153PTH(KCCM-10102)。
12.一种制备人甲状旁腺素的方法，其包括以下步骤培养大肠杆菌MC1061p153PTH(KCCM-10101)；经L-阿拉伯糖诱导人甲状旁腺素的表达；回收人甲状旁腺素。
13.一种制备人甲状旁腺素的方法，其包括以下步骤培养大肠杆菌MC1061pm153PTH(KCCM-10102)；经L-阿拉伯糖诱导人甲状旁腺素的表达；回收人甲状旁腺素。
14.一种制备人甲状旁腺素的方法，其包括以下步骤培养用权利要求1的重组表达载体转化的重组微生物；经L-阿拉伯糖诱导人甲状旁腺素的表达；用尿激酶处理表达的磷酸核酮糖激酶与人甲状旁腺素的融合蛋白以回收人甲状旁腺素。
全文摘要
本发明涉及一种重组表达载体,其通过将含尿激酶特异性切割位点的人甲状旁腺素基因插入含有球形红色杆菌的磷酸核酮糖激酶基因片段或其突变的基因作为融合配体的L－阿拉伯糖诱导型载体而制备。本发明还用所述表达载体转化的重组微生物,及通过在含L－阿拉伯糖的培养基中培养所述微生物以大规模制备人甲状旁腺素的方法。根据本发明,通过精确控制诱导经一生产方法可以高产量制备具有与天然人PTH相同活性的重组人PTH,所述生产方法包括在用所述重组表达载体转化的微生物中经L－阿拉伯糖诱导融合蛋白的表达的步骤。
文档编号C07K17/00GK1275163SQ98809215
公开日2000年11月29日 申请日期1998年6月5日 优先权日1997年7月25日
发明者郑恩卿, 朴斗鸿, 郑守一 申请人:财团法人牧岩生命工学研究所