黑熊甲状旁腺素和使用黑熊甲状旁腺素的方法

专利名称：：黑熊甲状旁腺素和使用黑熊甲状旁腺素的方法黑熊甲状旁腺素和使用黑熊甲状旁腺素的方法相关申请的交叉引用本申请要求享有2005年11月10日提交的美国临时申请号60〃36，145的权益，其在此完整引入作为参考。关于联邦政府资助研究的声明本发明受到美国政府的支持，在国立卫生研究院(NIAMSAR050420和NIAR21AA14399-01A2)和国家科学基金会(IBN-0343515)的资助下完成。美国政府对本发明享有一定权利。
背景技术：
：目前对于大约4千4百万美国人来说，包括1000万患有骨质疏松症和3千4百万患有低骨量并具有患骨质疏松症风险的人，骨丢失疾病是一种健康威胁。预计到2020年患有骨质疏松症的美国人数量将上升。因此，大量个体因为低骨量而有骨折的风险。年龄超过50岁的大约40%的白人妇女和13%的白人男子在其一生中具有患臀部、脊柱或者前臂骨折的风险。在2002年与骨质疏松症相关骨折的花费大约是180亿美元，预计还会继续增加。除原发性(年龄相关的)骨质疏松症外，废用性(disuse)骨质疏松症是一种重要的临床问题，尤其是对因为中风或者脊髓损伤长期不活动的患者来说。与健康对照相比，脊髓损伤后第一年骨折率加倍，中风发作后与健康对照相比骨折率也增加。废用增加骨折率主要是因为降低的骨胳载荷造成紊乱的骨重建，这引起骨丢失。发明摘要在一个实施方案中，本发明提供一种包括SEQIDNO:2的至少10个连续氨基酸残基的分离的多肽，其中所述多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸残基41和52中的至少一个。本发明还提供一种包括SEQIDNO:1的分离的多核苷酸。在另一个实施方案中，本发明提供一种增加骨形成细胞中cAMP水平的方法，包括将骨形成细胞与有效量的包括SEQIDNO:2的氨基酸残基l-34的多肽接触，其中将骨形成细胞与多肽接触增加骨形成细胞中的cAMP水平。在另一个实施方案中，本发明提供一种减少骨形成细胞中凋亡的方法，包括将骨形成细胞与有效量的包括SEQIDNO:2的氨基酸残基1-34的多肽接触，其中将骨形成细胞与多肽接触减少骨形成细胞中的凋亡。在另一个实施方案中，本发明提供一种降低骨形成细胞中Bax蛋白与Bcl-2蛋白表达水平比例的方法，包括将骨形成细胞与有效量的包括SEQIDNO:2的氨基酸残基1-34的多肽接触，其中将骨形成细胞与多肽接触降低骨形成细胞中Bax蛋白与Bcl-2蛋白表达水平的比例。在另一个实施方案中，本发明提供一种增加骨形成细胞中骨基质蛋白、转录激活物或者转录调节物表达水平的方法，包括将骨形成细胞与有效量的包括SEQIDNO:2的氨基酸残基1-34的多肽接触，其中将骨形成细胞与多肽接触增加骨形成细胞中骨基质蛋白、转录激活物或者转录调节物的表达水平。在另一个实施方案中，本发明提供一种在个体中增加骨矿物密度，增加骨量，减少骨丢失或者降低骨折发病率的方法，包括将个体的骨形成细胞与有效量的包括SEQIDNO:2的氨基酸残基1-34的多肽接触，其中将骨形成细胞与多肽接触在个体中增加骨矿物密度，增加骨量，减少骨丢失或者降低骨折的发病率。在另一个实施方案中，本发明提供一种在个体中增加骨矿物密度，增加骨量，减少骨丢失或者降低骨折发病率或者其任意组合的方法，包括将个体的骨形成细胞与有效量的包括熊甲状旁腺素或者其功能片段的多肽接触，其中将骨形成细胞与多肽接触在个体中增加骨矿物密度，增加骨量，减少骨丢失或者降低骨折的发病率。在另一个实施方案中，本发明提供一种基本上由SEQIDNO:2的氨基酸残基l-34组成的分离的多肽。在另一个实施方案中，本发明提供一种基本上由SEQIDNO:2的氨基酸残基l-36组成的分离的多肽。附图简述图l显示极限应力，对骨强度的测量，和灰分分数(ashfraction),对骨矿物含量的测量，在黑熊中这两者均随年龄而增加。图2显示对冬眠前、冬眠期间和冬眠后收集的样品来说，黑熊血清骨钙蛋白水平与血清甲状旁腺素(PTH)水平正相关(p=0.0007，n=27)。图3显示在3个月废用期间(disuseperiod)归一化的血清再吸收(ICTP)和形成(PICP和骨钙蛋白)标记物浓度。图4显示当细胞用冬眠后期间收集的血清处理时，成骨细胞释放的PGE2的量最大。图5显示成熟的黑熊PTH蛋白的序列与其他已知的PTH序列比较。图6显示人和黑熊的PTHl-34上调骨钙蛋白(n=2)。图7显示人和黑熊PTH1-34对凋亡-相关基因表达的作用(n=4)。发明详述在人和大部分其他哺乳动物中，因素例如衰老和延长的废用期可能导致骨质疏松症和增加的骨折风险。源于脊髓损伤的废用显著地降低骨矿物密度，尤其在胫骨和股骨，并且显著地降低股骨干的截面转动惯量。因此，脊髓损伤降低了骨弯曲强度，骨折风险增加。源于中风的废用也增加骨折风险。此外，因为骨吸收的立即增加以及骨形成的持续减少，骨的机械卸荷(unloading)可能引起快速的骨丢失。骨重建(remodeling)中废用诱导的变化增加皮质内孔隙，并降低长骨骨干的截面和机械性能。卸荷还显著降低小梁的骨量和微结构。废用对骨的有害作用可以持续到再活动期(remobilizationperiod)。一些骨在再活动期间可以恢复，但恢复是缓慢并且经常是不完全的。例如，卧床休养期间的骨丢失率比再活动期间的骨得率大3倍，太空飞行中骨丢失的恢复甚至在5年后也可能是不完全的。当废用诱导的骨的变化可以通过恢复的活性完全逆转时，再活动周期通常比固定周期长2到3倍。许多情况下骨形成降低和/或骨吸收增加，这降低骨的机械载荷。但是，在犬前肢固定期间再吸收和形成均增加，然而这种情况下存在显著的骨丢失。同样地，患有脊髓损伤的患者中存在股骨转换(turnover),这导致骨丢失和增加的骨折发病率。与此相反，黑熊不会因为老化(图l)，或者更重要地冬眠期间存在持续的废用期而遭受显著的骨丢失。在北方冬眠中的黑熊具有几乎相同长度的不活动和活动周期。关于骨代谢血清标记物的数据(见下文)表明废用期间熊的吸收和形成随吸收和形成之间的正常滞后时间(即逆转期)而增加，形成的增加仍然与再吸收的增加相关和平衡。来自黑熊髂嵴活组织切片的组织学数据还显示休眠期间增加的吸收和形成。但是，熊是唯一的在冬眠期间小梁骨体积、骨矿物密度和骨矿物含量不减少。此外，皮层骨强度和灰分分数随年龄而增加，而在黑熊中孔隙不随年龄而改变，不管废用的年周期。冬眠灰熊中的皮层骨孔隙显著地低于活动灰熊，而股截面几何形态和强度不受冬眠影响。熊已经进化出许多独特的生物学机制以便在在长期不活动没有食物的情况下存活。这些机制似乎包括钙和骨分解代谢其他产物的再利用，因为冬眠期间熊增加骨转换但不排泄废物。在人类中，卧床休养-诱导的废用骨质疏松症主要是由于增加的再吸收但形成没有相应增多造成的。这造成高钙血症，以及增加的泌尿和粪便钙引起的负钙平衡。因为熊在冬眠期间不排尿或者排便，很可能大部分通过再吸收从骨释放的钙通过成骨细胞骨形成再循环到骨中。发现冬眠期间离子钙增加大约23%，可能因为再吸收和形成之间的滞后时间。自相矛盾地，当离子钙水平最高时黑熊PTH水平是最高的(表l)。综合起来，这些发现表明熊已经进化出防止骨质疏松症的生物学机制。在大多数动物中废用期间将骨形成与吸收分离的机制还不清楚，但可能涉及机械和生物化学两个因素。机械张力的缺乏可能通过起始骨细胞凋亡导致再吸收的增加，并且伴随着降低成骨细胞活性。激素例如人PTH可能使骨细胞对机械刺激致敏，并且协同的随机械负荷增加骨形成。每天一次给人施用人PTH增加骨量并降低骨折发病率。因此，在黑熊中，循环的PTH可能使骨细胞对低水平的机械刺激致敏(可能源于冬眠场所的颤动或者复位)以帮助在废用期间保持骨形成。PTH还可以通过刺激成骨细胞分化和抑制成骨细胞凋亡来帮助保持黑熊的骨形成。PTH是血铐水平的主要调节物，因此在废用期间保持黑熊稳态的血清钙水平中起作用。血清PTH水平与活动和冬眠黑熊的骨形成标记物骨钙蛋白正相关(图2)，冬眠期间骨钙蛋白和PTH均增加。此外，当离子钙浓度最高时黑熊PTH浓度是最高的。因为冬眠期间骨吸收增加但总血清钙(tCa)仍然不变，PTH水平的增加可能造成钙的肾重吸收增加，促进矿物质再循环到骨中与骨形成达到平衡的增加。这导致观察到小梁和皮层骨特性例如骨矿物密度("BMD")和皮层孔隙的维持。冬眠期间骨吸收增加，尽管冬眠期间熊不排泄废物，但血钙浓度保持不变。冬眠期间通过骨吸收释放的钙可以再循环，通过保持骨形成与骨吸收的平衡偶合回到骨中。这支持了在冬眠黑熊中PTH具有合成代谢作用的观点，并且解释了熊在冬眠期间保持平衡骨重建的独特能力。当从冬眠中醒来后恢复生理活性时，黑熊PTH的合成作用可以被增强。先前已经显示在大鼠体内和体外生化信号中机械负荷和人PTH协同作用增加骨形成。在春天再活动期间，黑熊的骨形成，如血清骨钙蛋白所示，仍然比冬眠前水平要高。已经发现编码黑熊(i7w^"/^n'cam^)甲状旁腺素(PTH)的多核苷酸序列(SEQIDNO:1)以及成熟84氨基酸PTH蛋白的多肽序列(SEQIDNO:2)。此外，编码全长PTH蛋白(SEQIDNO:4)的cDNA(SEQIDNO:3)，包括一个25氨基酸信号肽(SEQIDNO:4的氨基酸残基1-25)和一个6氨基酸前肽(SEQIDNO:4的氨基酸残基26-31)已经被测序。成熟的黑熊PTH蛋白不同于其他已知的PTH蛋白(图5)。与人PTH相比，在成熟PTH多肽的总共全长84个氨基酸残基中黑熊PTH具有11个不同的氨基酸残基。此处还描述了使用黑熊PTH和其功能片段的不同方法。具体预期包括SEQIDNO:2的至少10个连续氨基酸残基和包括氨基酸残基41或者52中至少一个的多肽亚片段(subfragment)可用于开发对黑熊PTH特异的抗体。这些抗体可用于例如在ELISA分析中定量黑熊PTH。骨形成细胞表面上的PTH受体与细胞内环腺苷酸(cAMP)依赖的第二信使信号途径相关。这些信号途径依次导致参与骨形成的基因例如编码I型胶原、骨粘连蛋白和骨桥蛋白的那些基因的表达增加。因为cAMP/蛋白激酶A途径造成大部分PTH诱导的骨形成组织学和血清指数的增加，因此增加的cAMP应答可能导致更多的骨形成。与天然形式相比，给定PTH蛋白序列相对少量的氨基酸取代可能刺激更多的环腺苷酸(cAMP)产生。例如，相对于大鼠PTH1-34，对于应答每日注射25吗牛PTH1-34，切除卵巢的大鼠显示25%更多的骨形成，其中大鼠PTH1-34与牛PTH1-34具有5个氨基酸序列差异。治疗期间注射牛PTH1-34引起骨体积分数增加37%以上。因此，很可能黑熊PTH的氨基酸取代使其在骨形成细胞中比人PTH诱导更多的cAMP产生。通常PTH通过以下机制例如减少成骨细胞凋亡，通过Runx2增加成骨细胞分化，在骨细胞中下调基于SOST的负反馈和增加骨基质蛋白mRNA的产生引发更多的骨形成应答，所有都是通过cAMP介导的途径。尽管不必理解本发明的机制，但是普遍认为黑熊PTH比其他形式的PTH更具成骨性，这就解释了为什么只有黑熊能够在废用期间保持平衡的骨重建。在本发明的另一个实施方案中，将骨形成细胞与黑熊PTH或者其功能片段接触增加骨形成细胞的cAMP水平。在本发明的另一个实施方案中，将骨形成细胞与包括SEQIDNO:2的氨基酸残基1-34或者1-36的多肽接触。在本发明的另一个实施方案中，将骨形成细胞与包括SEQIDNO:2的多肽接触。在另一个实施方案中，将骨形成细胞与包括SEQIDNO:2的氨基酸残基11-84或者7-84的多肽接触。此处所用的"将细胞与PTH多肽接触"包括就体外实验而言将多肽添加到培养液中，或者使用多肽治疗剂的合适给药步骤将多肽给予个体。"接触细胞"还包括给个体导入一种外源多核苷酸，所述多核苷酸在表达系统中编码所需多肽以便在个体中合成和释放多肽。此处所用的"骨形成细胞"包括但不限于成骨细胞、骨细胞、骨衬细胞(boneliningcell)、成软骨细胞和软骨细胞。适合的，骨形成细胞可以位于个体中。骨形成细胞有规律地随大部分细胞的死亡转换，所述死亡源于程序化细胞死亡或者凋亡。考虑到转换的正常速率，降低骨形成细胞凋亡的任意机理将导致骨形成细胞数目的增加，这估计将促进骨生长。因此，在本发明的另一个实施方案中，将骨形成细胞与黑熊PTH或者其功能片段接触减少骨形成细胞的凋亡。在本发明的另一个实施方案中，将骨形成细胞与包括SEQIDNO:2的氨基酸残基1-34或者1-36的多肽接触。在本发明的另一个实施方案中，将骨形成细胞与包括SEQIDNO:2的多肽接触。此夕卜，很有可能内源黑熊PTH几个更大的C端片段通过结合CPTHRs(C端PTH受体)在季节性骨重建过程中起作用。具体地，熊PTH的C端片段通过阻止破骨细胞形成并且可能通过影响成熟破骨细胞活性能够拮抗PTH1-84和1-34的钙血作用，所述活性通常存在于对吸收刺激例如废用的应答中(Divieti，R等人，2002，Endocrinology143(1):171-6)。这可能帮助熊在整个冬眠期间保持稳态的钙水平。因此，在本发明的另一个实施方案中，骨细胞和成骨细胞可以与包括SEQIDNO:2的氨基酸残基11-84或者7-84的多肽接触。蛋白Bax促进凋亡而Bcl-2蛋白保护细胞免于凋亡，Bax与Bcl-2表达比例的降低意味着特定细胞群中凋亡的减少。因此，在本发明的另一个实施方案中，将骨形成细胞与黑熊PTH或者其功能片段接触降低骨形成细胞中Bax蛋白表达水平相对于Bcl-2蛋白表达水平的比例。在本发明的另一个实施方案中，将骨形成细胞与包括SEQIDNO:2的氨基酸残基1-34或者l-36的多肽接触。在本发明的另一个实施方案中，将骨形成细胞与包括SEQIDNO:2的多肽接触。在本发明的另一个实施方案中，将骨形成细胞与包括SEQIDNO:2的氨基酸残基11-84或者7-84的多肽接触。实施例11显示黑熊PTH1-34降低培养细胞中Bax/Bd-2的表达比例，而人PTHl-34增加Bax/Bcl-2的表达比例(图7)。因此，黑熊PTH1-34看起来比人PTH1-34更有效的阻止凋亡。不受理论束缚，这种区别可能是人和黑熊PTHl-34之间两个氨基酸差异的结果。这些数据表明熊PTH比人PTH更具有合成代谢性，因为减少的成骨细胞凋亡可能有助于利用PTH治疗诱导的骨形成应答。将骨形成细胞与黑熊PTH或者其功能片段接触还增加骨基质蛋白的表达水平，骨基质蛋白是骨形成细胞中的转录激活物或者转录调节物。在本发明的另一个实施方案中，转录激活物是Runx2。在本发明的另一个实施方案中，转录调节物是c-fos。骨基质蛋白可以适合的包括骨钙蛋白、骨桥蛋白和I型胶原。在本发明的另一个实施方案中，将骨形成细胞与包括SEQIDNO:2的氨基酸残基1-34或者1-36的多肽接触。在本发明的另一个实施方案中，将骨形成细胞与包括SEQIDNO:2的多肽接触。在本发明的另一个实施方案中，将骨形成细胞与包括SEQIDNO:2的氨基酸残基11-84或者7-84的多肽接触。外源人PTH用于治疗人绝经后和年龄相关的骨质疏松症，但它不是一个理想的治疗剂。目前只有重组人PTH1-34(LY333334，EliLilly,IndianapolisIN)被批准用于临床应用，美国食品和药物管理局只考虑批准一种形式的重组人PTH1-84(ALXl-ll，NPSPharmaceuticals,Parsippany，NJ)。尽管LY333334和ALXl-11能够在体内刺激大约相同程度的骨形成，它们的生物作用是不同的。例如，PTHl-34下调前胶原-lmRNA的产生，而PTHl-84不是这样(Nasu等人，1998,EndocrJ，45,229-34)。此外，已经确定当从成熟的激素切割时，人PTH的C端部分具有重要的生物学功能例如对骨吸收的抑制。LY333334或者ALX1-11的长期使用在大鼠中产生骨肉瘤，但初步结果表明人PTHl-84比人PTHl-34具有更低速率的致癌性，可能因为外源人PTHl-84的C端片段(来自外周蛋白酶解加工)能够结合C端PTH受体(CPTHRs)并增加骨细胞凋亡。因此，尽管具有相同的合成代谢性，相对于人PTH1-34，人PTH1-84可能是更好的骨质疏松症疗法。但是，人PTHl-84无法完全恢复丢失的骨；已经显示由于年龄相关的骨质疏松症男人和妇女可能丢失20-30%之间的皮层和松质骨，但使用ALX1-11在其推荐的治疗方式期间只有8%被恢复。因此，临床上需要一种具有更大生骨能力的骨质疏松症治疗方式。在本发明的其他实施方案中，将个体的骨形成细胞与黑熊PTH或者其功能片段接触在个体中增加骨矿物密度，增加骨量，降低骨丢失或者降低骨折的发病率。在本发明的另一个实施方案中，将骨形成细胞与包括SEQIDNO:2的氨基酸残基1-34或者1-36的多肽接触。在本发明的另一个实施方案中，将骨形成细胞与包括SEQIDN0.2的多肽接触。在本发明的另一个实施方案中，将骨形成细胞与包括SEQIDNO:2的氨基酸残基11-84或者7_84的多肽接触。适合的，将个体的骨形成细胞与黑熊PTH或者其功能片段接触增加骨矿物密度，增加骨量，降低骨丢失或者降低骨折的发病率至少大约5%或者至少大约10%。骨矿物密度的增加，骨量的增加，骨丢失的降低或者骨折发病率的降低可以是至少大约15%，至少大约30%，至少大约50%，至少大约75%或者至少大约90%。利用本领域普通技术人员已知技术通过测量治疗前后相同患者的目标特征以确定骨矿物密度的增加、骨量的增加、骨丢失的下降或者骨折发病率的降低。例如，利用涉及对脊柱、腕、臂或者腿骨进行双能X射线(DEXA)或者CT扫描的方法，可以测定骨矿物密度。个体可以适宜的是哺乳动物，包括但不限于人，马，狗，猫，小鼠，熊，牛，猪或者鹿。个体可能己患有骨质疏松症或者可能有患骨质疏松症的风险。患骨质疏松症的风险因素包括50岁以后的个人骨折史；当前的低骨量；一级亲属的骨折史；是雌性；是细的和域具有小架(smallframe);老年；骨质疏松症家族史；绝经期导致的雌激素缺失，尤其早期的或者手术诱导的；经期异常缺失(经闭)；神经性食欲缺乏；低的终生钙摄取量；维生素D缺陷；某些药物的使用(皮质类固醇，化疗，抗惊厥药等)；某些慢性医药病症的存在，例如那些减少肠中钙吸收的例如Crohn's病；男性低睾丸激素水平；不活动的生活方式；目前的吸烟；酒精的滥用；以及是白种人或者亚洲人；尽管非洲裔美国人和西班牙裔美国人也有显著的风险。此外，妇女在绝经期后5到7年可能丢失她们骨量的20°/。，使她们对骨质疏松症更敏感。黑熊PTH或者其功能片段还可以用作预防剂(而不是补药)，或者预防方法以抵抗废用性骨质疏松症或者在有患骨质疏松症风险的个体中预防骨质疏松症。因为看起来熊是唯一的在废用期间保持平衡骨重建的动物，黑熊PTH或者其功能片段还可用于预防骨胳卸荷降低期间的骨丢失，所述骨胳卸荷降低发生在例如宇航员太空飞行期间和损伤后的脊髓损伤患者中。黑熊PTH或者其功能片段其可以与钙和/或维生素D联合给药。钙和/或维生素D可以与黑熊PTH或者其功能片段同时给药或者可以在黑熊PTH或者其功能片段前或者后给药。适合的，"维生素D"是指完整的维生素D型化合物。可以利用任意合适的技术实现黑熊PTH或者其功能片段或者包括黑熊PTH或者其功能片段的组合物的给药。黑熊PTH或者其功能片段可以通过任意合适的途径给药包括，例如，口服，鼻，直肠和肠胃外给药途径。此处所用的术语"肠胃外"包括但不限于皮下，皮内，静脉内，肌内，腹膜内和鞘内给药，例如通过注射。如上面所讨论的，多肽的给药包括与启动子可操作连接的外源多核苷酸的给药，这样所述多核苷酸在个体中表达多肽。多肽的给药还包括病毒载体的给药，所述病毒载体包括编码多肽的多核苷酸。适合的，病毒载体是腺病毒载体。黑熊PTH或者其功能片段，或者包括黑熊PTH或者其功能片段的组合物，可以连续的或者在不连续的时间间隔之间给药，这是本领域技术人员可以轻易确定的。普通熟练的临床医生能够确定给个体施用黑熊PTH或者其功能片段的合适量。针对任意特定个体的特定有效量取决于各种因素，包括待治疗的病症和病症的严重程度；使用的特定化合物的活性；使用的特定组合物；个体的年龄，体重，一般健康状况，性别和饮食；给药途径；使用的黑熊PTH或者其功能片段排泄或者失活的速率；治疗的持续时间；与黑熊PTH或者其功能片段联合或者同时使用的其他药物以及医药领域公知的类似因素。例如，本领域普通技术人员都清楚剂量起始水平低于要求实现预期效果的水平，逐渐增加剂量直到实现预期效果。适当地，在一个实施方案中黑熊PTH或者其功能片段的剂量范围从0.10吗/kg每天到40吗/kg每天。在另一个实施方案中，剂量范围从5ng/kg每天到20pg/kg每天。在另一个实施方案中，剂量是10iig/kg每天。在另一个实施方案中，剂量范围从10ng/天到400pg/天每个体。在另一个实施方案中，剂量范围从20^ig/天到40pg/天每个体。在另一个实施方案中，剂量是30pg/天每个体。在一个实施方案中，个体是人。适当地，在一个实施方案中给定1周的每日剂量，在另一个实施方案中给定1个月的，在另一个实施方案中给定3个月的，在另一个实施方案中给定6个月的，在另一个实施方案中给定一年的，在另一个实施方案中给定一年半的，在另一个实施方案中给定2年的，以及在另一个实施方案中给定3年的。如果需要，为了给药有效的每日剂量可以分成多个剂量。因此，单次剂量的组合物可以包含这种量或者其约数以构成每日剂量。如果需要，合适的输送装置装载多于一天的有效每日剂量，例如，用于7天，14天，21天，28天等等，并且输送装置用于重复给药预期每日单次剂量或者每曰多次剂量直到预期总天数。如所注释的，本领域普通技术人员能够轻易地优化有效剂量和共给药方式，所述有效剂量和共给药方式由良好的医疗实践和个体个体的临床病症来确定。根据已知的制备药学有效组合物的方法可以配制可用于本发明方法的组合物，所述组合物包含黑熊PTH或者其功能片段。在许多资料中详细描述了制备工艺，所述资料是本领域技术人员公知的并且能够轻易得到的。例如，E.W.Martin的Remington'sPharmaceuticalScience描述了可用于本文所述方法的制备工艺。通常，组合物如此配制使有效量的多肽与合适的载体组合以便促进组合物的有效给药。用于本方法的组合物还可以采用各种形式。这些包括，例如，固体，半固体，和液体剂型，例如片剂，丸剂，粉剂，液体溶液或者悬浮液，栓剂，注射和注入溶液，和喷雾剂。剂型取决于预定的给药方式和治疗应用。组合物还适当包括常用的药学上可接受的赋形剂，所述赋形剂是本领域技术人员已知的。赋形剂的实例包括注射用水，乙醇，二甲基亚砜，甘油，氧化铝，淀粉，冰醋酸，醋酸钠，甘露醇，甲酚，调节组合物的pH到合适值的盐酸和/或氢氧化钠，和等价物或者其他合适的载体和稀释剂。为了给药这类剂量用于预期应用作准备，基于包括载体或者稀释剂的全部组合物重量，药物组合物按重量计将包括大约0.1%和99%之间，以及适当地大约1和15%之间的一种或者多种本发明的多肽。此处所用的"分离的"核酸分子，多核苷酸，多肽或者类似物，视情况而定，是指至少从污染物(例如，其他种类的多核苷酸，多肽或者类似物)部分纯化的组分，所述污染物不是在其自然状态之下发现的。一种分离的核酸，多核苷酸或者多肽可能包含小于大约50%，适当地小于大约75%，和最适当地小于大约90%的与其原本有关的细胞组分。利用PCR扩增使其能够充分和轻易的从其余细胞组分区别(例如，在凝胶上)的多核苷酸被认为是"分离的"。本发明的核酸分子，多核苷酸和多肽可以是"基本上纯的"，即，具有利用本领域已知的纯化技术能够实现的最高纯度。此处所用的"功能片段"是指多肽或者多核苷酸的任意区域或者部分，所述多肽或者多核苷酸是更大多肽或者多核苷酸的区域或者部分，所述区域或者部分具有源于更大多肽或者多核苷酸的活性或者功能。例如，人PTH的功能片段是人PTH的1-34区域。当在本说明书和所附权利要求中使用时，单数形式"一个"和"所述"包括复数指示，除非上下文清楚的另外规定。还应注意术语"或者"通常使用其包括"和/或"的意义，除非上下文清楚的另外规定。所有出版物、专利和专利申请在此相同程度的全文清楚引入作为参考，就如各个独立出版物、专利或者专利申请是具体和单独引入作为参考。在本文和引用的专利、出版物和参考文献冲突的情况下，以本文为准。还应特别明确此处叙述的任意数值范围包括从下限值到上限值的所有数值，即，在列举的最低值和最高值之间数值的所有可能组合被认为在本申请中明确指出的。例如，如果浓度范围标定为1到50%,表示值例如2%到40%，10%到30%，或者1%到3%等等被明确地在说明书中列举。如果浓度范围是"至少5%"，表示直至和包括100%的所有百分比值也是明确列举的。这些是具体预期的唯一实例。提供下列实施例以帮助进一步了解本发明。采用的特定材料、方法和条件旨在解释本发明，而不是限制本发明的范围。实施例1-黑熊PTH1-84的测序基因组DNA提取从圈养的雌性黑熊采血，保存在4°C。按照制造商的说明书，利用GenomicPrepBloodDNA分离试齐[J盒(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)，在2周内从全血样品提取基因组DNA。PCR克隆和测序黑熊基因组DNA用于PTH的PCR扩增，利用根据GenBank提供的8种全长哺乳动物PTH序列的比对设计的通用引物，所述8种全长哺乳动物PTH序列包括牛(Bostaurus，AAA30749)，猫(Feliscatus,Q9GL67),狗(Canisfamiliaris，P52212)，人(Homosapiens,NP_000306),恒河猴(Macacafascicularis,Q9XT35)，小鼠(Musmusculus,NP一065648),猪(Susscrofa，NP_999566)，和大鼠(Rattusnorvegicus,NP—058740)。使用10-15ng基因组DNA，100jjMdNTPs,0.2各种引物和1单位REDTaq(Sigma,St.Louis,MO)在20pi反应体积中进行PCR扩增。利用UltraCleanGelSpin试剂盒(MoBioCarisbad，CA)对PCR产物进行凝胶纯化，并利用TA克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad,CA)克隆到pCRII载体。按照制造商的说明书，利用DTCSQuickStart试齐u盒和CEQ8000GeneticAnalysisSystem(BeckmanCoulter,Fullerton，CA)进行DNA测序。序列分析利用BlastX(Altschul等人，1997;NucleicAcidsRes.，25，3389-402)在GenBank蛋白数据库中搜索核苷酸序列以证实它们与PTH的假定相同性。通过ClustalWversion1.82(Chenna等人，2003;NucleicAcidsRes"31，3497-500)进行多重序列比对。利用MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis(MEGA)packageversion3,0(Kumar等人，2004;BriefBioinform.,5,150-63)中实现的邻接(NJ)法，进行系统发生分析，用配对缺失选择处理比对缺口，Poisson修正模型进行距离计算。PTH克隆和序列分析不同的引物组合用于从黑熊基因组DNA进行基于PCR的PTH克隆。根据初步克隆的测序结果，设计对应于起始密码子的基因特异有义引物，与包含终止密码子的简并反义引物一起扩增PTH的完整编码区域。设计覆盖终止密码子的第二反义引物以产生用于序列确认的克隆。序列组装显示115氨基酸的前体PTH蛋白，包括25氨基酸信号肽和6氨基酸前肽。推定的成熟蛋白是84个氨基酸，计算分子量为9,471道尔顿，pl为8.1。黑熊PTH与其他哺乳动物具有84-95%的序列相似性，与狗PTH最相似(91%同一性，95%相似性)(图5)。有趣地是，两个氨基酸残基，成熟激素的41和52是黑熊PTH才有的。实施例2-冬眠期间骨吸收和形成标记物的水平血清样品从圈养熊研究设备中饲养的5只黑熊(Ursusamericanus)收集血液样品。VirginiaPolytechnicaInstituteandStateUniversityAnimalCareCommittee批准所有的熊处理实验步骤(弁98-069-F&WS)。用克他命(100mg/ml):甲苯噻嗪(lOOmg/ml)的2:1混合物对熊进行麻醉；剂量是1cc混合物每45.5公斤体重。冬季收集期间体温低4'C到6。C，证实熊处于冬眠状态。在冬眠洞穴里不存在尿液或者声音。在任意处理步骤期间没有观察到应激行为。当熊被麻醉时从股静脉抽取血液样品，样品在盛满冰的冷却器中转运到实验室。回到实验室后立即离心血液分离血清，血清冷冻在-20下。从十月的第一天到五月的结尾，每10天收集每只熊的血液样品。冬眠开始于一月初，结束于四月初。因此，采集日期包括活动的冬眠前期，废用冬眠期，和活动的冬眠后再活动期。黑熊骨钙蛋白纯化和RIA步骤将黑熊皮层骨打碎成小片，用3份己烷和2份异丙醇脱脂，冻干。在液氮中将千燥的骨研磨成细粉，按照Hauschka等人(l989，Physiol.Rev.,69,990-1047)的描述溶解骨钙蛋白。通过Colombo等人(1993，J.BoneMiner.Res.，8，733-43)改进的方法从所获EDTA提取物中纯化骨钙蛋白。简单来说，粗EDTA溶液稀释2倍，通过含有10gSepralyteC18颗粒(AnalytichemInternational,HarborCity，CA)的填充柱，所述填充柱先前用甲醇活化，并用溶于水的0.1%三氟乙酸(0.1%TFA)平衡。用0.1%TFA彻底洗涤，然后用30。/。甲醇/0.1。/。TFA洗涤至UV吸光度跌至基线。用80X甲醇/0.iy。TFA洗脱骨钙蛋白。在气流中蒸发甲醇，残余溶液冻干。所获干燥蛋白悬浮于0.05MTris缓冲液，pH8.0，上样于先前用相同缓冲液平衡的5mlBioradEcono-Q柱。溶于0.5MTris,pH8.0的0.1到0.6MNaCl梯度对柱进行洗脱。骨钙蛋白在一个对称峰中洗脱，最后从柱洗脱。通过将级分等份与重氮苯磺酸反应在包含骨钙蛋白的那些级分中产生粉色来定性验证该峰为骨钙蛋白，强度对应于峰值高度。C18和Econo-Q柱都是新的，从未接触过其他种属的蛋白。先前在其他种属中的经验表明最终骨钙蛋白峰高于99%纯度。利用PierceChemical(Rockford,IL)的BCA试剂测定最终洗脱液中黑熊骨钙蛋白的浓度。生化分析利用RIA和ELISA分析血清的PTH、25-OHD、瘦蛋白、IGF-I和骨钙蛋白(一种骨形成标记物)。利用放射免疫测定分析高度纯化的黑熊骨钙蛋白和黑熊血清。抗体是豚鼠抗大鼠骨钙蛋白，示踪物是1251标记的大鼠骨钙蛋白。该分析还包括大鼠骨钙蛋白标准品(BiomedicalTechnologies,Inc,Stoughton,MA)和纯化的黑熊骨钙蛋白的剂量稀释液。对每分析管中lOpl黑熊血清的等份一式两份进行分析，所有样品在同一时间进行分析。重复之间的差异小于5%。为观察废用期间骨形成和吸收标记物的变化，计算冬眠期间每个时间点5只黑熊的骨钙蛋白的平均值。这些值用冬眠期间骨钙蛋白的最大值归一化。对于PICP(骨形成标记物)和ICTP(骨吸收标记物)的测量进行相似的计算。在同一张图上绘出吸收和形成标记物的归一化值以评价废用期间骨吸收和形成的暂时和相对值变化。使用如上所述从冬眠熊获得的血清样品，利用离子选择电极(BayerRapidlab865,Leverkusen，Germany)测定离子钙浓度。使用如上所述获得的血清样品，利用hnmutopicsInternational(SanClemente，CAa)的ELISA试剂盒分析PTH;分析内变异系数是4.7%。利用ALPCODiagnostics(Windham,NH)的ELISA试剂盒对25-OHD进行分析；分析内变异系数是5%。通过RIA(Linco,St.Charles,MO)测量瘦蛋白；分析内变异系数是3.4%。利用酸性乙醇提取RIA(NicholsInstituteDiagnostics,SanJuanCapistrano，CA)湖!l量IGF陽I;分析内变异系数是4.3%。按照上述的RIA测量血清骨钙蛋白。对所有的血清代谢产物，计算每个季节(冬眠前，冬眠和冬眠后)的平均值(每个指定季节内所有的熊和所有的时间点)，通过ANOVA进行比较。ANOVA后是用于多重平均比较的Fisher'sPLSD检验。自然对数变换被用于校正骨钙蛋白、PTH、25-OHD和IGF-I方差的非恒定性以证实ANOVAs。线性回归被用于评价骨钙蛋白和激素之间的相关性。一些血清样品的体积不足以进行所有分析；各分析的样品规模与结果一起显示。驢冬眠开始后骨吸收标记物(ICTP)立即开始增加(图3)。各数据点是5只熊的平均值。10-20天后，骨形成标记物(骨钙蛋白和PICP)还增加，看起来仍然与冬眠期间增加的吸收相关。这与吸收和形成之间的1-2周组织学"颠倒(reversal)"期一致。这些重建标记物显示整个冬眠期间增加的吸收和形成的趋势，并且形成看起来仍与吸收保持相关和平衡。与冬眠前相比，冬眠期间和冬眠后平均骨钙蛋白水平更高(pO.OOOl)(表l)。冬眠期间离子钙水平显著(p=0.0062)高于冬眠前水平(表1)。在冬眠唤醒后的再活动期间，相对于冬眠水平，离子钙水平不再显著(p=0.37)增加，但它们仍然高于(p=0.015)冬眠前水平。骨钙蛋白与PTH(图2)正相关，但不与25-OHD、瘦蛋白或者IGF-I正相关。在冬眠后季节PTH显著高于冬眠前(p=0.006)和冬眠(p=0.014)季节。冬眠期间PTH的增加相对于冬眠前是不显著的(p=0.35)。25-OH维生素D不显示季节变化(p=0.64)。冬眠期间血清瘦蛋白相对于冬眠前不发生变化，但在冬眠后再活动期间显著(pO.004)更低(表1)。冬眠期间IGF-I相对于冬眠前显著(p0.0001)减少，在再活动期间达到其最高值(表l)。表1-平均血清代谢产物浓度表1:平均血清代谢浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>平均值为粗体，标准偏差在圆括号中，样品规模在方括号中。对于指定代谢产物，带有相同上标的值不是显著(p<0.05)不同的。25-OHD不显示显著的季节差异。实施例3-MC-3T3成骨细胞释放的PGE2受熊血清季节变化的影响为了评价熊血清季节变化对成骨细胞代谢的影响,MC-3T3细胞用熊血清处理，对前列腺素E2(PGE2)释放进行定量。37°C5%。02条件下，MC-3T3细胞在添加10%胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)和1%青霉素-链霉素溶液的alpha最小必需培养基(Invitrogen，Carlsbad,CA)中生长24小时。吸出培养基，替换为10ml包含10%熊血清的新鲜培养基，所述熊血清收集自冬眠前、冬眠期间或者冬眠后。细胞再继续生长24小时，然后收集培养基，在-2(TC冷冻用于PGE2分析。利用溶于￡0丁八的0.25%胰蛋白酶从培养皿移走细胞，离心沉淀，用台盼蓝和血细胞计数器定量。利用BiotrakPGE2竞争性酶免疫分析(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)测定PGE2水平。该分析利用来自所有实验培养基样品的50pl样品一式两份进行。在终点测定前利用1M硫酸终止反应，利用微板读数器(VERSAmax,MolecularDevicesCorporation,Sunnyvale,CA)在450nm读数。两个光密度值对非特异性结合进行校正并取平均值，与标准曲线比较以确定每孔PGE2的量。这些值对总培养基体积进行校正，用样品中的细胞数目进行归一化。ANOVA用于比较3个血清组之间归一化的PGE2。与冬眠前血清(p=0.058)和冬眠期间血清(p=0.014)相比，用冬眠后血清处理的PGE2量更高，所述PGE2由体外用熊血清处理的成骨细胞释放(图4)。与冬眠前血清相比，用冬眠期间血清处理的细胞释放的PGE2不是显著(p=0.48)不同的。PGE2释放的季节变化显示与血清IGF-1季节变化类似的趋势。P值用于与冬眠后值进行比较。冬眠前和冬眠期间值不是彼此不同的(p=0.48)。实施例4-在熊血清中的培养降低冬眠期间Bax与Bcl-2的基因表达比例在2004-2005之间如上所述从4只雌性黑熊收集血清样品。取样曰期包括冬眠前期活动期，冬眠废用期和冬眠后再活动期。MC-3T3成骨细胞在包含10%熊血清的培养基中培养24小时，然后利用BioRadAquaPureRNA分离试剂盒(#732-6370,Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)分离总RNA。为了产生cDNA，在梯度热循环仪(Mastercyclergradient,Eppendorf，Westbury,NY)上利用SuperscriptII逆转录酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)和0.5(ig01igo(dT)12-18引物进行逆转录，在42。C20分钟，50°C10分钟，42°C1小时。利用PrimerQuest软件(IntegratedDNATechnologies,Coralville,IA)和NCBI基因库序列，设计针对促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的引物。利用RedTaq进行半定量PCR，实验步骤组成为94°C2分钟，循环94°C30秒，69.5°C30秒和72'C1分钟，72""C最终延伸5分钟。利用ImageJ软件包(NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD)对条带强度进行定量，归一化到3个管家基因的表达(Gapdh，卩-肌动蛋白，亲环蛋白(cyclophillin))。利用Fisher's保护性最小显著差数法(PLSD)的ANOVA事后检验用于比较3个季节中(冬眠前，冬眠期间，冬眠后)Bax与Bcl-2的比例。虽然它没有达到统计显著性4=0.300)，但在冬眠期间相对于冬眠前Bax/Bcl-2比例降低大约42%。统计显著性的缺乏可能与小的样本规模(每个季节11=2)有关。这些数据表明来自冬眠中熊的血清包含减少成骨细胞凋亡的生物分子。因为内源PTH和骨形成标记物骨钙蛋白在冬眠期间都增加(Donahue等人，2006;J.Exp.Biol.，209，1630-8)，有可能内源熊PTH在冬眠期间引起成骨细胞凋亡的减少，这从而增加骨形成。实施例5-黑熊相对于人PTH1-84或者其亚片段对骨细胞系中cAMP影响的比较制备全长重组黑熊PTH(残基1-84)，研究其对骨细胞系(MC-3T3成骨细胞和MLO-Y4骨细胞性细胞)中的环腺苷酸(cAMP)浓度的影响，并与利用重组人PTHl-84获得的结果进行比较。利用黑熊和人PTH的亚片段进行等效实验，亚片段包括全长(l-84)成熟蛋白的氨基酸残基1-34,1-36,7-84,11-84和41-52。对于一些实验来说，黑熊和人PTH多肽是用固相法合成的。为了确定不同形式的重组黑熊和人PTH多肽对骨形成细胞细胞中cAMP水平的影响，将培养的骨细胞(MC-3T3和MLO-Y4)与人或者黑熊PTH全长(即氨基酸残基1-84)多肽或者上面所列的亚片段之一接触10或者30分钟。在细胞接触PTH多肽后，利用下面描述的竞争性结合分析测定细胞中的cAMP浓度。对于所有利用重组多肽的实验，冻干肽在1mM乙酸中重新溶解到10(HiM储存浓度，在使用前稀释到10nM工作储存浓度。细胞培养37°C5。/。C02条件下，在alpha-最小必需培养基1%青霉素/链霉素和10。/。血清(MC-3T3:10%胎牛血清(FBS),MLO-Y4:5%FBS和5%小牛血清)中维持MC-3T3亚克隆14细胞(ATCC，CRL-2594)和MLO-Y4细胞(获自L.F.Bonewald,UniversityofMissouri,KansasCity，MO)。所有此处描述的步骤都用独立的细胞培养物重复，这样的话对于每次分析中所有的处理组合n=6。PTH处理对胞内cAMP活性的影响MC-3T3和MLO-Y4细胞以合适密度(MC-3T3:50,000细胞/cm2,MLO-Y415,000细胞/cm勺接种在6-孔板中。细胞培养过夜以达到最佳铺满。然后吸出培养基，替换为包含10%血清+载体(1mM乙酸)或者10%血清+100nMPTH(人或者熊1-84，或者其亚片段)的培养基。细胞在这些条件下培养10或者30分钟(Carter,P.H.等人，1999,JBiol.Chem.274(45)，31955-60;Chen,X.等人，2002，Am.J.Physiol.CellPhysiol.283(5),C1432-40;Schiller,P.C.等人，1999，J.BoneMiner.Res.14(9),1504-12)。培养后，细胞用胰蛋白酶消化，离心，并且在裂解缓冲液中重悬。悬浮液保温10分钟，离心分离细胞碎片。利用竞争性结合分析(CyclicAMPAssay弁KGE002,R&DSystems,Minneapolis,MN)对细胞裂解物的上清(在2倍稀释后)的cAMP浓度进行分析。对于每个接受检测的多肽，都存在在应答基于黑熊PTH的多肽时细胞cAMP水平的增加。实施例6-黑熊相对于人PTHl-84或者其亚片段对骨细胞系凋亡影响的比较制备全长重组黑熊PTH(残基1-84)，研究其对骨细胞系(MC-3T3成骨细胞和MLO-Y4骨细胞性细胞)凋亡的影响，并与利用重组人PTHl-84获得的结果进行比较。利用黑熊和人PTH的亚片段进行等效实验,亚片段包括全长(1-84)成熟蛋白的氨基酸残基1-34,1-36,7-84，11-84和41-52。对于一些实验来说，黑熊和人PTH多肽是用固相法合成的。为了确定黑熊和人PTH预防成骨细胞和骨细胞凋亡(在促凋亡条件下)的相对能力，细胞与人或者黑熊PTH1-84或者上面所列亚片段之一保温1小时。然后，细胞用地塞米松处理6小时以诱导凋亡。按照下面所述，利用ELISA定量凋亡。对于所有利用重组多肽的实验，冻干肽在lmM乙酸中重新溶解到100^M储存浓度，在使用前稀释到10一工作储存浓度。用MC-3T3细胞进行其他实验，利用0.1%或者10%FBS。进行具有比正常(10%)量FBS更低(0.1%)的其他实验，对结果进行分析以确定在利用正常或者更低水平的血清进行的实验之间是否存在显著不同的应答。在本实施例报道的实验中，结果不受使用的FBS量的影响。凋亡保护研究显示每个被检测的多肽减少或者预防MC-3T3细胞的凋亡。细胞培养37°C5n/。C02条件下，在alpha-最小必需培养基，1%青霉素/链霉素和10。/o血清(MC-3T3:10%胎牛血清(FBS),MLO-Y4:5%FBS和5%小牛血清)中维持MC-3T3亚克隆14细胞(ATCC,CRL-2594)和MLO-Y4细胞(获自L.F.Bonewald,UniversityofMissouri,KansasCity,MO)。所有jt匕处描述的步骤都用独立的细胞培养物重复，这样的话对于每次分析中所有的处理组合n=60PTH处理对凋亡的影响MC-3T3细胞以50,000细胞/cm2，MLO-Y4细胞以15,000细胞/0112接种在6-孔板中，培养过夜以达到最佳铺满。吸出培养基，替换为包含10%血清+载体(lmM乙酸)或者10。/。血清+100nMPTH(人或者熊1-84，或者其亚片段)的培养基。在1小时保温后(Jilka等人，1999;J.Clin.Invest,104,439-46)，每孔添加10pM地塞米松或者其载体(DMSO)，细胞保温6小时(Bellido，T.等人，2003,J.Biol.Chem.278(50)，50259-72.;Jilka等人,1999,J.Clin.Invest.,104,439-46)。在凋亡诱导期间PTH多肽或者载体被留在原位，因为PTH对凋亡的抑制是自限性的(Bellido等人，2003)。6小时后，细胞用胰蛋白酶消化，离心，重悬，并利用血细胞计数器计数。从悬浮液中取出50,000个细胞，放入裂解缓冲液中。取出裂解上清(离心后)用于分析，保存在-2(TC。利用ELISA(CellDeathDetectionELISA，#1544675,RocheAppliedScience,Indianapolis,IN)从裂解上清定量凋亡。该分析检测单-和寡聚核小体，所述单-和寡聚核小体来自细胞裂解产物细胞质级分的片段化细胞DNA，因此为早期和中间阶段的凋亡提供良好的测量方法。简单来说，在缓冲溶液中稀释样品，添加到包被抗组蛋白小鼠单克隆(克隆Hll-4)抗体的微平板孔中。来自载体处理细胞的裂解上清作为阴性对照。在添加过氧化物酶缀合的抗DNA小鼠单克隆(克隆MCA-33)抗体后在405nm测量光密度，测定各样品中相对于其对应阴性对照的凋亡量。所有样品一式两份进行分析。每个被检测的多肽都减少细胞的凋亡(在促凋亡条件下)。实施例7-黑熊相对于人PTH1-84或者其亚片段对骨细胞系中基因表达影响的比较制备全长重组黑熊PTH(残基1-84)，研究其对骨细胞系(MC-3T3成骨细胞和MLO-Y4骨细胞性细胞)中基因表达水平的影响，并与利用重组人PTHl-84获得的结果进行比较。禾幅黑熊和人PTH的亚片段进行等效实验，亚片段包括全长(l-84)成熟蛋白的氨基酸残基1-34，1-36,7-84,11-84和41-52。对于一些实验来说，黑熊和人PTH多肽是用固相法合成的。为了确定黑熊和人PTH对骨基质调节、转录调控、抗凋亡(Bcl-2)基因和促凋亡基因Bax的影响，细胞与人或者熊PTH1-84或者亚片段培养1或者3小时。用实时PCR定量基因表达。对于所有利用重组多肽的实验，冻干肽在lmM乙酸中重新溶解到100uM储存浓度，在使用前稀释到10uM工作储存浓度。利用MC-3T3细胞进行其他实验,使用0.1%或者10。/。FBS。进行具有比正常(10%)量FBS更低(0.1%)的其他实验，对结果进行分析以确定在利用正常或者更低水平的血清进行的实验之间是否存在显著不同的应答。在本实施例报道的实验中，结果不受使用FBS量的影响。实时PCR用于评估添加多肽1-和3-小时时间点的基因表达水平，特别显示黑熊PTH1-34在MC-3T3细胞中上调基因表达。细胞培养37°C5。/。C02条件下，在alpha-最小必需培养基，1%青霉素/链霉素和10。/。血清(MC-3T3:10%胎牛血清(FBS),MLO-Y4:5%FBS和5%小牛血清)中维持MC-3T3亚克隆14细胞(ATCC,CRL-2594)和MLO-Y4细胞(获自L.F.Bonewald,UniversityofMissouri,KansasCity,MO)。所有此处描述的步骤都用独立的细胞培养物重复，这样的话对于每次分析中所有的处理组合n=6。PTH处理对基因表达的影响MC-3T3细胞以50,000细胞/cm2密度，MLO-Y4细胞以15,000细胞/cm2密度接种6-孔板中，培养过夜以达到最佳铺满。吸出培养基，替换为包含10%血清+载体(lmM乙酸)或者10。/。血清+100nMPTH(人或者熊1-84，或者上面所列的亚片段)的培养基。细胞在这些条件下培养1或者3小时；这些时间点相应于PTH诱导的c-fos和骨钙蛋白的上调(Jiang等人,2004，J.Biol.Chem.,279,5329-37;Chen等人，2002)。利用SV总RNA分离系统(Promega，Madison,WI)分离总RNA。进行逆转录产生cDNA,在梯度热循环仪(Mastercyclergradient,Eppendorf,Westbmy,NY)中4吏用SuperscriptII逆转录酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)和0.5jxg01igo(dT)12-18引物，42。C20分钟，50。C10分钟和42°C1小时。利用PrimerQuest软件(IntegratedDNATechnologies,Coralville,IA)和NCBI基因库序列设计针对所有感兴趣的基因(骨钙蛋白，骨桥蛋白，I型胶原，c-fos，Runx2，Bax,Bcl-2，SOST)和管家基因(Gapdh,P-肌动蛋白，亲环蛋白)的引物，利用来自MC-3T3和MLO-Y4细胞的RNA优化PCR条件。利用Mx3000P实时PCR系统(Stratagene,LaJolla,CA)进行实时PCR。实验步骤包括在95'C热启动10分钟，然后是40个循环95°C30秒(变性),69°C1分钟(退火)和72°C1分钟(延伸)。该实验步骤对c-fos例外，其具有66'C的退火温度。每25pi反应液包含lxAbsoluteqPCRSYBRgreenmix(ABgene，Rochester,NY)，0.1正向和反向引物和2.5ng总RNA等效cDNA模板。利用归一化到3个管家基因几何平均数的相对标准曲线方法确定基因表达。所有样品一式两份进行测定，对变异系数(CV)大于10%的任意样品进行重新分析。多肽引起骨基质、转录调控和转录激活基因的上调，以及Bax/Bcl-2表达比例的下降。实施例8-来自不同季节的黑熊血清对骨细胞凋亡和基因表达影响的比较，以及与PTH和骨钙蛋白血清水平的关系在2004和2005年间从VirginiaTechCenterforBearResearch喂养的至少3只不同的雌性黑熊(Ursusamericanuspallas)中采集血液样品。以后几年中从其他黑熊采集血清。VirginiaPolytechnicInstituteandStateUniversityAnimalCareCommittee批准所有的熊处理实验步骤(約8-069-F&WS)。用克他命(100mg/ml):甲苯噻嗪(100mg/ml)的2:1混合物对熊进行麻醉；剂量是lcc混合物每45.5公斤体重。当熊被麻醉时从股静脉抽取血液样品，样品在盛满冰的冷却器中转运到实验室。回到实验室后立即离心血液分离血清，血清冷冻在-20'C。从十月开始直到五月结束，每10天收集每只熊的血液样品。冬眠开始于一月初，结束于四月初。因此，采集日期包括活动的冬眠前期，废用冬眠期，和活动的冬眠后再活动期。通过放射免疫测定分析等份的l(HU熊血清中的骨钙蛋白浓度，一式两份(Patterson-Allen等人，1982;Anal.Biochem.，120,1-7)。该分析先前已经证实可用于熊(Donahue等人，2006;J.Exp.Biol.，209，1630-8)。抗体是豚鼠抗大鼠骨钙蛋白，示踪物是1251标记的大鼠骨钙蛋白。利用ELISA(PorcineIntactPTHELISAKit,#60-3305，Immutopics,Inc.，SanClemente,CA)分析等份的100nl熊血清中的PTH浓度，一式两份(Donahue等人，2006;J.Exp.Biol.，209，1630-8)。该分析物结合PTH的39-84区域，需要PTH的13-34区域来比色报告PTH浓度。因此，它提供一种良好的测量完整(1-84)PTH浓度以及C端亚片段7-84和11-84的方法。已经显示该ELISA与熊PTH交叉反应(Donahue等人，2006;J.Exp.Biol.，209，1630-8)，与人PTH具有100%的交叉反应性。为了证实该分析可用于黑熊，对包含10nM重组黑熊或者人PTH1-84的培养基样品一式两份进行分析。PTH样品的己知浓度与根据分析标准曲线确定的测量浓度进行比较。根据这些样品确定的交叉反应性中的任意可能差异被用于校正黑熊血清样品中的内源黑熊PTH浓度。重复上述用于重组黑熊PTH凋亡和利用培养的骨型细胞进行的基因表达细胞培养实验的步骤，用包含10%黑熊血清(来自冬眠前，冬眠期间，或者冬眠后)的培养基取代包含100nM重组PTH的培养基。在如上所述的PTHELISA后计算血清体积。与冬眠前血清相比，来自冬眠期间和冬眠后季节的血清引起更强的对凋亡的预防，因为在冬眠期间和冬眠后PTH比冬眠前血清中的更高。内源血清PTH浓度与凋亡水平负相关，因为更高的血清PTH水平对应于更低比例的凋亡，即血清PTH浓度与凋亡水平负相关。实施例9-熊PTH的体内试验黑熊PTH，或者全长(1-84)或者其若干功能亚片段之一(1-34;1-36;7-84;11-84;41-52)在体内测试其骨细胞合成代谢刺激，与等价物人PTH或者亚片段进行比较。合成各PTH多肽，悬浮在用于皮下注射的药学合适载体中。来自黑熊或者人的全长PTH或者其功能片段被给予小鼠，剂量为40pg/kg体重每日，共7周。在骨强度、质量和矿物含量方面黑熊PTH或者其功能片段引起比等价物人PTH多肽更大的增加。实施例10-熊PTH作为减少或者预防骨丢失的预防剂的用途通过后肢悬吊(骨质疏松症的废用模型)和通过卵巢切除术(骨质疏松症的绝经后模型)在小鼠中引发骨质疏松症。在后肢悬吊开始或者卵巢切除术完成后，给予小鼠常规剂量的黑熊PTH或者其功能片段。用黑熊PTH或者其功能片段处理的小鼠比未被处理的小鼠显示更少的骨丢失。实施例ll-熊和人PTHl-34均上调骨钙蛋白的基因表达，但只有熊PTH1-34降低Bax/Bcl-2的表达比例MC-3T3细胞在载体或者100nM合成的熊或者人PTH1-34中保温3或者6小时(n-2或者4)。分离总RNA，利用逆转录产生cDNA。利用PrimerQuest软件(IntegratedDNATechnologies,Coralville,IA)设计针对骨基质蛋白I型胶原和骨钙蛋白、促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2和管家基因Gapdh、P-肌动蛋白和亲环蛋白的引物。利用Mx3000P实时PCR系统(Stratagene,LaJolla，CA)进行实时PCR。所有样品一式两份进行测定。利用归一化到3个管家基因(Gapdh，J3-肌动蛋白和亲环蛋白)几何平均数的相对标准曲线方法测定基因表达。以Bax/Bcl-2表达比例对凋亡相关基因进行分析，因为该比例的降低与体外凋亡减少相关。与载体对照相比，在人或者熊PTH1-34中培养6小时不影响I型胶原的表达但基本上上调骨转蛋白的表达(图6)。人和熊PTH之间没有显著差异(p>0.09)。在熊PTH1-34中培养3小时降低Bax/Bcl-2的表达比例，表示凋亡减少，但在人PTHl-34中培养3小时增加该比例，表示凋亡增加(图7)。熊和人PTH之间的差异在统计学上有显著意义(p=0.047)。权利要求1.一种分离的多肽，其包括SEQIDNO2的至少10个连续氨基酸残基，其中所述多肽包括SEQIDNO2的氨基酸残基41和52中的至少一个。2.权利要求1的多肽，其中所述多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸残基11-84。3.权利要求1的多肽，其中所述多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸残基7-84。4.权利要求1的多肽，其中所述多肽包括SEQIDNO:2。5.—种编码权利要求1的多肽的分离的多核苷酸。6.权利要求5的分离的多核苷酸，其中所述多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸残基11-84。7.权利要求6的分离的多核苷酸，其中所述多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸残基7-84。8.权利要求7的分离的多核苷酸，其中所述多肽包括SEQIDNO:2。9.权利要求8的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括SEQIDNO:1。10.—种增加骨形成细胞中cAMP水平的方法，包括将骨形成细胞与有效量的包括SEQIDNO:2的氨基酸残基1-34的多肽接触，其中将所述骨形成细胞与所述多肽接触增加所述骨形成细胞中的cAMP水平。11.权利要求10的方法，其中所述多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸残基1-36。12.权利要求10的方法，其中所述多肽包括SEQIDNO:2。13.权利要求10的方法，其中所述骨形成细胞位于个体中。14.一种减少骨形成细胞凋亡的方法，包括将所述骨形成细胞与有效量的包括SEQIDNO:2的氨基酸残基1-34的多肽接触，其中将所述骨形成细胞与所述多肽接触减少所述骨形成细胞的凋亡。15.权利要求14的方法，其中所述多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸残基1-36。16.权利要求14的方法，其中所述多肽包括SEQIDNO:2。17.权利要求14的方法，其中所述骨形成细胞位于个体中。18.—种降低骨形成细胞中Bax蛋白与Bcl-2蛋白表达水平比例的方法，包括将所述骨形成细胞与有效量的包括SEQIDNO:2的氨基酸残基1-34的多肽接触，其中将所述骨形成细胞与所述多肽接触降低所述骨形成细胞中Bax蛋白与Bcl-2蛋白表达水平的比例。19.权利要求18的方法，其中所述多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸残基1-36。20.权利要求18的方法，其中所述多肽包括SEQIDNO:2。21.权利要求18的方法，其中所述骨形成细胞位于个体中。22.—种增加骨形成细胞中骨基质蛋白、转录激活物或者转录调节物中的一种或者多种的表达水平的方法，包括将所述骨形成细胞与有效量的包括SEQIDNO:2的氨基酸残基1-34的多肽接触，其中将所述骨形成细胞与所述多肽接触增加所述骨形成细胞中骨基质蛋白、转录激活物或者转录调节物的表达水平。23.权利要求22的方法，其中所述多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸残基1-36。24.权利要求22的方法，其中所述多肽包括SEQIDNO:2。25.权利要求22的方法，其中所述骨形成细胞位于个体中。26.—种在个体中增加骨矿物密度、增加骨量、减少骨丢失或者降低骨折发病率或者其任意组合的方法，包括将所述个体的骨形成细胞与有效量的包括SEQIDNO:2的氨基酸残基1-34的多肽接触，其中将所述骨形成细胞与所述多肽接触在所述个体中增加骨矿物密度、增加骨量、减少骨丢失或者降低骨折的发病率。27.权利要求26的方法，其中所述个体是患有骨质疏松症的绝经后妇女。28.权利要求26的方法，其还包括给予所述个体维生素D和钙。29.权利要求26的方法，其中所述多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸残基1-36。30.权利要求26的方法，其中所述多肽包括SEQIDNO:2。31.—种在个体中增加骨矿物密度、增加骨量、减少骨丢失或者降低骨折发病率或者其任意组合的方法，包括将所述个体的骨形成细胞与有效量的包括熊甲状旁腺素或者其功能片段的多肽接触，其中将所述骨形成细胞与所述多肽接触在所述个体中增加骨矿物密度、增加骨量、减少骨丢失或者降低骨折的发病率。32.—种针对权利要求1的多肽的抗体。33.—种基本上由SEQIDNO:2的氨基酸残基l-34组成的分离的多肽。34.—种基本上由SEQIDNO:2的氨基酸残基1-36组成的分离的多肽。全文摘要本发明提供了黑熊甲状旁腺素(PTH)和其功能片段。本发明还提供了使用黑熊PTH和功能片段增加骨形成细胞中的cAMP；减少骨形成细胞中的凋亡；降低骨形成细胞中Bax蛋白与Bcl-2蛋白表达水平的比例；增加骨形成细胞中一种或者多种骨基质蛋白、转录激活物或者转录调节物；在个体中增加骨矿物密度、增加骨量、减少骨丢失或者降低骨折的发病率，或者其任意组合的方法；本发明还提供了针对黑熊甲状旁腺素(PTH)和其功能片段的抗体。文档编号A61K38/48GK101355959SQ200680050702公开日2009年1月28日申请日期2006年11月13日优先权日2005年11月10日发明者S·W·多纳休申请人:密歇根理工大学管理委员会