用于治疗癌症的嵌合腺病毒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及具有治疗用途的溶瘤腺病毒。本发明提供了重组嵌合腺病毒以及生产它们的方法。本发明的嵌合腺病毒包含衍生自B至F亚群分类的腺病毒血清型的核酸序列，并显示出提高的治疗指数。
【专利说明】用于治疗癌症的嵌合腺病毒
[0001] 本申请是申请日为2005年5月24日的第201210135656. 5号发明名称为"用于治 疗癌症的嵌合腺病毒"的中国专利申请的分案申请。
[0002] 本申请要求2004年5月26日提交的序列号为60/574, 851的美国临时申请的优 先权，该申请在此通过引用并入本申请。
【技术领域】
[0003] 本发明通常涉及分子生物学领域，更具体地本发明涉及具有治疗应用的溶瘤腺病 毒。
【背景技术】
[0004] 在美国和其它地区，癌症是死亡的主要原因。根据癌症的类型，典型地采用外科手 术、化疗和/或放射进行治疗。这些治疗通常失败，显然需要有新的治疗手段进行单独使用 或与传统技术结合使用。
[0005] -种方法是使用腺病毒，单独使用或作为能够给肿瘤细胞输送抗-癌治疗蛋白的 载体。腺病毒是无包膜二十面体双链DNA病毒，具有大约36千个碱基对的基因组。该病毒 基因组的每一末端具有已知的反向末端重复（ITR)短序列，其实病毒复制所必需的。迄今 为止检测到的所有人类腺病毒基因组具有相同的总体结构；即，编码特定功能的该基因定 位于病毒基因组的相同位置。所述病毒基因组含有5个早期转录单位（E1A、E1B、E2、E3和 E4)、2个延迟早期单位（IX和Iva2)和1个被加工产生5个家族的晚期mRNAs (L1-L5)的晚 期单位(主要晚期)。由早期基因编码的蛋白质参与复制，而晚期基因编码病毒结构蛋白质。 所述病毒基因组的一部分可以用外源DNA容易地进行取代，且重组腺病毒在结构上是稳定 的，这些特性使得这些病毒对基因治疗具有潜在用途（参见Jolly, D. (1994) Cancer Gene Therapy 1:51-64)。
[0006] 目前，致力于产生临床上有用的腺病毒治疗的研究已聚焦于腺病毒血清型，Ad5。 这一人类腺病毒的遗传学被很好地表征，对其进行分子操纵的系统也被充分地描述。大量 生产方法已经被开发以支持临床应用，可获得一些关于该制剂的临床经验，参见，Jolly，D. (1994)Cancer Gene Therapy, 1:51-64。涉及人类腺病毒（Ad)在癌症治疗中的应用的研究 已聚焦于开发基于Ad5的腺病毒，该腺病毒在特定的肿瘤细胞类型中有更效价或者优先靶 向特定的肿瘤细胞类型；且如果要想使得腺病毒治疗在临床上得到实际应用，则存在产生 更有效的溶瘤病毒的需求。
[0007] Ad5仅仅是51种目前已知的腺病毒血清型中的一种，基于不同的特性包括红 血球凝聚特性其被分类为亚群A至F(参见，Shenk, "Adenoviridae:The Viruses and Their Replication,，'Fields Virology, Vol. 2, Fourth Edition, Knipe, ea. , Lippincot t, Williams & Wilkins, pp. 2265-2267 (2001))。这些血清型在多个水平上不同，例如在 人类和啮齿动物中的病理学、用于附着的细胞受体，但是这些区别在很大程度上被忽略了 其可作为开发更有效的溶瘤腺病毒的潜在方法（除纤维蛋白改变（fiber alterations) 夕卜，参见 Stevenson et al. (1997)J. Virol. 71:4782-4790;Krasnykh et al. (1996) J. Virol. 70:6839-6846 ；ffickham et al. (1997)J.Virol.71:8221-8229;Legrand et al. (2002)Curr. Gene Ther. 2:323-329 ；Barnett et al. (2002)Biochim. Biophys. Acta 1-3:1-14;美国专利申请 2003/0017138)。
[0008] 对腺病毒血清型间的差异的利用可以为利用具有增强的选择性和效价的新的腺 病毒的更有效的基于腺病毒的疗法提供来源。存在对这种改良的基于腺病毒的治疗的需 求。
【发明内容】
[0009] 本发明提供了对基于病毒的治疗有用的新的嵌合腺病毒或其变体或衍生物。特别 地，本发明提供了具有包含E2B区域的基因组的嵌合腺病毒或其变体或衍生物，
[0010] 其中所述E2B区域包含衍生自第一种腺病毒血清型的核酸序列和衍生自第二种 腺病毒血清型的核酸序列；
[0011] 其中所述第一种和第二种腺病毒血清型分别选自腺病毒亚群B、C、D、E或F，且彼 此间不相同；以及，
[0012] 其中所述嵌合腺病毒是溶瘤的，并对肿瘤细胞显示出提高的治疗指数。
[0013] 在一个实施方式中，所述嵌合腺病毒还包含编码纤维蛋白、五邻体蛋白和六邻体 蛋白的区域，其中编码所述蛋白的核酸均来自相同的腺病毒血清型。在另一个实施方式中， 本发明的嵌合腺病毒包含经修饰的E3或E4区域。
[0014] 在另一个实施方式中，所述嵌合腺病毒在结肠肿瘤细胞、乳腺肿瘤细胞、胰腺肿瘤 细胞、肺肿瘤细胞、前列腺肿瘤细胞、卵巢肿瘤细胞或造血肿瘤细胞中显示出提高的治疗指 数。在一个特别优选的实施方式中，所述嵌合腺病毒在结肠肿瘤细胞中显示出提高的治疗 指数。
[0015] 在一个优选的实施方式中，所述嵌合腺病毒的E2B区域包含SEQ ID NO: 3。在一个 特别优选的实施方式中，所述嵌合腺病毒包含SEQ ID NO: 1。
[0016] 本发明提供了具有包含E2B区域的基因组的重组嵌合腺病毒或其变体或衍生物，
[0017] 其中所述E2B区域包含衍生自第一种腺病毒血清型的核酸序列和衍生自第二种 腺病毒血清型的核酸序列；
[0018] 其中所述第一种和第二种腺病毒血清型分别选自腺病毒亚群B、C、D、E或F，且彼 此不相同；
[0019] 其中所述嵌合腺病毒是溶瘤的，并对肿瘤细胞显示出提高的治疗指数；以及
[0020] 其中所述嵌合腺病毒已通过缺失选自El、E2、E3或E4的一或多个编码参与腺病毒 复制的蛋白质的腺病毒区域而成为复制缺陷型。
[0021] 在一个实施方式中，本发明的嵌合腺病毒还包含一种编码治疗性质蛋白质的异源 基因，其中所述异源基因在被所述腺病毒感染的细胞中表达。在一个优选的实施方式中，所 述治疗性蛋白质选自由细胞因子和趋化因子、抗体、前体药物转化酶和免疫调节蛋白质所 组成的组。
[0022] 本发明提供了将本发明的嵌合腺病毒用于治疗目的的方法。在一个实施方式中， 所述嵌合腺病毒可被用以抑制癌细胞的生长。在一个特定的实施方式中，包含SEQ ID NO: 1 的嵌合腺病毒被用于抑制结肠癌细胞的生长。
[0023] 在另一个实施方式中，本发明的嵌合腺病毒作为将治疗蛋白输送给细胞的载体是 有用的。
[0024] 本发明提供了用于制备本发明的嵌合腺病毒的方法，其中该方法包括：
[0025] h)集合代表腺病毒亚群B至F的腺病毒血清型，从而产生腺病毒混合物；
[0026] i)将来自步骤（a)的集合的腺病毒混合物在肿瘤细胞的活跃生长培养物中，以高 至足以促进血清型之间发生重组但没有高至产生过早细胞死亡的颗粒/细胞比率进行传 代；
[0027] j)从步骤（b)收获上清；
[0028] k)用在步骤（C)中收获的上清感染肿瘤细胞的静止培养物；
[0029] 1)在出现任何细胞病变（CPE)的迹象之前，从步骤（d)中收获细胞培养物上清；
[0030] m)用在步骤（e)中收获的上清感染肿瘤细胞的静止培养物；和
[0031] η)通过空斑纯化从在步骤（f)中收获的上清中分离所述嵌合腺病毒。
【专利附图】
【附图说明】
[0032] 图I :Ad在TMAE HPLC柱上的保留时间图。A)用以产生原始的起始病毒池的各Ad 血清型的保留图。B)分别衍生自HT-29、Panc-l、MDA-231和PC-3细胞系的20代传代池的 保留图。
[0033] 图2 :各病毒池的细胞溶解活性。用各自的病毒池以VP/细胞比率为100-0. 01感 染A) HT-29、B) MDA-231、C) Panc-I和D) PC-3细胞。根据不同的细胞系在感染后的不同天数 (如图所标示）进行MTS检测。图面中的每一数据点代表一次一式四份的检测，结果以平均 值+/_标准差表示。每一图面描述了一个代表性的试验，且至少在3个独立的时间对全部 病毒池的靶肿瘤细胞系进行检测（图例：一?一Ad5、一▽一初始病毒池、一一衍生自 池的特定细胞，20代）。
[0034] 图3 =ColoAdl和Ad5对人肿瘤细胞系的细胞溶解活性。对A) -大组人肿瘤细胞 系，和B) -组人结肠癌细胞系进行MTS检测以测定其潜在的效价特异性。根据不同的细胞 系在不同天数进行所述MTS检测。每一图面是重复了至少3次的一个代表性试验。图面 中的每一数据点代表一次一式四份的检测，结果以平均值+/_标准差表示（图例：一?一 Ad5、-▽-ColoAdl)。
[0035] 图4 =ColoAdl和Ad5对一组指出细胞的细胞溶解活性。用ColoAdl和Ad5以VP/ 细胞比率为100-0. 01感染HS-27、HUVEC和SAEC细胞（分别为原始成纤维细胞、内皮细胞 和上皮细胞）。根据不同的细胞在感染后的不同天数进行MTS检测，每一图面是重复了至 少3次的一个代表性试验。图面中的每一数据点代表一次一式四份的检测，结果以平均值 +/-标准差表不（图例：一·一Ad5、一V一ColoAdl)。
[0036] 图5 :ColoAdl、Ad5和0NYX-015对原始正常内皮细胞（HUVEC)和结肠肿瘤细胞系 (HT-29)的细胞溶解活性。每一图面是重复了至少3次的一个代表性试验。图面中的每一 数据点代表一次一式四份的检测，结果以平均值+/_标准差表示（图例：一?一Ad5、一 V一ColoAdK 一一Onyx-015) 〇
[0037] 图6 :ColoAdl、Adllp和Ad5对正常上皮细胞系（SAEC)和人结肠癌细胞系（HT-29) 的细胞溶解活性。每一图面是重复了至少3次的一个代表性试验。图面中的每一数据点 代表一次一式四份的检测，结果以平均值+/-标准差表示（图例：一?一Ad5、一▽一 Adllp、--ColoAdl)。
[0038] 图7 :重组病毒的细胞溶解活性。按照实施例6的记载构建代表4个病毒群 体（Adpll、ColoAdl、左端 Adllp/ 右端 ColoAdl (ColoAdL 1)和左端 ColoAdl/ 右端 Adllp (ColoAdL 2))的重组病毒。每一群体在HT29细胞中的溶解活性按照先前的描述进 行测定。（图例：一籲一Ad5、一V-Adllp、一 - ColoAdK -ColoAdL 1、一▲- ColoAdL 2)。
【具体实施方式】
[0039] 说明书中所提及的所有出版物，包括专利和专利申请，在此通过引用完整地合并 入本发明，相当于每一份单独的出版物被特别地和单独地指出通过引用以其整体合并入本 发明。
[0040] 定义
[0041] 除非特别说明，本申请所使用的全部技术和科学术语的含义与本发明所属技术领 域的普通技术人员通常理解的含义相同。一般地，本申请所使用的术语和下面描述的试验 方法是在本领域中广泛已知和普遍应用的。
[0042] 本申请所用术语"腺病毒"、"血清型"或"腺病毒血清型"指目前已知的51 种人类腺病毒血清型或将来分离的人类腺病毒血清型中的任何一种。参见，例如 Strauss, "Adenovirus infections in humans，'，The Adenoviruses, Ginsberg, ea. ,Plenum Press，New York，NY，pp. 451-596 (1984)。这些血清型被分类于 A至 F亚群 中（参见，Shenk, ^Adenoviridae:The Viruses and Their Replication，'，Fields Virology,Vol. 2,Fourth Edition,Knipe, ea. ,Lippincott Williams & Wilkins, pp. 2265-2267, 2001)，如表 I 中所示。
[0043] 表 I
[0044]
【权利要求】
1. 复制型溶瘤腺病毒血清型11，其中E3转录单位区域和/或E4orf4基因包含缺失， 且其中所述腺病毒具有提高的治疗指数。
2. 权利要求1的复制型溶瘤腺病毒血清型11，其中所述的E3缺失对应于SEQ ID NO: 2 的27979-30423位碱基对的缺失。
3. 权利要求1或2的复制型溶瘤腺病毒血清型11，其中所述的E4orf4缺失对应于SEQ ID NO:2的33164-33189位碱基对的缺失。
【文档编号】C12N7/00GK104263703SQ201310565451
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2005年5月24日 优先权日:2004年5月26日
【发明者】保罗·哈登, 特丽·赫米斯顿, 艾琳·库恩 申请人:普西奥克瑟斯医疗有限公司