专利名称：包含含有不可水解共价键的聚合物结合剂的药物组合物及其在治疗乳糜泻中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含聚合物结合剂的药物组合物及其使用方法。更具体地, 本发明涉及用于结合谷蛋白或麦醇溶蛋白和/或源自谷蛋白或麦醇溶蛋白 降解的肽的不可消化合成聚合物及其使用方法。
背景技术：
乳糜泻，又称为谷蛋白不耐受，是一种在遗传性易感对象中以接触面 筋的麦醇溶蛋白级分或大麦和黑麦的类似醇溶性蛋白(谷醇溶蛋白)之后 的小肠粘膜损伤为特征的综合征。乳糜泻是一种普通的自身免疫病症，其 具有遗传、环境和免疫上的因素。此疾病与编码人白细胞抗原DQ2和DQ8 的基因密切相关(1)。鉴别出a-麦醇溶蛋白的一种33个单位的片段，其 具有几个特征表明其为乳糜泻患者中对谷蛋白炎性应答的可能引发剂 (2)。
乳糜泻的症状可为从轻度虚弱、骨痛和口疮性口炎到慢性腹泻、■ 以及进行性体重减轻(3)。由于广泛的症状，乳糜泻的存在可能难于诊断。 那些受影响的患者遭受其肠固有层和隐窝区域的绒毛损伤(变短和绒毛扁 平化)(3)。此外，在患有未治疗或难治疗乳糜泻的患者中多达15%JtA 成胃肠道癌或淋巴瘤(4)。不含谷蛋白的饮食可预防此疾病的几乎所有并 发症(5)。这样的饮食涉及避免所有含有小麦、黑麦、大麦或其任何衍生 物的产品。这是个困难的任务，因为在很多加工食品的成分中可发现许多 隐藏的谷蛋白源。
迄今，除了从乳糜泻患者的饮食中排除含有谷蛋白的食物以外，还没 有可用于乳糜泻患者的药物疗法。出人意料地，相对为数不多的治疗策略 目前正在探索中。基于抗体耐受性和T细胞介导的对麦醇溶蛋白毒性肽的
应答或者基于阻断IL-15介导的小肠粘膜变化的抗IL-15的中和抗体的开 发的方法正在研究中(6)。 一个有希望的途径在于外源性酶的发现，所述 外源性酶可在原位迅速降解毒性肽(7 )。然而，与大自酶生产相关的高 成本和口服后可能的活性损失是其商业化的潜在限制。旨在干M蛋白活 性T细胞的活化的互补性策略包括抑制谷蛋白肽与人白细胞抗原(HLA) DQ2 (或DQ8)的结合。HLA在乳糜泻t艮中的关键作用使得其成为治 疗干预的明显标靶。最近解出的与脱^J^蛋白肽^的HLA-DQ2的X-射线晶体结构已提供了用于开发阻断HLA-DQ2的化合物的重要信息(8 )。 已提议连蛋白拮抗剂作为乳糜泻的治疗剂。连蛋白是一种涉及调节小肠内 分子间紧密结合的蛋白质。其表^4乳糜泻急性期期间已显示出增加，所 述乳糜泻急性期，渗透性增加的临床病况(9)。
对于具有低含量或不含免疫毒性序列但又具有合理的烘焙质量的谷类 的开发研究也已进行。可以通过对古老小麦品种的选择性培养(IO)、通过 涉及导致免疫激活序列的序列突变的转基因技术(11)或通过将无毒的谷 蛋白基因引入无害的有机体比如稻米内(12)而开发这些谷类。尽管这些 谷类在技术上对工程师来说是有希望的，但存在着这样的可能性含有谷 蛋白的谷类的交叉授粉可能会导致再51入免疫毒性序列，这些谷类的可获 得性会给患有乳糜泻的患者带来营养上较好的饮食。
聚合物结合剂(polymeric binder)
大量的聚合物结合剂已经用于治疗或预防某些疾病。
聚合物结合剂的经典实例是消胆胺，其为一种在肠内多价螯合胆酸并
因此降低胆固醇血液水平的阳离子树脂。近来，盐酸司维拉姆(一种不含
铝和钙、具有可忽略的副作用的新型聚合磷酸酯结合剂)已被商业化用于
治疗透析患者中的高磷血症。也许在该领域中最让人感兴趣的发现是阴离
子的高分子量聚合物GT160-246,其表现出在体外和在体内均中和 帥梭
菌(C7m加W/"附力j^c,7e) A毒素的活性(13 )。此内毒素最常被确认为是
感染性医院腹泻的原因。GT160-246提供了一种有前途且安全的非抗微生 物的治疗和预防人类中艰难梭菌结肠炎的方法。
高分子量聚合物可在乳糜泻中有潜在用途的这一想法源于 Auricchio等的研究(14)，这一研究证实了甘露聚糖(甘露糖同多糖) 和乙酰葡萄糖胺低聚物显示出对患有活性乳糜泻患者的肠粘膜样品的 保护作用(14)。这些发现表明，凝集且有毒的肽被这些碳水化合物所
结合。Secimdo等(26)探索了另一种多糖——糊精——对麦醇溶蛋白 二级结构的作用，并猜测糊精可用于制备用于患有乳糜泻的患者的无毒 食品衍生物。虽然有这些令人感兴趣的初步数据，但还未进行进一步的 研究以在体内证实这些发现。天然碳水化合物的主要缺点在于其在体内 条件下的可降解性，这将导致其在原位失活。
本发明试图满足这些需要以及其它的需要。
本说明书参考了大量文献，这些文献的内容均通过引用整体并入本文。
发明内容
更具体地，根据本发明的一个方面，提供了一种包含聚合物结合剂 和药学可接受载体的药物组合物，所述聚合物结合剂包含具有由不可水 解的共价键构成的主链的高分子量合成聚合物，所述聚合物能在pH低 于谷蛋白和源自谷蛋白降解的肽的等电点时形成静电键，并且能在胃肠 道中与谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽结合。
在所述药物组合物的一个具体实施方案中，所述聚合物结合剂能与 谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽形成疏水性相互作用。在所述药物组合物 的另一个具体实施方案中，所述聚合物结合剂能形成氢键。在所述药物 组合物的另 一个具体实施方案中，所述聚合物结合剂能在胃肠道中特异 性地与谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽结合。在所述药物组合物的另一个 具体实施方案中，所述聚合物结合剂能在肠道中与谷蛋白或源自谷蛋白 降解的肽结合。在所述药物组合物的另一个具体实施方案中，所述聚合 物结合剂是曱基丙烯酸羟乙酯(HEMA)与4-苯乙烯磺酸钠盐水合物 (SStNa)的共聚物。在所述药物组合物的另一个具体实施方案中，所 述聚合物结合剂是4-苯乙烯磺酸钠盐水合物(SStNa)的聚合物。在所 述药物组合物的另一个具体实施方案中，所述聚合物结合剂是曱基丙烯 酸磺酸丙酯钾盐(SPMAK)的聚合物。
在所述药物组合物的另一个具体实施方案中，所述聚合物结合剂是 线型的。在所述药物组合物的另一个具体实施方案中，所述聚合物结合 剂是星形的。在所述药物组合物的另一个具体实施方案中，所述聚合物 结合剂是3至18臂星形共聚物。在所述药物组合物的另一个具体实施 方案中，所述聚合物结合剂是5至18臂星形共聚物。在所述药物组合
物的另一个具体实施方案中，所述聚合物结合剂是5臂星形共聚物。在 所述药物组合物的另 一个具体实施方案中，所述聚合物结合剂是8臂星 形共聚物。在所述药物组合物的另一个具体实施方案中，所述聚合物结 合剂是18臂星形共聚物。在所述药物组合物的另一个具体实施方案中， 所述聚合物结合剂是HEMA与SStNa的共聚物，且HEMA/SStNa的摩 尔百分比之比为93.5/6.5到约1/99。在所述药物组合物的另一个具体实 施方案中，所述共聚物是线型的HEMA/SStNa (51.5/48.5，摩尔％)。在 所述药物组合物的另一个具体实施方案中，所述共聚物是线型的 HEMA/SStNa ( 43/57,摩尔％)。在所述药物组合物的另一个具体实施 方案中，所述共聚物的HEMA/SPMAK摩尔百分比之比为约93.5/6.5到 约1/99(%)。在所述药物组合物的另一个具体实施方案中，所述共聚 物的HEMA/SPMAK摩尔百分比之比为约86/14到约1/99。
在所述药物组合物的另一个具体实施方案中，所述共聚物是线型的 HEMA/SPMAK ( 45/55，摩尔％ )。
在另一个具体实施方案中，本发明的药物组合物还包含连蛋白拮抗 剂或HLA DQ2抑制剂。
根据本发明的另 一个方面，提供了使用本发明的聚合物结合剂的方 法，包括给患有乳糜泻的患者施用药物有效量的所述聚合物结合剂。
在一个具体实施方案中，本发明的方法用于在患者内结合谷蛋白或 源自谷蛋白降解的肽。
在另一个具体实施方案中，本发明的方法用于减少谷蛋白在患者体 内降解成毒性肽。
在另一个具体实施方案中，本发明的方法用于减少谷蛋白或源自谷 蛋白降解的肽与患者的胃肠道粘膜的相互作用。
在本发明另 一个具体实施方案中，所述施用在所述患者进食含有谷 蛋白的膳食之前或期间进行。在本发明方法的另一个具体实施方案中， 所述施用在所述患者进食含有谷蛋白的膳食之后进行。
根据本发明的另 一方面，提供了本发明的聚合物结合剂在制备药物 中的用途。
根据本发明的另 一方面，提供了本发明的聚合物结合剂用于在有此 需要的患者的胃肠道内结合谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽的用途。
根据本发明的另 一方面，提供了本发明的聚合物结合剂在制备用于 在有此需要的患者的胃肠道内结合谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽的药 物中的用途。
根据本发明的另 一方面，提供了本发明的聚合物结合剂用于减少谷 蛋白或源自谷蛋白降解的肽与有此需要的患者的胃肠道粘膜的相互作 用的用途。
根据本发明的另 一方面，提供了本发明的聚合物结合剂在制备用于 减少谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽与有此需要的患者的胃肠道粘膜的 相互作用的药物中的用途。
根据本发明的另 一方面，提供了本发明的聚合物结合剂用于减少谷 蛋白在有此需要的患者的胃肠道内降解成毒性肽的用途。
根据本发明的另 一方面，提供了本发明的聚合物结合剂在制备用于 减少谷蛋白在有此需要的患者的胃肠道内降解成毒性肽的药物中的用 途。
在本发明的用途的一个具体实施方案中，所述患者患有乳糜泻。 根据本发明的另一方面，提供了包含本发明的聚合物结合剂的食
物o
在本发明的食物的一个具体实施方案中，所述食物是含有谷蛋白的 食物。在本发明的食物的一个具体实施方案中，所述食物是面包。
根据本发明的另一方面，提供了一种使用本发明的食物的方法，包 括给患有乳糜泻的患者在其进食期间施用所述食物。在一个具体实施方 案中，本发明的方法用于结合所述患者的膳食中所含有的谷蛋白或源自 谷蛋白降解的肽。在另一个具体实施方案中，本发明的方法用于减少所 述患者的膳食中所含有的谷蛋白降解成毒性肽。在一个具体实施方案 中，本发明的方法用于减少谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽与所述患者的 胃肠道粘膜的相互作用。
根据本发明的另 一方面，提供了 一种制备供给患有乳糜泻的患者的 食物的方法，所述方法包括将本发明的聚合物结合剂加入到所述食物 中。在本发明方法的一个具体实施方案中，所述食物是含有谷蛋白的食物。
本发明涉及高分子量的惰性、不可吸收的聚合物结合剂，其用来吸 附谷蛋白和/或其降解产物。这样的体系将有助于预防或减少谷蛋白对 胃肠道粘膜的有害作用。不受此限制，猜测肽与所述聚合物的结合有两 个作用。首先，所述酶解和毒性片段的产生通过谷蛋白和/或其降解产 物吸附到惰性支持物上而减緩。其次，与高分子量聚合物的络合减少了 肽的吸收和随后的免疫应答。因此，此体系提供了一种供面临不能确定 不存在谷蛋白残留或不可获得不含谷蛋白的膳食的情况的患者的预防 佐剂。
尽管在本文中提出了具体的不可消化的合成聚合物，但本发明并非 限定于此。如本文中所使用的，当用于限定本发明的聚合物时，术语"不 可消化"意指具有由不可水解的共价键构成的主链的聚合物。相信本领 域普通技术人员可容易地确定可根据本发明使用的其它不可消化的合 成聚合物。同样，可最优化本文中所具体描述的聚合物以使其与谷蛋白 及谷蛋白降解产物的亲和力最大化并使其与其它蛋白的结合最小化。当 然， 一定比例的这些蛋白/肽将免于被吸附到本发明的聚合物上，但已
表明，每日摄取4-14mg的麦醇溶蛋白不会引起乳糜泻患者的小肠粘膜 损伤(15)。当然，这一体系不会作为主要疗法取代不含谷蛋白的饮食。 然而，当患者面临不能确定不存在谷蛋白残留或不可获得不含谷蛋白的 膳食的情况时，其可偶尔用作预防佐剂。
本发明的聚合物结合剂可有利地减少谷蛋白和源于谷蛋白的肽的 口服吸收。这些聚合物结合剂在胃肠道中起作用而不被吸收到血流中， 从而使聚合物本身引起不良反应的可能性最小化。在低于谷蛋白和源于 谷蛋白的肽的等电点的pH下，所述聚合物结合剂带负电荷而这些蛋白 和肽带正电荷，这使得可形成静电相互作用。这些聚合物结合剂还可与 这些蛋白和肽形成疏水性相互作用。在具体实施方案中，本发明的聚合 物结合剂还具有形成氢键的能力。尽管最后的性质可能是所希望的，但 表明其并非是必需的，因为发现本发明的某些不具备此性质的聚合物 (例如曱基丙烯酸磺酸丙酯钾盐(SPMAK)的均聚物)也能与谷蛋白 结合。不受此限制，可使用下表l中列出的单体合成这些聚合物结合剂。 本领域普通技术人员可选择这些(或其它)单体中的一种或更多种的组 合以形成本发明的聚合物结合剂
苯乙烯衍生物
-苯乙烯磺酸盐/酯
-苯乙烯硫酸盐/酯
-苯乙烯磺胺酸盐/酯
-磺苯基丙氨酸
-酪氨酸硫酸盐/酯
-磺基苯乙基丙烯酰胺
-磺基苯乙基甲基丙烯酰胺
-乙烯基萘磺酸盐/酯
-乙烯基萘硫酸盐/酯
画乙烯基联苯磺酸盐/酯
國乙烯基联^it酸盐/酯
-茴香脑磺酸盐/酯
-具有冠醚部分的苯乙烯
-被N,N-二烷基酰氨基取代的苯乙烯 -4-甲氧基苯乙烯
4-P-(N，N-二甲基氨基)乙基)苯乙烯
一P-(N,N-二甲基氨基)甲基)苯乙烯
-4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙基)苯乙烯
-4-二(]\,1^-二乙基氨基)膦基-a-甲基苯乙烯
-4-乙烯基苯酚
-3-乙烯基儿茶酚
-4-乙烯基苯乙酮
-4-乙烯基苯甲酸
-3-乙烯基苯曱酸
-2-(4-乙烯基苯基)-l，3-二氧戊环
-2-(4-乙烯基苯基)-1，3-二氧杂环己烷
-4-二甲氧基甲基苯乙烯-(4-乙烯基苯甲醛二甲基缩醛)
-2-(2-乙烯基苯基)-l,3-二氧戊环
-2-(3-乙烯基苯基)-1,3-二氧戊环
画l画(4-乙烯基苯基)-4-甲基-2,6，7-三氧杂二环[2.2.2辛烷
-4-(2-羟乙基)苯乙烯
-4-(3-羟丙基)苯乙烯
-4-{[4-(4-乙烯基苯基)丁氧基甲基}-1-甲基-2,6,7-三氧杂二环[2.2.2辛烷
-4-乙烯基苯石危酚
-4-(2-巯基乙基)苯乙烯
-2-(4-乙烯基苯基)-2-嚅唑啉
-N，N-二乙基-4-乙烯基苯磺酰胺
-N-曱基-N，- [(4-乙烯基苯基)磺酰基哌噢
-4-氨基苯乙烯
-3-氨基苯乙烯
-4-氨基曱基苯乙烯
-3-氨基甲基苯乙烯
-4-(2-氨基乙基)苯乙烯
带有羟基的苯乙烯
-(对乙烯基苯甲酰氨基)-P-壳二糖
-(对乙烯基苯甲酰氨基)-p-乳糖
-N-(对乙烯基节基)-L-古洛糖酸酰胺(gulonamide)
-N-(对乙烯基节基)-6-D-葡糖二酸酰胺(glucaramide)
-N-(对乙烯基节基)-6-D-葡糖二酸酰胺-l-酯
-4-丙烯酰氨基苯基-p-乳糖普
-N-(对乙烯基爷基)-D-葡萄糖醛酸酰胺(glucoronamide)
-4-乙烯基节基-D-葡萄糖(D-甘露糖)己糖醇
-对P-[N-(对乙烯基千基)氨甲酰基乙基苯基a-D-吡喃甘露糖苷
-对[2-[N-(对乙烯基节基)氨甲酰基乙基苯基p-D-吡喃甘露糖苷
國N-(对乙烯基爷基)-5
\-丙烯酰基-氨基乙氧基4-0-(p-D-吡喃半乳糖基)-p-D-吡喃葡萄糖苷 (及硫酸化衍生物)
-N-马来酰胺-2-脱氧-葡萄糖钠盐
-N-马来酰胺-l-脱氧-乳糖醇钠盐
-岩藻糖-7-氧杂降水片烯衍生物
-C-Glc-7-氧杂降水片烯衍生物
-C-Man-7-氧杂降冰片烯衍生物
含不对称葡萄糖的7-氧杂降水片烯衍生物
-O-Glc-7-氧杂降水片烯衍生物
-O-Man-7-氧杂降水片烯衍生物
含不对称甘露糖的7-氧杂降水片烯衍生物
-O-Man降水片烯衍生物
-糖衍生的聚(7-氧杂降水片烯)
-糖衍生的聚(降水片烯)
当本发明的聚合物结合剂具有由不可水解的共价键构成的主链时，
其也可包含含有可水解共价键的侧链。
本文中所用的术语"谷蛋白"指在各种谷物中所发现的蛋白族
(protein group )。可将谷蛋白分级为乙醇可溶的谷醇溶蛋白和乙醇不 溶的麦谷蛋白。来自小麦、黑麦、大麦和可能的燕麦的醇溶性谷醇溶蛋 白在乳糜泻患者中是有毒的。小麦谷醇溶蛋白的共同特征是高含量的谷 氨酰胺(>30%)和脯氨酸(>15%)。小麦谷醇溶蛋白被分为a/p、 y和 o)麦醇溶蛋白，其含有富含谷氨酰胺和脯氨酸的相似或重复的肽抗原决 定簇，所述肽抗原决定簇似乎是所观察到的谷蛋白毒性的原因。
本文中所用的术语"源自谷蛋白降解的肽"指在谷蛋白摄取后会合 乎需要地与本发明的聚合物结合的任何源自谷蛋白降解的肽。不受此限 制，其包括列于Ciccocioppo中的所有肽(23 )。
本文中所用的术语"高分子量聚合物"指分子量为5000-5000000 g/mol的聚合物。
本文中所用的术语"药学可接受载体"指利用常用赋形剂(比如在 Modern Pharmaceutics (27)中描述的那些)制备的溶液、混悬液、乳 液、片剂或胶嚢。
本文中所用的术语本发明聚合物的"药物有效量，，指在有此需要的 患者摄取谷蛋白后可有效降低谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽与胃肠道 粘膜的相互作用的量。不受此限制，本发明聚合物的有效量可为约200 mg至约15 g每天(例如200 mg^ 250 mg^ 300 mg^ 500 mg^ 750 mgs lg^ 1.5 g;2g; 2.5 g; 3 g， 5 g; 7.5 g)。
本文在表述"特异性地与谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽结合的聚合 物结合剂"中所用的术语"特异性结合，，指在胃肠道中相比于与其它的食 物蛋白(比如酪蛋白和/或白蛋白)的结合，所述聚合物与源自食物摄 入的疏水性的蛋白质或肽(比如谷蛋白和源自谷蛋白的肽)结合得更多 的能力。
本发明包括线型或星形的聚合物。根据本发明的具体实施方案，星 形聚合物具有3~18个臂。
本文中所用的术语"有此需要的患者，，指受乳糜泻影响的人，其正在 食用或已经食入含有谷蛋白的膳食。
本文中不用数词表示或者冠以"所述(该/此)"指一个或多于一个(即
至少一个)的如此限定的语法对象。
本文中所用的术语"包括"和"包含"指表述"包括但不限于"和"包含 但不限于"，并可互换使用。
本文中所用的术语"比如(例如)"意指"比如(例如)但不限于"， 并可互换使用。
在阅读以下仅通过实例方式给出并参考附图对本发明具体实施方 案所作的非限制性描述时，本发明的其它目的、优点和特征将更加显而 易见。
在附图中
图l表示用于合成本文中所述的聚合物的线型和多官能团的ATRP 引发剂的化学结构。(i) PEG-二溴代大分子引发剂(macroinitiator); (ii) -1,2,3,4,6-五-0-异丁酰溴-11-0-葡萄糖；(iii)十八-O-异丁酰溴-R-环糊精；(iv)八-O-异丁酰溴-蔗糖；
图2表示三份相同的在pH 6.8下白蛋白和a-麦醇溶蛋白与聚 (HEMA-共-SStNa)结合的SDS-PAGE (实施例10): ( A)蛋白标准物； (B)白蛋白和a-麦醇溶蛋白混合物；(C)白蛋白(40mg/L)、 a-麦醇溶 蛋白(40 mg/L)和聚(HEMA-共-SStNa)(160 mg/L)的混合物；
图3是线型聚(HEMA-共-SStNa)与麦醇溶蛋白、白蛋白以及酪蛋白 在pH 1.2和6.8下的结合语，其中每个点对应于实施例5~10和12~13 的每个聚合物；
图4是线型聚(HEMA-共-SPMAK)与麦醇溶蛋白和白蛋白在pH 1.2 和6.8下的结合镨，其中每个点对应于实施例17~21的每个聚合物；
图5以图示表示在中性pH下聚合物结构对麦醇溶蛋白的结合的影 响(SStNa = 25-31摩尔％; ^见实施例9、 14、 15和16);
图6以图示表示在中性pH下聚合物结构对麦醇溶蛋白的结合的影 响(SPMAK= 16-19摩尔％;参见实施例18、 22、 23和24);
图7表示在模拟肠条件下本发明聚合物对麦醇溶蛋白消化的影响。 在(a)不存在聚合物和(b)存在聚合物的情况下用胃蛋白酶、胰蛋白 酶和胰凝乳蛋白酶(PTC)消化的麦醇溶蛋白的比较HPLC谱图。色镨
图(c)对应于未处理的a-麦醇溶蛋白；
图8表示在采用PEG (Mn: 35，000;空心圆形)、PVP ( Mw: 58,000; 实心矩形)、聚(HEMA-共-SStNa)(实施例10;空心三角形)和作为对 照的完全培养基(实心星形)的溶液孵育后Caco-2单层的跨上皮细胞 电阻(TEER)的变化。将细胞保持在添加了 10% FBS的DMEM细胞 培养基中。聚合物浓度固定在lg/L;和
图9表示两种含有约50% SStNa并具有两个不同分子量的线型聚 (HEMA-共-SStNa)(实施例10和11)在pH 1.2和6.8下与麦醇溶蛋白 和白蛋白的结合镨。
具体实施例方式
材料
a-麦醇溶蛋白由lnstitut National de la Recherche Agronomique， (Nantes, France)惠供。其如Popineau等人所i^4M^小麦(soft wheat) 中纯化而得(16-21)。简而言之，在将来自M (从面粉中分离)的粗麦 醇溶蛋白提取后，将麦醇溶蛋白亚族分离并依次通过离子交换色谱、尺寸 排阻色谱和最后的疏水性相互作用色镨进行纯化。
牛白蛋白购自Serological Proteins(Kankakee, IL)。 a-酪蛋白(来自牛 奶)、SStNa、 HEMA、 SPMAK、 R-D-葡萄糖、a-环糊精7JC合物、蔗糖(98%)， 聚(乙二醇)(PEG) (Mn 2000)、 2-溴代异丁酰溴、溴化铜Cu(I)Br和2，2，联 吡咬均购自Sigma-Aldrich (St Louis, MO)并原样使用。Eppendorff管、吸 液头和96孑L^L( Maximum Recovery )由Axygen Scientific (Union City, CA) 提供。
引发剂的合成
由PEG、 R-D-葡萄糖、蔗糖和(x-环糊精制备原子转移自由基聚合 (ATRP)引发剂(图1)。最后三个分子的溴官能化通过由 Stenzel-Rosenbaum及合作者们所描述的方法而实现(22 )。
通过以下非限定性实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
PEG 二溴代大分子引发剂(i)的合成 将HO醒PEG-OH (Mn 2000,10 g， 5 mmol)和三乙胺(10 g， 0.1 mol)在
70 ml无水甲苯中的溶液在水水浴中稍微冷却。然后，向所述Jl应混合物 中緩慢加入2-溴代异丁酰溴(4.91 mL， 0.04 mol )。将溶液温热至室温并搅 拌48小时。过滤混合物，蒸发一半的溶剂并在冷乙醚中沉淀PEG大分子 引发剂(图1 (i))。
沉淀后的产率卯％。白色固体。ifl[ NMR (5， ppm， CDC13): 3.50 (188H)， 1.80 (12H,s)。
实施例2
1,2,3，4,6-五-0-异丁酰溴-R-D-葡萄糖(ii)的合成
将2-溴代异丁酰溴(50 g, 0.22 mol)緩慢加入到在氯仿(100 mL )和 吡咬(50 mL )的无水混合物中的R-D-葡萄糖溶液(5.0 g, 0.028 mol)中。 将溶液回流3小时并同时保持无水气氛，然后于室温下再搅拌12个小时。 然后将其依次以冰冷的水、NaOH (0.1 M)和水清洗，并以无水MgS04 干燥。将粗产物从曱醇中重结晶而得到白色晶体(图1 (ii))。
产率70o/o。
1H NMR (CDCI3): 1.85-2.04 (m, 30H, H-7), 6.42 (d,1H, H-
U 5.25 (dd,1H， H-2), 5.69 (t, 1H, H-3), 5.35 (t, 1H， H~4)， 4.38 (m. 3H, H-5/6).
实施例3
十八-O-异丁酰溴-R-环糊精(iii)的合成
通过向R-环糊精(5.0 g, 0.005 mol)在无水吡咬(150 mL)中的溶液 中緩慢加入2-溴代异丁酰溴(50 g, 0.22 mol)而合成十zVO-异丁酰溴-R-环糊精。在无水气氛下于室温下搅拌溶液24小时。然后将其分别以水冷的 水、NaOH (0.1 M)和水清洗，然后以无水MgS04干燥。将粗产物从甲醇 /H20 (3:1,v/v)中重结晶而得到白色晶体(图1 (iii))。
产率55%。1H NMR (CDCI3>: 1.95 (m, 108H, H-7), 5,84 (d， 12H， H-
1), 4.46 (dd, 6H， H-2>, 5.7 (m， 6H, H-3)， 5.13/5.38 (t/dd, 6H, H~4). 4.78 (dd, 6H, H-5), 4.45 (m, 6H， H-6).
实施例4
八-O-异丁酰溴-蔗糖(iv)的合成
通过向蔗糖(5.0 g， 0.014 mol)在无水吡咬(150 mL )中的溶液中緩 慢加入2-溴代异丁酰溴(50 g, 0.22 mol)而合成八-O-异丁酰溴蔗糖。在无
水气氛下于室温下搅拌溶液24小时。然后将其分别以水冷的水、NaOH (0.1 M)和水清洗，然后以无水MgS04干燥。将粗产物从甲醇/1120 (3:l,v/v) 中重结晶而得到白色晶体(图1 (vi))。
产率.50o/o。 1H NMR (CDCls): 1.99 (m, 48H， H-7)， 4,15 (d, 1H, H-5')，
4.46 (m, 5H, H-67175)' 4.68 <dt, 2H， H-6)， 4.81 (d, 1H, H-3')， 5.13 (dd， 1H， H-2), 5.38 (t, 1H, H4')， 5.67 (t， 1H, H~4), 5.76 (t,1H, H-3)， 5.85 (d, 1H, H-1).
实施例5
线型甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA) /4-苯乙烯磺酸钠盐水合物(SStNA)
共聚物(纯化后93.5/6.5摩尔％ )的合成
将ATRP引发剂i (图1) (50 mg )、 SStNa (0.375 g)和HEMA (7.12 g)溶于46 mL甲醇/水(1/4)混合物中并在氩气下脱气15分钟。然后在 搅拌下于20'C下加入Bpy (20.28 mg) 、 Cu(I)Br (7.2 mg)和Cu(II)Br2 (3.35 mg)。 24小时后，将溶液暴露于空气中，深褐色溶液变成蓝色，这 表明Cu(I)被氧化成了 Cu(II)。通过将甲醇/水溶液通过皿柱(除去Cu(II) 催化剂)而纯化所述聚合物。将聚合物逆水透析(Spectra/PorTMno.l，截留 分子量6000-8000, Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA) 48小 时，然后冻干直至4吏用。Mw = 318700 g/mol; Mw/Mn = 2.54。
实施例6
线型甲基丙烯酸羟乙酯/4-苯乙烯磺酸钠盐水合物
共聚物(纯化后卯.3/9.7摩尔％ )的合成
将ATRP引发剂i (图1) (50 mg )、 SStNa (0.375 g)和HEMA (7.12 g)溶于46 mL曱醇/水(1/4 )混合物中并在氩气下脱气15分钟。然后在 搅拌下于20。C下加入Bpy (21.84 mg) 、 Cu(I)Br (7.2 mg)和Cu(II)Br2 U.48mg)。 24小时后，将溶液暴露于空气中，并按实施例5中叙述的方 法纯化聚合物。Mw = 331528, Mw/Mn = 2.9。
实施例7
线型甲基丙烯酸羟乙酯/4-苯乙烯磺酸钠盐7K合物 共聚物(纯化后87.8/12.2摩尔％)的合成 将ATRP引发剂i (图1) (50 mg )、 SStNa (0.75 g)和HEMA ( 6.747g)
溶于46 mL甲醇/水(1/4 )混合物中并在氩气下脱气15分钟。然后在搅拌 下于20。C下加入Bpy (15.6 mg)和Cu(I)Br (7.2 mg)。 24小时后，将溶 液暴露于空气中，并按实施例5中叙述的方法纯化聚合物。Mw = 283600 g/mol; Mw/Mn = 2.57。
实施例8
线型曱基丙烯酸羟乙酯/4-苯乙烯磺酸钠盐水合物
共聚物(纯化后82.4/17.6摩尔％)的合成
将ATRP引发剂i (图1) (50 mg )、 SStNa (1.125 g)和HEMA ( 6.426 g)溶于46 mL甲醇/水(1/4)混合物中并在氩气下脱气15分钟。然后在 搅拌下于20。C下加入Bpy (15.6mg)和Cu(I)Cl (5mg)。 24小时后，将 溶液暴露于空气中，并按实施例5中叙述的方法纯化聚合物。Mw = 275500 g/mol; Mw/Mn = 2.5。
实施例9
线型甲基丙烯酸羟乙酯/4-苯乙烯磺酸钠盐水合物
共聚物(纯化后69/31摩尔％ )的合成
将ATRP引发剂i (图1) (50 mg )、 SStNa (1.5 g)和HEMA ( 5.99 g) 溶于46 mL曱醇/水(1/4 )混合物中并在氩气下脱气15分钟。然后在搅拌 下于20。C下加入Bpy (15.6mg)和Cu(I)Cl (5mg)。 24小时后，将溶液 暴露于空气中，并按实施例5中叙述的方法纯化聚合物。MW = NA; Mw/Mn =NA。 Mn "MR) = 58100 g/mol。
实施例10
线型甲基丙烯酸羟乙酯/4-苯乙烯磺酸钠盐水合物
共聚物(纯化后51.5/48.5摩尔％)的合成
将ATRP引发剂i (图1) (50 mg )、 SStNa (3.2 g)和HEMA (3.95 g) 溶于46 mL甲醇/水(1/4)混合物中并在氩气下脱气15分钟。然后在搅拌 下于20。C下加入Bpy (15.6 mg)和Cu(I)Br (7.2 mg )。 24小时后，将溶 液暴露于空气中，并按实施例5中叙述的方法纯化聚合物。Mw = 122000 g/mol; Mw/Mn = 2.23。
实施例11
线型甲基丙烯酸羟乙酯/4-苯乙烯磺酸钠盐7JC合物
共聚物(纯化后43/57摩尔％ )的合成
将ATRP引发剂i (图1) (50 mg )、 SStNa (2.4 g)和HEMA (1 g) 溶于23 mL甲醇/水(1/4 )混合物中并在氩气下脱气15分钟。然后在搅拌 下于20。C下加入Bpy (15.6 mg)和Cu(I)Br (7.2 mg)。 24小时后，将溶 液暴露于空气中，并按实施例5中叙述的方法纯化聚合物。Mn (nmr)= 55000 g/mol。
实施例12
线型甲基丙烯酸羟乙酯/4-苯乙烯磺酸钠盐水合物
共聚物(纯化后28/72摩尔％)的合成
将ATRP引发剂i (图1) (50 mg )、 SStNa (4.8 g)和HEMA (1.975 g)溶于46 mL甲醇/水(1/4)混合物中并在氩气下脱气15分钟。然后在 搅拌下于20。C下加入Bpy (15.6 mg)和Cu(I)Br (7.2 mg )。 24小时后， 将溶液暴露于空气中，并按实施例5中叙述的方法纯化聚合物。Mw = 65200 g/mol;Mw/Mn = 1.95。
实施例13
线型聚(4-苯乙烯磺酸钠盐水合物)的合成
将ATRP引发剂i (图1) (50 mg)和SStNa ( 6.4 g)溶于46 mL水中 并在氩气下脱气15分钟。然后在搅拌下于20。C下加入Bpy (15.6 mg)和 Cu(I)Br (7.2 mg )。 24小时后，将溶液暴露于空气中，并按实施例5中叙 述的方法纯化tl^合物。Mw = NA ; Mw/Mn = NA。 Mn (nmr) = 20000 g/mol。
实施例14
线型聚(4-苯乙烯磺酸钠盐水合物)的合成
将ATRP引发剂i (图1) (50.3 mg)和SStNa (1.56 g)溶于20 mL 水中并在氩气下脱气15分钟。然后在搅拌下于20。C下加入Bpy (15.6 mg) 和Cu(I)Br ( 7.2 mg )。 24小时后，将溶液暴露于空气中，并按实施例5中 叙述的方法纯化聚合物。Mw = NA ; Mw/Mn = NA。 Mn (nmr) = 57500 g/mol。
实施例15
5臂星形曱基丙烯酸羟乙酯/4-苯乙烯磺酸钠盐7jC合物
共聚物(纯化后69/31摩尔％ )的合成
将ATRP引发剂ii(图1)(142.6 mg )、 SStNa( 1.55 g )和HEMA( 4.616 g)溶于30 mL曱醇/水(8/1)混合物中并在氩气下脱气15分钟。然后在 搅拌下于20。C下加入Bpy (230.75 mg)和Cu(I)Br (106 mg )。反应1小 时后，加入IO mL水，然后将溶液在室温保持24小时。最后按实施例5 中叙述的方法纯化相应的共聚物。Mw = 85000 g/mol; Mw/Mn = 1.79。
实施例16
8臂星形甲基丙烯酸羟乙酯/4-苯乙烯磺酸钠盐7jC合物
共聚物(纯化后75/25摩尔％ )的合成
将ATRP引发剂iv (图1) (141 mg )、 SStNa (1.5 g)和HEMA (4.616 g)溶于30 mL甲醇/水(8/1)混合物中并在氩气下脱气15分钟。然后在 搅拌下于20。C下加入Bpy (230.8 mg)和Cu(I)Br (106 mg )。反应1小时 后，加入10mL水，然后将溶液在室温保持24小时。最后按实施例5中 叙述的方法纯化相应的共聚物。Mw = 210000 g/mol; Mw/Mn = 2.03。
实施例17
18臂星形甲基丙烯酸羟乙酯/4-苯乙烯磺酸钠盐7jC合物
共聚物(纯化后69/31摩尔％)的合成
将ATRP引发剂iii (图1) (153.5 mg )、 SStNa (1.5 g)和HEMA (4.62 g)溶于30 mL甲醇/水(8/1)混合物中并在氩气下脱气15分钟。然后在 搅拌下于20。C下加入Bpy (230.75 mg)和Cu(I)Br (106 mg )。反应1小 时后，加入IO mL水，然后将溶液在室温保持24小时。最后按实施例5 中叙述的方法纯化相应的共聚物。Mw = 206000 g/mol; Mw/Mn = 2.6。
实施例18
线型甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA) /甲基丙烯酸磺酸丙酯钾盐(SPMAK)
共聚物(纯化后86/14摩尔％ )的合成
将ATRP引发剂i (图1) (100.3 mg )、 SPMAK (1.85 g)和HEMA (5.62 g)溶于30 mL甲醇中并在氩气下脱气15分钟。然后在搅拌下于20'C 下加入Bpy (31.96 mg)和Cu(I)Br (15.1 mg)。 24小时后，将溶^J^露 于空气中，并按实施例5中叙述的方法纯化聚合物。MW = NA;MW/Mn = NA。 Mn (N證)=66500 g/mol。
实施例19
线型甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA) /甲基丙烯酸磺酸丙酯钾盐(SPMAK)
共聚物(纯化后83/17摩尔％)的合成
将ATRP引发剂i (图1) (102.1 mg )、 SPMAK (1.90 g)和HEMA (5.62 g )溶于30 mL曱醇中并在氩气下脱气15分钟。然后在搅拌下于20'C 下加入Bpy (31.24 mg)和Cu(I)Br (14.34 mg)。 24小时后，将溶液暴露 于空气中，并按实施例5中叙述的方法纯化聚合物。Mw = NA ; Mw/Mn = NA。 Mn(NMR)= 84000 g/mol。
实施例20
线型甲基丙烯酸羟乙酯/甲基丙烯酸磺酸丙酯钾盐
共聚物(纯化后74/26摩尔％)的合成
将ATRP引发剂i (图1) (100.5 mg )、 SPMAK (3.75 g)和HEMA (5.622 g)溶于46 mL甲醇/水(1/1)混合物中并在氩气下脱气15分钟。 然后在搅拌下于20。C下加入Bpy (32 mg)和Cu(I)Br (15.1 mg)。 24小 时后，将溶液暴露于空气中，并按实施例5中叙述的方法纯化聚合物。Mw =NA ; Mw/Mn = NA。 Mn ,) = ll卯OO g/mol。
实施例21
线型甲基丙烯酸羟乙酯/曱基丙烯酸磺酸丙酯钾盐
共聚物(纯化后45/55摩尔％)的合成
将ATRP引发剂i (图1) (100.7 mg )、 SPMAK (5.64 g)和HEMA (1.752 g)溶于46 mL甲醇/水(1/1)混合物中并在氩气下脱气15分钟。 然后在搅拌下于20。C下加入Bpy (32 mg)和Cu(I)Br (15.1 mg)。 24小 时后，将溶液暴露于空气中，并按实施例5中叙述的方法纯化聚合物。Mw =NA ; Mw/Mn = NA。 Mn ,r) = 108500 g/mol。
实施例22
线型聚(甲基丙烯酸磺酸丙酯钾)的合成
将ATRP引发剂i (图1) (100.7 mg)和SPMAK (7.5 g)溶于46 mL 甲醇/水(1/1)混合物中并在氩气下脱气15分钟。然后在搅拌下于20'C下 加入Bpy (32 mg )和Cu(I)Br (15.1 mg )。 24小时后，将溶液暴露于空气中，并按实施例5中叙述的方法纯化聚合物。Mw = NA ; Mw/Mn = NA。 Mn(NMR)= 120000 g/mol。
实施例23
5臂星形曱基丙烯酸羟乙酯/甲基丙烯酸磺酸丙酯钾
共聚物(纯化后82.4/17.6摩尔％)的合成
将ATRP引发剂ii(图1)(143 mg )、 SPMAK( 1.87 g )和HEMA( 4.61 g)溶于60 mL甲醇/水(8/1)混合物中并在氩气下脱气15分钟。然后在 搅拌下于20。C下加入Bpy (230.6 mg)和Cu(I)Br (108 mg )。 24小时后， 将溶液暴露于空气中，并按实施例5中叙述的方法纯化聚合物。Mw = 161000 g/mol; Mw/Mn = 2.4。
实施例24
8臂星形甲基丙烯酸羟乙酯/曱基丙烯酸磺酸丙酯钾
共聚物(纯化后81/19摩尔％ )的合成
将ATRP引发剂iv (图1) (70.5 mg )、 SPMAK (0.935 g)和HEMA (2.3 g)溶于60 mL甲醇/水(8/1)混合物中并在氩气下脱气15分钟。然 后在搅拌下于20'C下加入Bpy (115.8 mg)和Cu(I)Br (53.9 mg )。 24小 时后，将溶液暴露于空气中，并按实施例5中叙述的方法纯化聚合物。Mw =227000 g/mol; Mw/Mn = 2.27。
实施例25
18臂星形曱基丙烯酸羟乙酯/曱基丙烯酸磺酸丙酯钾
共聚物(纯化后82.4/17.6摩尔％)的合成
将ATRP引发剂iii (图1) (75.3 mg )、 SPMAK (0.923 g)和HEMA (2.31 g)溶于60 mL甲醇/水(8/1)混合物中并在氩气下脱气15分钟。 然后在搅拌下于20。C下加入Bpy (115.8 mg)和Cu(I)Br (53.9 mg)。 24 小时后，将溶^L&露于空气中，并按实施例5中叙述的方法纯化聚合物。 Mw = 342000 g/mol; Mw/Mn = 2.28。
实施例26
聚合物-麦醇溶蛋白结合的评价
通过十二烷^i^酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE )，使用15 %(W/V)分离凝胶评价麦醇溶蛋白与合成聚合物的结合选择性和亲和力。此
外，还对聚合物对对照蛋白(即牛白蛋白和/或牛S^白)的反应性分别进 行了筛选。在pH 1.2和6.8时分别使用盐酸和磷酸盐緩沖液进行结合研究。 在pH 1.2和6.8时将聚合物(80 mg/L)和蛋白质(40 mg/L )混合在一起 并孵育2小时。然后将溶液在15000 g下离心30分钟以从溶液中残留的游 离蛋白中分离出不溶性#物。然后通过SDS-PAGE分析上清液以测定游 离蛋白质的量。
实施例27
聚(HEMA-共-SStNa)与麦醇溶蛋白结合的选择性
如实施例26中所述，通过SDS-PAGE评价麦醇溶蛋白与不同线型聚 (HEMA-共-SStNa)(在实施例5~10和12-14中报道了合成)的结合亲和 力，并与在肠pH (6.8)和胃pH (1.2)下白蛋白和酪蛋白的结合亲和力 进行比较(图3显示了实施例5 10和12-13 )。 一般来说，在两个pH值 下，相比于对照蛋白，聚合物都表现出了对麦醇溶蛋白更大的亲和力。还 必须指出，由于絲白在酸性糾下的不溶性，因此未在pHl,2下研究与 S^白的^^。如图3所示，可通过共聚物组成调节与麦醇溶蛋白的^。 图2还显示了当使共聚物与两种蛋白一起孵育时，在SDS-PAGE上麦醇溶 蛋白和线型聚(HEMA-共-SStNa)之间的选择性结合(实施例10),而白蛋 白仍然游离于溶液中。如实施例26所述，通过SDS-PAGE评价麦醇溶蛋 白对实施例14的线型聚(HEMA-共-SStNa)聚合物的结合亲和力并与白蛋 白的亲和力进行比较。结果如下在pH1.2和6.8下与白蛋白的^分别 为78.8 %和11.23 。/。；在pH 1.2和6.8下与麦醇溶蛋白的#分别为100 % 和71.3 %。
实施例28
聚(HEMA-共-SPMAK)组合物与麦醇溶蛋白结合的选择性
如实施例26所述，通过SDS-PAGE评价麦醇溶蛋白与不同线型聚 (HEMA-共-SPMAK)(在实施例18-22中报道了合成)的结合亲和力并与 在肠pH (6.8)和胃pH (1.2)下白蛋白的亲和力进行了比较(图4)。当 将SStNa单体以SPMAK替代(特别是在pH 6.8下)时，观察到与麦醇 溶蛋白的更少结合(图4)。对于50~100摩尔％比例的SPMAK,得到与 麦醇溶蛋白的最佳^。
实施例29
共聚物结构对与麦醇遂:蛋白结合的影响
分别使用源自葡萄糖、蔗糖和环糊精的引发剂合成5臂、8臂和18臂 的星形聚(HEMA-共-SStNa)(实施例15~17)和聚(HEMA-共-SPMAK)(实 施例23~25 )。将其结合麦醇溶蛋白的能力与其线型对应部分(分别为实施 例9和18 )进行比较。结果示于图5和图6。对于约30摩尔％的SStNa 固定百分比而言，8臂星形聚(HEMA-共-SStNa)的结合效率好于线型共聚 物或其它星形共聚物(图5)。在17摩尔％的SPMAK固定比例下，没有 观察到在麦醇溶蛋白与线型或星形聚(HEMA-共-SPMAK)的结合上有显 著差别(图6 )。
结论
HEMA和SStNa或SPMAK的线型或星形无规共聚物表明在模拟胃肠 道的pH ^下结合a-麦醇溶蛋白。
实施例30
共聚物分子量对与麦醇溶蛋白结合的影响
在pH 1.2和6.8下，均测试了^^有约50% SStNa的两个不同重量的聚 (HEMA-共-SStNa)(实施例10和11)与麦醇溶蛋白和白蛋白的结合。在 本实验中，对每种蛋白分别测试。结果示于图9。发现与麦醇溶蛋白的结 合和结合的选择性受到所述聚合物分子量的影响。
实施例31
共聚物对麦醇溶蛋白的誇艮降解的预防
麦醇溶蛋白的胃蛋白酶-胰蛋白酶消化物的制备
采用均粘附于琼脂糖上的胃蛋白酶(Sigma P0609; St Louis， Missouri, USA)和胰蛋白酶(Sigma T1763 )，以及来自牛胰脏的a-胰凝乳蛋白酶 (Sigma C4129 )进行a-麦醇溶蛋白的逐步Sl^水解。将a-麦醇溶蛋白(10 mg )溶于5 mLpH=1.2的盐酸緩冲液(10 mM)中并加入胃蛋白酶(38 U )。 在37。C磁力搅拌混合物2小时，这时以0.1 mol/L NaOH调节pH至6.8， 并加入胰蛋白酶(0.75 U)和a-胰凝乳蛋白酶(0.5 U )。在20。C和6000 g 下将消化物离心30分钟。然后在上清液中收集麦醇溶蛋白肽并通过0.2 jim 的GHP过滤器过滤。
采用配有1525 二元泵、2487双波长吸收检测器和Breeze Chromatography SoftwareTM (Waters, Midford, MA)的WatersTM高效液 相色镨HPLC系统，分析所得的麦醇溶蛋白的胃蛋白酶-胰蛋白酶-胰凝乳 蛋白酶消化物。在36。C下以1 mL/分钟的流速、215 nm的检测波长和50 jil 的进样量洗脱样品。三氟乙酸用作离子配对剂，以经60分钟从100%緩冲 液A至100。/。緩冲液B的线性梯度进行洗脱。緩冲液A由0.1%三氟乙酸、 95%水和5%乙腈组成，緩冲液B由0.1%三氟乙酸、5%7^和95%乙腈组 成。将每个样品上清液的一部分在水中稀释并在ds反相柱(Waters Nova-packTM C18, 60 A， 4 jim, 3.9x300 mm)上分析。
麦醇溶蛋白-聚合物络合物的膝化降解
将聚(HEMA-共-SStNa)(实施例10 ) (4 g/L)和麦醇溶蛋白(2 g/L) 在pH2下混合在一起并孵育2小时。然后，按以上所述进行麦醇溶蛋白-聚合物络合物的逐步i^降解。按以上所述，使用HPLC分析聚合物结合 剂对麦醇溶蛋白降解的作用(图7)。
当所述麦醇溶蛋白与所述聚合物^时，检测到明显较少的降解产物 (图7)。
实施例32
聚合物对Caco-2单层完整性的作用
评价聚(HEMA-共-SStNa)(实施例10 )对Caco-2细胞单层完整性的 作用并将其与PEG (35kDa)和PVP (58kDa)进行比较(图8 )。
以2.5 x 105细胞/cm2的播种密度在12孔Transwelf聚碳酸酯过滤器 (Corning, Acton，MA)上播种细胞。在添加了 10% (v/v)胎牛血清、非必 需^J^酸溶液(0.1 mM )、 pH 7.4的Hepes緩冲剂(10 mM)和青霉素-链霉素(相当于100 U/mL和100 ng/mL)的Dulbecco，s改良的必需培养 基(DMEM)中培养Caco-2。每72小时更新培养基一次。将细胞在37。C、 5% C02下培养21-28天以在实验前形成分化的单层。在完全DMEM培养 基中进行毒性研究。采用MillicellTM Electrical Resistance System( Millipore Corp. Bedford, MA), 4吏用单电极(World Precision Instruments, Sarasota, FL)在预定的时间点读和夸上皮细胞电阻(TEER)的读数。
在聚(HEMA-共-SStNa)和对照聚合物(PVP、 PEG)中，24小时后 测定的TEER均显示了初始值10。/。的减小(图8 X这些结果表明聚(HEMA-
共-SStNa)似乎并不强烈地干扰Caco-2细胞单层的完整性。
实施例33
聚合物结合剂对降低麦醇溶蛋白和麦醇溶蛋白降解产物
的毒性的作用的体内测试
通过测量已对谷蛋白或其降解产物敏感的动物的免疫应答而体内评 价所述聚合物降低谷蛋白毒性的能力。在存在或不存在聚合物结合剂的情 况下，在表达HLA-DQ8的转基因小鼠(24) 口月艮谷蛋白或其降解产物后， 在该小鼠中测量免疫应答。
实施例34
向食物中加入聚合物结合剂
可将聚合物结合剂加入到受乳糜泻影响的个体所用的含有谷蛋白的 食物中。然后当食物被吞下时，在这些食物中的聚合物结合剂可对抗食物 中所含谷蛋白的有害效应。不受此限制，这样的食物包括煮熟的盘菜、谷 物、焙烤品比如面包、糕点、饼、蛋糕、松饼、饼干等。可以向这些食物 中以0.01 %~10% (w/w)的浓度加入所述聚合物结合剂。还可将所述聚合物 结合剂加入到不含谷蛋白的食物中以在含有含谷蛋白食物的膳食中消费。 不受此限制，这些不含谷蛋白的食物包括涂抹食物比如乳酪、果酱、黄油 或可在含谷蛋白食物上或与含谷蛋白食物一起食用的任何食物。
虽然以上已经通过具体实施方案的方式对本发明进行了描述，但可 以在不背离如所附权利要求所定义的本发明的精神和实质的情况下对其 进行修改。
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权利要求
1.一种药物组合物，所述药物组合物包含聚合物结合剂和药学可接受载体，所述聚合物结合剂包含具有由不可水解的共价键构成的主链的高分子量合成聚合物，所述聚合物能在pH低于谷蛋白和源自谷蛋白降解的肽的等电点时形成静电键，并且能在胃肠道中与谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽结合。
2. 权利要求l的药物组合物，其中所述聚合物结合剂能与谷蛋白 或源自谷蛋白降解的肽形成疏水性相互作用。
3. 权利要求1或2的药物组合物，其中所述聚合物结合剂能形成氢键。
4. 权利要求1至3中任一项的药物组合物，其中所述聚合物结合剂 能在胃肠道中特异性地与谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽结合。
5. 权利要求1至4的药物组合物，其中所述聚合物结合剂能在肠道 中与谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽结合。
6. 权利要求1至5中任一项的药物组合物，其中所述聚合物结合剂 是甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)和4-苯乙烯磺酸钠盐水合物(SStNa) 的共聚物。
7. 权利要求1至5中任一项的药物组合物，其中所述聚合物结合剂 是曱基丙烯酸羟乙酯(HEMA)和甲基丙烯酸磺酸丙酯钾盐(SPMAK) 的共聚物。
8. 权利要求1至5中任一项的药物组合物，其中所述聚合物结合剂 是4-苯乙烯磺酸钠盐水合物(SStNa)的聚合物。
9. 权利要求1至5中任一项的药物组合物，其中所述聚合物结合剂 是甲基丙烯酸磺酸丙酯钾盐(SPMAK)的聚合物。
10. 权利要求1至9中任一项的药物组合物，其中所述聚合物结合 剂是线型的。
11. 权利要求1至9中任一项的药物组合物，其中所述聚合物结合 剂是星形的。
12. 权利要求ll的药物组合物，其中所述聚合物结合剂是3 18臂 的星形共聚物。
13. 权利要求ll的药物组合物，其中所述聚合物结合剂是5 18臂 的星形共聚物。
14. 权利要求ll的药物组合物，其中所述聚合物结合剂是5臂星形 共聚物。
15. 权利要求ll的药物组合物，其中所述聚合物结合剂是8臂星形 共聚物。
16. 权利要求ll的药物组合物，其中所述聚合物结合剂是18臂星 形共聚物。
17. 权利要求6的药物组合物，其中所述HEMA和SStNa的共聚 物的HEMA/SStNa的摩尔百分比之比是约93.5/6.5至约1/99。
18. 权利要求4的药物组合物，其中所述HEMA和SStNa的共聚 物是线型的HEMA/SStNa ( 51.5/48.5摩尔％ )。
19. 权利要求4的药物组合物，其中所述HEMA和SStNa的共聚 物是线型的HEMA/SStNa ( 43/57摩尔％ )。
20. 权利要求7的药物组合物，其中所述HEMA和SPMAK的共 聚物的HEMA/SPMAK摩尔百分比之比是约93.5/6.5至约1/99。
21. 权利要求7的药物组合物，其中所述HEMA和SPMAK的共 聚物的HEMA/SPMAK摩尔百分比之比是约86/14至约1/99。
22. 权利要求7的药物组合物，其中所述HEMA和SPMAK的共 聚物是线型的HEMA/SPMAK ( 45/55摩尔％ )。
23. 权利要求1~22中任一项的药物组合物，其还包含连蛋白拮抗 剂或HLADQ2抑制剂。
24. —种使用权利要求1 22中任一项的聚合物结合剂的方法，包 括给患有乳糜泻的患者施用药物有效量的所述聚合物结合剂。
25. 权利要求24的方法，其用于在所述患者体内结合谷蛋白或源自 谷蛋白降解的肽。
26. 权利要求24的方法，其用于减少谷蛋白在所述患者体内降解成 毒性肽。
27. 权利要求24的方法，其用于减少谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽 与所述患者胃肠道粘膜的相互作用。
28. 权利要求24 27中任一项的方法，其中所述施用在所述患者进 食含有谷蛋白的膳食之前或期间进行。
29. 权利要求24 27中任一项的方法，其中所述施用在所述患者进 食含有谷蛋白的膳食之后进行。
30. 权利要求1~23中任一项的聚合物结合剂在制备药物中的用途。
31. 权利要求1~22中任一项的聚合物结合剂用于在有此需要的患 者的胃肠道内结合谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽的用途。
32. 权利要求1~22中任一项的聚合物结合剂在制备用于在有此需 要的患者的胃肠道内结合谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽的药物中的用 途。
33. 权利要求1~22中任一项的聚合物结合剂用于减少谷蛋白或源 自谷蛋白降解的肽与有此需要的患者的胃肠粘膜相互作用的用途。
34. 权利要求1~22中任一项的聚合物结合剂在制备用于减少谷蛋 白或源自谷蛋白降解的肽与有此需要的患者的胃肠粘膜相互作用的药 物中的用途。
35. 权利要求1 22中任一项的聚合物结合剂用于减少谷蛋白在有 此需要的患者的胃肠道内降解成毒性肽的用途。
36. 权利要求1~22中任一项的聚合物结合剂在制备用于减少谷蛋 白在有此需要的患者的胃肠道内降解成毒性肽的药物中的用途。
37. 权利要求31~36中任一项的用途，其中所述患者患有乳糜泻。
38. —种食物，其含有权利要求1 22中任一项的聚合物结合剂。
39. 权利要求38的食物，其中所述食物是含有谷蛋白的食物。
40. 权利要求39的食物，其中所述食物是面包。
41. 一种使用权利要求38-40中任一项的食物的方法，包括给患有 乳糜泻的患者在所述患者进食期间施用所述食物。
42. 权利要求41的方法，用于结合所述患者的膳食中所含有的谷蛋 白或源自谷蛋白降解的肽。
43. 权利要求41的方法，用于减少所述患者的膳食中所含有的谷蛋 白降解成毒性肽。
44. 权利要求41的方法，用于减少谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽与所述患者的胃肠粘膜的相互作用。
45. —种制备供患有乳糜泻的患者使用的食物的方法，包括向所述 食物中加入权利要求1~22中任一项的聚合物结合剂。
46. 权利要求41的方法，其中所述食物是含有谷蛋白的食物。
全文摘要
本发明涉及一种包含聚合物结合剂和药学可接受载体的药物组合物，所述聚合物结合剂包含具有由不可水解的共价键构成的主链的高分子量合成聚合物，所述聚合物能在pH低于谷蛋白和源自谷蛋白降解的肽的等电点时形成静电键，并且能在胃肠道中与谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽结合。本发明还涉及使用所述聚合物结合剂用于结合谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽、用于减少谷蛋白降解成毒性肽或用于减少谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽与胃肠道粘膜的相互作用的方法。
文档编号A61K31/74GK101360505SQ200680050656
公开日2009年2月4日 申请日期2006年10月27日 优先权日2005年11月14日
发明者穆罕默德·纳塞尔·埃丁, 让-克里斯托弗·勒鲁 申请人:瓦洛里塞森-勒谢什有限合伙公司