复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统及其应用的制作方法

专利名称：复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因治疗和重组疫苗领域中一种复制缺陷型重组腺病 毒Ad41载体系统及其应用。
背景技术：
肠道作为基因治疗的靶器官有如下优点(a)给药途径简便，可 以直接口服给药或内窥镜给药；(b)肠道上皮的表面积大，便于载体 的充分吸附和感染；(c)肠道上皮的隐窝细胞是干细胞，对其的感染 能延长目的基因的表达时间(Croyle MA， Stone M， Amidon GL， Roessler BJ. In vitro and in vivo assessment of adenovirus 41 as a vector for gene delivery to the intestine. Gene Ther， 1998，5(5》645-654. [pubmed:9797869)。粘膜是阻止多数病原微生物入侵机体的第 一道屏 障，口服给药的疫苗能激发粘膜免疫和系统免疫，是今后疫苗研究的 重要方向。然而，目前缺乏安全有效的能够肠道给药的载体系统，将 把基因或抗原基因传递到肠道细胞非常困难，使得胃肠道的基因治疗 和口服重组疫苗研究相对滞后(Lecollinet S， Gavard F， Havenga MJ， Spiller OB， Lemckert A， Goudsmit J， Eloit M， Richardson J. Improved gene delivery to intestinal mucosa by adenoviral vectors bearing subgroup B and d fibers. J Virol， 2006，80(6):2747國2759. [pubmed:16501084)。
腺病毒载体(Adenovector， Ad)由于感染细胞效率高、遗传稳定、 容易制备高滴度病毒、不整合入细胞基因组、既能感染分裂期也能感 染非分裂期细胞等优点被广泛用于基因治疗和重组疫苗研究。现在得 到广泛应用的腺病毒载体多是基于人5型腺病毒基因组，但胃酸或肠 消化液能够较大幅度的降低Ad5的感染力，所以其不是理想的肠道给 药的基因治疗载体(Favier AL， Burmeister WP， Chroboczek J. Unique physicochemical properties of human enteric Ad41 responsible for its
4survival and replication in the gastrointestinal tract. Virology, 2004，322(1):93-104. [pubmed:15063120)。
人F组腺病毒包括2个成员Ad40和Ad41,能引起婴幼儿急性 胃肠炎，是天然的肠道病原，被称为肠腺病毒(enteric adenovirus )。 研究表明Ad41对胃酸和肠消化液有很强的耐受性，对分化的肠上皮 细胞感染能力强，是理想的用于肠道给药的基因治疗载体(Tiemessen CT， Kidd AH. The subgroup F adenoviruses. J Gen Virol, 1995,76 ( Pt 3):481-497. [pubmed:7897343])。

发明内容
本发明的目的是提供一种复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统。 本发明提供的载体系统包括1个骨架质粒、1个穿梭质粒和1个包 装细胞系。所述骨架质粒含有缺失了腺病毒包装所需编码区的腺病毒 Ad41基因组，所述穿梭质粒含有用于插入目的基因的多克隆位点以及 用于与骨架质粒发生同源重组的腺病毒Ad41基因组片段，所述包装 细胞系在细胞基因组中整合了所述腺病毒Ad41包装所需基因并能稳 定表达该包装基因。
利用本载体系统能够制备由CMV启动子控制目的基因表达的重 组Ad41腺病毒。将目的基因编码区克隆到穿梭质粒pSh41-CMV的多 克隆位点处，携带目的基因的穿梭质粒经限制性内切酶PacI酶切线性 化，与骨架质粒pAdbone41共转化大肠杆菌BJ5183菌林(美国 Stratagene公司)，在BJ5183细胞内经过同源重组得到携带目的基因 的腺病毒质粒。该质粒经限制性内切酶Pmel酶切，释放重组腺病毒 基因组，利用DNA转染方法将重组腺病毒基因组转染包装细胞 293-E1B,在包装细胞内拯救得到携带目的基因的重组Ad41腺病毒。 起始得到的少量重组病毒可以进一步用包装细胞扩增，制备大量的重 组病毒。
在制备的重组腺病毒中，Ad41基因组El区由含目的基因的表达 框(含启动子、目的基因CDS和多聚腺苷酸加尾信号)替代，故该重 组病毒只能在稳定表达Ad41 E1B55K基因的包装细胞系293-E1B中 复制包装，对于其他非包装细胞系，其是复制缺陷的。该重组病毒颗 粒中，除基因组含有部分外源序列(目的基因表达框)外，基因组其他部分以及病毒所有结构蛋白均源于野生型Ad41 (GenBank登录号 DQ315364)。该野生型Ad41是从Ad41阳性的婴幼儿病毒性腹泻的粪 便标本中得到的。
由于Ad41是天然的肠道病原，预计本发明产生的重组Ad41病毒 在肠道基因治疗和口服重组疫苗研究中有广阔的应用前景。


图1是骨架质粒pAdbone41构建示意图。图中Larm:左臂同系 物(left arm homolog );R arm: 右臂同系物(right arm homolog ); ORI:复制起点(origin of replication); Amp:氨千青霉素抗性的开 方文读码框(ampicillin resistance ORF )。骨架质粒中，从R arm开始
(含Rarm)至Larm结束(含L arm )的部分为Ad41基因组序列， 其包括基因组E1B55K编码区(CDS )右侧全部序列(含E1B55K CDS 内侧3'端46个核苷酸)。
图2是穿梭质粒pSh41-CMV构建示意图。图中Kan:卡那霉素 抗性的开》文读码框(kanamycin resistance ORF ); ITR:反向重复序列
(the inverted terminal repeat); ES:包装信号(encapsidation signal); CMV:巨细胞病毒启动子(CMV promoter ); MCS:多克隆位点
(multiple cloning site ); pA:多聚腺苦酸加尾信号(polyA signal); L arm, R arm: 左臂或右臂同系物(left or right arm homolog ); ORI: 复制起点(origin of replication )。
图3是结晶紫染色法显示Ad41在293细胞和293-E1B包装细胞 中形成的细胞病变效应(CPE)。将293和293-E1B细胞接种于96孔 板，18~24小时后，按100jil/孔的接种量接种梯度稀释的Ad41病毒， 继续培养6天后，用2%戊二醛固定，0.1%结晶紫染色。由图可见400 倍稀释的Ad41在293-E1B包装细胞中引起CPE的情况与50倍稀释 Ad41在293细胞中引起的CPE强度相当，说明293-E1B细胞对Ad41 的敏感性较293细胞高。
图4显示的是重组Ad41-GFP在293-E1B包装细胞中的扩增以及 用氯化铯密度梯度离心法对其纯化。a.用收获的第9代Ad41-GFP
(P9)感染293-E1B包装细胞4天后出现细胞病变效应(CPE); b.箭 头标示了氯化铯密度梯度离心后形成的病毒条带；c,纯化的Ad41-GFP的负染电镜照片。
图5显示的是重组Ad41-GFP感染Hep2细胞2天(MOI=1000，
以颗粒数计算)的情况。a.显微镜下观察；b.流式细胞仪定量测定。
具体实施例方式
在本发明的一个实施方案中，本发明的骨架质粒含有缺失了腺病 毒包装所需编码区E1 (SEQIDNO: 1)的腺病毒Ad41基因组。
在具体实施方案中，所述骨架质粒为pAdbone41，依次含有 pBR322质粒的复制起点(Ori)、氨千青霉素的抗性基因(Amp)和 Ad41基因组ElB55K编码区(CDS ) ( SEQ ID NO: 1)下游全部序列 (含E1B55KCDS内侧3，端46个核苷酸)，参见图1。
在具体实施方案中，骨架质粒pAdbone41在Ad41基因组右侧末 端添加有一个限制性内切酶Pmel酶切位点(GTTTAAAC )。
在本发明的一个实施方案中，本发明的穿梭质粒为pSh41-CMV, 依次含有pBR322质粒的复制起点(Ori )、卡那霉素的抗性基因(Kan )、 Ad41基因组左侧反向重复序列(ITR)、Ad41的包装信号(ES X ITR-ES 在野生型Ad41 (GenBank登录号DQ315364)基因组上的片段位置 lnt 361nt)、巨细胞病毒启动子(CMV )、多克隆位点(MCS)、猴病 毒40( SV40 )的多聚腺苷酸加尾信号(pA )、用于与骨架质粒pAdbone41 发生同源重组的右臂和左臂(Rarm、 L arm ) ( L arm在野生型Ad41 (GenBank登录号DQ315364 )基因组上的片段位置 33373nt 34189nt，R arm在野生型Ad41( GenBank登录号DQ315364 ) 基因组上的片段位置3101nt 3964nt )，参见图2。
在具体实施方案中，穿梭质粒pSh41-CMV在能够与骨架质粒 pAdbone41发生同源重组的右臂和左臂(Rarm、 L arm )序列之间含 有一个限制性内切酶Pad的识别位点(TTAATTAA),并且在Ad41 基因组左侧反向重复序列(ITR)左侧末端添加有一个限制性内切酶 Pmel的识别位点(GTTTAAAC )。
在本发明的一个实施方案中，本发明的包装细胞系通过用携带有 E1B55K的重组真核质粒转染后获得，该包装细胞系是在293细胞基 因组中整合了 Ad41 E1B55K基因并且能够稳定表达该整合基因。所述 包装细胞系中控制Ad41 E1B55K表达的启动子为巨细胞病毒启动子(CMV)，其mRNA加尾信号为牛生长激素基因的polyA加尾信号 (BGH polyA )。
在本发明的具体实施方案中，所述包装细胞系于2008年6月2日 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC ) (北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101), 分类命名为人胚肾293细胞，保藏号为CGMCC No.2534。
以下通过实施例来对本发明进行详细说明。应当理解，本申请的 内容不限于以下具体实施例。
实施例1、骨架质粒pAdbone41的构建
1) 含有重组用左臂、右臂(Larm、 Rarm)序列、复制子和氨 千青霉素抗性基因序列的质粒pAM-RLarm构建
在标准的聚合酶链反应(PCR)条件下(50微升体系模板10 纳克，引物各30皮摩尔，4种脱氧核苷三磷酸各10纳摩尔，高保真 耐热DNA聚合酶1单位；反应条件94摄氏度预变性2分钟，94摄 氏度变性30秒，以较引物的解链温度低4摄氏度的温度退火30秒， 68摄氏度延伸，延伸时间根据产物的长度按扩增800碱基对需1分钟 计算，扩增30循环，68摄氏度末端补平5分钟；以下的PCR扩增条 件与此同)，以野生型Ad41基因组(GenBank登录号DQ315364)为 模板(来源于Ad41阳性的嬰幼儿病毒性腹泻的粪便标本)，用引物 Larm F: gcgg2ttaattaa(TacI)caaaaagctt(HindlII)gttgagagcgccc ( SEQ ID NO : 2 ) 和 引 物 Larm R : ccccglai2￡(BstZ17I)g|||gaS￡(PmeI)catcatcaataatatacc ( SEQ ID NO: 3 ) 扩增得到 848bp左臂片段Larm ; 用引物 Rarm F : eccgaattc(EcoRI)gatgttgtcgtgtcttcgcaccgact (SEQ ID NO: 4)和引物 Rarm R: cttttt2ttaattaa(TacI)cccgcat2c(Sphl)atccttcccaac ( SEQ ID NO: 5)扩增得到888bp右臂片段Rarm。由于Rarm的3，端与Larm 的5，端有20bp的核苷酸序列相同，将回收的Rarm和Larm片段混 合后作为模板，以Rarm F和Larm R为引物PCR扩增得到Rarm与 Larm串联的片段RLarm ( 1716bp )。
用EcoRI和BstZ171双酶切pAdeasy-1质粒(美国stratagene戶> 司)，回收较小片段2049bp (GenBank登录号AY370909;片段位置1622nt 3670nt)，其含有复制起点和氨千抗性基因；EcoRI和BstZ171 双酶切RLarm后，将二者连接(连接反应条件为IO微升体系，10x 连接緩冲液l微升，2个片段各2微升，1微升T4 DNA连接酶(美 国NEB公司)，IO摄氏度反应12小时；后续的连接反应条件与此同)。 转化大肠杆菌DH10B得质粒pAM-RLarm (图1 )。 2 )重组获得骨架质粒pAdbone41
将pAM-RLarm用HindIII和Sphl双酶切线性化，与Ad41基因 组DNA共同电转化大肠杆菌BJ5183菌林(美国Stratagene公司)，筛 选氨千抗性菌落以获得发生重组的质粒pAdbone41(图1),用重组的 质粒pAdbone41转化大肠杆菌DH10B，扩增并纯化得到较大量 pAdbone41质粒，保存并将pAdbone41测序。具体操作过程参照 stratagene公司AdEasy腺病毒载体系统 <吏用手册进4亍(AdEasy Adenoviral Vector System第21页Cotransforming the BJ5183 Cells to Produce Recombinant Ad Plasmid; Catalog #240009 )。
实施例2、穿梭质粒pSh41-CMV的构建(图2 ) l)含卡那霉素的抗性基因(Kan)的克隆质粒pKan的构建 以pShuttle画CMV (Stratagene公司)为模板，用引物5F070522: gcccggatce ( BamHI) cgagcggtatcagctcactcaaag ( SEQ ID NO: 6 )和 引物5R070522: gccccgcgcgc( BssHII )aaactggaacaacactcaaccctat( SEQ ID NO: 7 )扩增得到2483bp片段(参照pShuttle画CMV序列，version 017005;片段位置4660nt 7122nt)，该片段含有复制起点和卡那霉素 的抗性基因。使用位于该片段两端的内切酶BamHI和BssHII双酶切 后回收； 将引物 5F : cgcgcaaggg gaagagctcg gg肌ggggaa ttcggagaagggtatacc ( SEQ ID NO: 8 )和引物5R: gatcggtatacccttctccg aattccccttcccgagctcttccccttg ( SEQ ID NO: 9 )混合后退火得到两端为 粘端的长约为50bp的双链DNA，该段DNA含有Sacl， EcoRI, BstZl71 酶切位点；上述酶切回收的片段(含复制起点和卡那霉素抗性基因) 与引物退火形成的约50bp片段连接后，转化大肠杆菌DH10B感受态 细胞得pKan质粒。具体转化步骤如下取连接产物5微升，加到100 微升感受态细菌中，混匀；冰水浴30分钟，42摄氏度保温卯秒，添 加800微升LB液体培养基，以37摄氏度下150转/分钟的转速振摇60分钟；将菌液涂布到含卡那霉素的LB琼脂平板上，37摄氏度下培 养12-18小时，挑取单菌落，培养细菌提取质粒。
2) 含Ad41包装信号(ES)、 CMV启动子、多克隆位点(MCS ) 和SV40polyA加尾信号(pA )的质粒pKan-ES-CMV的构建
以野生型Ad41基因组为模板(来源于Ad41阳性的嬰幼儿病毒性 腹竭的粪{更标本)，用引物6F: ccccgcgcgc ( BssHII) gtttaaac ( Pmel) catcatcaataa tataccttaaag ( SEQ ID NO: 10)和引物6R: ccccgagctc
(Sacl) gtggcagtgccacgtagggaaac ( SEQ ID NO: 11)扩增得到388bp 片段ITR-ES，其中含有Ad41左端反向重复序列(ITR)和包装信号
(ES);用BssHII和SacI双酶切该片段及pKan，连接后得pKan-ES 质粒。
以pShuttle國CMV为模板，用引物7F: ccccgagctc (Sacl) taatagtaatcaattacggggtcat (SEQ ID NO: 12)和引物7R: ccccgaattc (EcoRI)taagatacattgatgagtttggaca ( SEQ ID NO: 13 )扩增得到913bp 片段CMVpA (参照pShuttle-CMV序列，version 017005;片段位置 346nt 1238nt)，该片段含有CMV启动子、多克隆位点(MCS)和 SV40polyA加尾信号；用Sacl和EcoRI双酶切PCR产物和pKan后 连接，得pKan-CMVpA质粒。
用Sacl和EcoRI双酶切pKan-CMVpA,回收约卯3bp片段 (CMVpA)，连接到pKan-ES质粒的Sacl和EcoRI位点间，得 pKan-ES-CMV质粒。
3) 克隆得到穿梭质粒pSh41-CMV
用EcoRI和BstZ171双酶切pAM-RLarm并回收1705bp片段 (RLarm )，连接到pKan-ES-CMV的EcoRI和BstZ171切点间，即 得pSh41-CMV，其多克隆位点含有限制性内切酶位点BglII、 Kpnl、 Sall、 Notl、 XhoI和EcoRV。
实施例3、包装细胞系293-E1B的构建 l)Ad41 E1B55K基因的克隆
以Ad41阳性的婴幼儿病毒性腹泻的粪便标本DNA为模板，利用 PCR扩增E1B55K基因，反应条件与前同。所用引物为8F: gcccaagctt (HindIII )atggagcgcccaaacccatctg( SEQ ID NO: 14 )和8R: gccctctaga
10(Xbal) tacccttaatcctcatcgctggattc ( SEQ ID NO: 15),扩增包含 E1B55K完整CDS的片段。将扩增片段连接到T载体(pMD-18T， TAKARA公司)，测序证实序列无误后(测序在北京奥科生物4支术公 司进行)，用Hindlll和Xbal双酶切，连接到pcDNA3质粒(Invitrogen ) 的酶切位点Hindlll和Xbal之间，得到真核表达质粒 pcDNA3國ElB55K。
2)基因转染及细胞系的筛选
用脂质体(lipofectamine 2000 ， Invitrogen ) 包裹质粒 pcDNA3-ElB55K并转染293细胞(具体操作按照Invitrogen公司 lipofectamine2000产品说明书进行)，用800fig/ml G418 (Roche)筛选 2~3周后挑取单克隆(293-ElB，)，扩增后，用RT-PCR的方法检测 E1B55K的表达，保留E1B55K表达阳性的克隆，使用完全CPE法检 测其扩增Ad41腺病毒的能力(详细筛选鉴定过程参照文献进行韩 炳娟，郭丽，屈建国，王敏，王健伟，鲁茁壮，洪涛.转染E1B55K 基因提高Hep2细胞包装肠腺病毒Ad41的能力.病毒学报.2007， 23(4):258-264 )。
以2 x 1(^细胞/孔的接种密度将293和293-ElB，的单克隆细胞接种 于96孔板，用含10%FBS的DMEM培养基培养18~24小时；将含 有Ad41阳性的婴幼儿病毒性腹泻的粪便标本上清，用PBS稀释，过 滤除菌后，用含2%FBS的DMEM培养基进行2倍的梯度稀释，将稀 释好的各梯度以100 ja 1/孔的接种量分别接种293和293-ElB，单克隆细 胞；继续培养6~9天后，直接加入2%戊二醛固定液(PBS配制)100 lil/孔，固定0.5~2小时，吸弃固定液，用蒸馏水沖洗3次后，加入 0.1%结晶紫水溶液50pl/孔，染色30min，再用蒸馏水冲洗3次后晾 干，棵眼观察CPE的强弱，得到一林能引起较强CPE的单克隆 293-ElB，细胞。达到相同的CPE的强度时，其病毒接种量约为对照293 细胞的1/8(图3)。该单克隆的编号为12号，将其重新命名为293-E1B, 于2008年6月2日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心 (CGMCC ),保藏号为CGMCC No.2534。
实施例4、携带GFP报告基因的重组腺病毒Ad41-GFP的制备 本实施例以"携带GFP报告基因的重组腺病毒Ad41-GFP的制备" 的为例，具体表述制备携带目的基因的重组Ad41病毒的制备过程。利用本载体系统能够制备由CMV启动子控制目的基因表达的重 组Ad41腺病毒。将目的基因编码区克隆到穿梭质粒pSh41-CMV的多 克隆位点处。携带目的基因的穿梭质粒经限制性内切酶PacI酶切线性 化后，与骨架质粒pAdbone41共转化大肠杆菌BJ5183菌林，在BJ5183 细胞内经过同源重组得到携带目的基因的腺病毒质粒。该质粒经限制 性内切酶PmeI酶切，释放重组腺病毒基因组，利用DNA转染方法将 重组腺病毒基因组转染包装细胞293-E1B,在包装细胞内拯救得到携 带目的基因的重组Ad41腺病毒。起始得到的少量重组病毒可以进一 步用包装细胞扩增，制备大量的重组病毒。
1)GFP基因的克隆及腺病毒质粒pAd41-GFP的制备 以pLEGFP國Cl (BDCLONTECH公司)为模板，以9F: ggccagatct (BglII) gctaccggtcgccaccatggtgag ( SEQ ID NO: 16 )和9R: gccgtcgac (Sail) ttagagtccggacttgtacagctcgt ( SEQ ID NO: 17 )为引物，扩增 得到764bp片段(参照Clontech公司提供的序列，文件编号PT3232-5; 片段在原pLEGFP-Cl质粒上的位置3058 nt~ 3799 nt )，用BglII、 Sail双酶切后，连接到穿梭质粒pSh41-CMV的BglII、 Sail酶切位点 之间，得到pSh41-GFP。将pSh41-GFP用Pad线性化后，与骨架质 粒pAdbone41共转化大肠杆菌BJ5183菌林(美国Stratagene公司)，经 卡那霉素筛选得到重组腺病毒质粒pAd41-GFP。具体操作过程参照 stratagene公司AdEasy腺病毒载体系统4吏用手册进4亍(AdEasy Adenoviral Vector System第21页Cotransforming the BJ5183 Cells to Produce Recombinant Ad Plasmid; Catalog #240009 )。
2 )重组腺病毒Ad41-GFP的拯救
将pAd41-GFP使用Pmel线性化后，转染包装细胞系293-E1B, 培养3-5天，去除部分培养基，收获细胞，冻融裂解3次，离心后用 上清(P0代)再次感染293-E1B细胞，随着盲传代数的增加，GFP+ 细胞逐渐增多，P7代病毒上清使得培养的293-E1B产生完全CPE， 说明病毒得到扩增(图4a)。具体操作过程参照stratagene公司AdEasy 腺病毒载体系统使用手册进行(AdEasy Adenoviral Vector System第 27页Preparation of Primary Adenovirus Stock with Recombinant Ad Plasmid; Catalog #240009 )。
3 )重组腺病毒Ad41-GFP的制备和纯化继续用293-E1B细胞扩大培养病毒，传至Pll代，能获得约20 个培养皿(150cm2)由293-E1B细胞产生的病毒上清，氯化铯密度梯 度离心，可见病毒富集成单一线性条带，收获病毒，透析后保存于5% 甘油Hanks液中(图4b和c)。氯化铯密度梯度离心的具体过程参加 手册(Ng P， Graham FL Construction of first-generation adenoviral vectors, gene therapy protocols, 2nd Edition, Edited by Morgan JR. Humana Press Inc.)。
4 ) Ad41-GFP滴度测定及对Hep2细胞的感染
用293细胞以2 x 104细胞/孔的接种密度接种96孔板，培养18 ~ 24小时，对纯化的重组腺病毒Ad41-GFP进行10倍的梯度稀释，吸 弃96孔板中细胞的原培养基，加入病毒稀释液100yl/孔，培养2天 后，荧光显微镜下计数每孔GFP+细胞数，以同一稀释度下各孔平均 GFP+细胞数除以0.1ml/孔，再乘以该列孔所加病毒液的稀释倍数，即 得病毒原液的滴度。以这种有限稀释法测定批号为071116的纯化 Ad41画GFP的感染滴度为2.4 x 109IU/ml (infection units per milliliter)。
通过测定病毒基因组含量计算病毒颗粒数滴度。将纯化病毒与等 量的2x裂解液(20mMEDTA、 1%SDS、 0.8mg/ml蛋白酶K)混合， 50度下保温3小时，取5微升裂解液加样到不含溴化乙啶(EB)的 0.7%琼脂糖凝胶中电泳，电泳完毕后再用EB染色，紫外灯下照相记 录电泳结果，根据病毒基因组条带与内参DNA条带的灰度，计算病毒 基因组的含量，根据基因组的分子量换算为摩尔数， 一个完整病毒粒 子含有一个病毒基因组，得到病毒的颗粒数滴度。批号为071116的纯 化Ad41-GFP的颗粒数滴度为2.4 xl011 vp/ml (Viral particle per milliliter )。
Ad41-GFP感染H印2细胞的情况如图5所示。用1000 MOI (以 颗粒数计算)的Ad41-GFP感染Hep2细胞，2天后，在荧光显微镜下 照相，用胰酶消化细胞并且用流式细胞仪测定GFP+细胞含量为 72.3%。序列表
〈110>中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 〈120〉 复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统及其应用 <130> CP1080242 <160> 17
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 1422
<212> DNA
<213> 人类
<220〉
<221> Ad41 E1B55K CDS <222>(1). (1422)
<400> 1
atggagcgcc caaacccatc tgtcggaggg gtatactctg gattacatga caatggccct 60
gtggagaacc ctgctgcgga ggaagagggt cttaggttgc tcgccggcgc agcctccgca 120
cggtctggat ccagtgcggg aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg agaacctgag 180
ggccggtctg gatcctcaaa cggaattgta actgaacctg accccgaaga gggtactagc 240agtgggcaaa ggggggagaa aaggaagtU gaaa"gacg gggcgg"tt tcU^ggag 300
ttaaccttga gtttaatgtc tcgttgttat cctgagtctg tctggtgggc tgatttggaa 360
gatgagttta aaaatggaaa catgaatctt ttatacaagt atggatttga acagctgaaa 420
acacattgga tggagccttg ggaggactgg gaactagctt tgaaUtgtt tgccaaagtg 480
gctcttcgcc cagacactat ttataccatt aagaaaactg ttaatatacg taaatgtgcc 540
tatgtaattg gaaatggagc cgtggttaga ttccaaacct ttgaccgggt ggtttttaac 600
tgtgcaatgc agagtttagg tcctggggtg attggtatga gcggggtaac atttaataat 660
gtcagatttg cagcagatgg atttaatggc aaggtgtttg cttctaccac tcaattaact 720
ttgcatggtg tgttttttca aaattgcagc ggtgtttgcg tggattcctg gggtagggtg 780
tctgccagag gttgUcgtt tgtgggatgt tggaaagggc tggtggggca aaacaagagc 840
caaatgtctg taaaaaaatg tgtgtttgaa cgatgcattt tggctatggt ggtagaaggc 900
caggcgcgaa ttcgacataa tgcgggttcc gaaaatgtgt gctttttact gctgaaggga 960
actgccagtg ttaagcataa tatgatttgt ggcactggtc actctcagct gctaacttgc 1020
gcagatggaa actgtcagac tctaeiaagtg attcatgtgg tttcccatca gcgccgcccc 1080
tggcctgttt ttgagcataa catgcttatg cgttgtacca tgcatttggg ggctcgtcgt 1140
ggcatgtttt ctccatatca gagtaatttt tgccatacta aagttttaat ggaaactgat 1200gctttttcgc gggtgtggtg gagcggggtg tttgatttga ccatagagct gtataaagtg 1260
gtgagatatg "gagttaaa ggctcgttgt cgcccctgtg agtgtggagc caatcacatc 1320
aggttatatc cagcaactct gaacgtgacg gagcagctgc gcacggacca tcagatgttg 1380
tcgtgtcttc gcaccgacta cgaatccagc gatgaggatt 1422
<210> 2
<211> 36
<212> DM <213>人工序列
<400〉 2
gcgggttaat taacaaaaag cttgttgaga gcgccc 36
<210> 3
<211> 36
<212> 画
<213> 人工序列
<400> 3
ccccgtatsc gtttaaacca tc"caataa tatscc 36
<210> 4
<211> 35
<212〉 DM
<213> 人工序列<400> 4
cccgaattcg "gttgtcgt gtcttcgcac cgact 35
<210> 5
<211> 36
<212> DNA <213>人工序列
<400> 5
ctttttgtta attaacccgc atgcatcctt cccaac 36
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcccggatcc cgagcggtat cagctcactc aaag 34
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gccccgcgcg caaactggaa caacactcaa ccctat 36 <210〉 8<211> 48 <212> 腿 <213〉 人工序列
<400> 8
cgcgcaaggg gaagagctcg ggaaggggaa ttcggagaag ggtatacc 48
<210> 9
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gatcggtata cccttctccg aattcccctt cccgagctct tccccttg 48
<210> 10
<211〉 42
<212> ■
<213> 人工序列
<400> 10
ccccgcgcgc gtttaaacca tcatcaataa tataccttaa ag 42
<210> 11
<211〉 33
<212〉 DNA
<213> 人工序列
<400> 11ccccgagctc gtggcEigtgc cacgtaggga aac 33
<210〉 12
<211> 35
<212> DM
<213> 人工序列
<權> 12
ccccgagctc taatagtaat caattacggg gtcat 35
<210> 13
<211> 35
<212> ■
<213> 人工序列
<權> 13
ccccgaattc taagatacat tgatgagttt ggaca 35
<210> 14
<211> 32
<212> DM
<213> 人工序列
<權> 14
gcccaagctt atggagcgcc caaacccatc tg 32
<210> 15 <211〉 36
19<212〉 DM
<213> 人工序列
<400> 15
gccctctaga tacccttaat cctcatcgct ggattc 36
<210> 16
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ggccagatct gctaccggtc gccaccatgg tgag
<210> 17
<211> 35
<212> ■
<213> 人工序列
<400> 17
gccgtcgact tagagtccgg acttgtacag ctcgt
34
3权利要求
1.一种复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统，包括一个骨架质粒、一个穿梭质粒和一个包装细胞系，其中所述骨架质粒含有缺失了腺病毒包装所需基因编码区的腺病毒Ad41基因组；其中所述穿梭质粒含有用于插入目的基因的多克隆位点以及用于与骨架质粒发生同源重组的腺病毒Ad41基因组片段；其中所述包装细胞系在细胞基因组中整合了所述腺病毒Ad41包装所需基因并能稳定表达该包装基因。
2. 权利要求1所述的复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统，其 中所述腺病毒包装所需基因为El区基因(SEQIDNO: 1)。
3. 权利要求2所述的复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统，其 中所述骨架质粒为pAdbone41,所述骨架质粒pAdbone41依次含有 pBR322的复制起点、氨爷青霉素抗性基因以及Ad41基因组E1B55K 编码区下游全部序列，包括E1B55KCDS内侧3，端46个核苷酸。
4. 权利要求3所述的复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统，其 中所述穿梭质粒为pSh41-CMV,所述穿梭质粒pSh41-CMV依次含有 pBR322的复制起点、卡那霉素抗性基因、巨细胞病毒启动子、多克隆 位点、猴病毒40的多聚腺苷酸加尾信号和用于与骨架质粒pAdbone41 发生同源重组的左臂和右臂。
5. 权利要求l-4任一项的复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统， 其中所述包装细胞系为在293细胞基因组中整合有Ad41 E1B55K基 因并且能够稳定表达该E1B55K基因，控制Ad41 E1B55K表达的启动 子为巨细胞病毒启动子，其mRNA加尾信号为牛生长激素基因的 polyA加尾信号。
6. 权利要求5所述的复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统，其 中所述骨架质粒pAdbone41中，在Ad41基因组右侧末端添加有一个 限制性内切酶Pmel酶切位点GTTTAAAC。
7. 权利要求6所述的复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统，其 中所述穿梭质粒pSh41-CMV中，在能够与骨架质粒pAdbone41发生 同源重组的右臂和左臂序列之间含有一个限制性内切酶Pacl的识别 位点TTAATTAA，并且在Ad41基因组左侧反向重复序列左侧末端添加有一个限制性内切酶Pmel的识别位点GTTTAAAC。
8. 权利要求7所述的复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统，其 中所述包装细胞系的保藏号为CGMCC No.2534。
9. 权利要求l-4任一项的载体系统用于制备重组腺病毒的用途。
全文摘要
本发明涉及基因治疗和重组疫苗领域中一种复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统及其应用。具体而言，本发明提供的载体系统包括1个骨架质粒、1个穿梭质粒和1个包装细胞系，其中所述骨架质粒含有缺失了腺病毒包装所需编码区的腺病毒Ad41基因组，所述穿梭质粒含有用于插入目的基因的多克隆位点以及用于与骨架质粒发生同源重组的腺病毒Ad41基因组片段，所述包装细胞系在细胞基因组中整合了所述腺病毒Ad41包装所需基因并能稳定表达该包装基因。本发明产生的重组Ad41病毒在肠道基因治疗和口服重组疫苗研究中有广阔的应用前景。
文档编号C12N15/861GK101619324SQ20081012685
公开日2010年1月6日 申请日期2008年7月1日 优先权日2008年7月1日
发明者屈建国, 涛 洪, 鲁茁壮 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所