一株海洋产过氧化氢酶菌及利用该菌产过氧化氢酶的方法
【专利摘要】本发明提供了一株来源于海洋的高产过氧化氢酶寡养单胞属菌株(Stenotrophomonasmaltophilia)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC?No.8294，保藏日期2013年10月8日。该菌株生长迅速、条件简单，底物范围广泛。以该菌为出发菌种，经发酵培养之后制作的粗酶品，其最高过氧化氢酶酶活力和比酶活分别可达50000U/mL和200000U/mg以上。该工艺步骤简单，成本低廉，得到的产品酶活力高。过氧化氢酶可广泛应用于食品、纺织、造纸、工业废水处理等领域，属于海洋生物工程【技术领域】。
【专利说明】一株海洋产过氧化氢酶菌及利用该菌产过氧化氢酶的方法【技术领域】
[0001]本发明属于海洋生物工程【技术领域】，具体涉及一株来自海洋的过氧化氢酶高产菌株及其利用该菌发酵生产过氧化氢酶的方法。
【背景技术】
[0002]过氧化氢酶(Catalase，ECl.11.1.6)是一种酶类清除剂，又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶。它可促使过氧化氢分解为分子氧和水，是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，存在于细胞的过氧化物体内。由于过氧化氢具有较强的氧化和漂白的功能，因此过氧化氢酶和过氧化氢作为组合在印染、造纸、环保和电子工业等领域具有较大的研究和应用价值。
[0003]研究发现，几乎所有的生物细胞内都含有过氧化氢酶。但目前用于生产过氧化氢酶的主要是动物的肝脏和微生物发酵。动物肝脏破胞提取的方法由于受到原材料限制，导致成本过高。而利用微生物发酵的方法，其优势在于成本较低，而酶产量较大。
[0004]海洋特殊的生态环境，孕育了大量的微生物和酶资源。目前授权的细菌发酵产过氧化氢酶专利的菌株多数分离于土壤样品。而仅中国专利200810057969.7和201310022577.8提供了两种分离自海洋的过氧化氢酶产酶菌株，并且其过氧化氢酶酶活力和比酶活都较低，分别为1200U / mg和10000U / mg。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是提供一种能够高产过氧化氢酶的菌株。
[0006]本发明提供的菌株，分类学命名为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为=CGMCC N0.8294，保藏日期2013年10月8日。
[0007]本发明所述的菌株CGMCC N0.8294特性如下:
[0008](I)生长限制因子:温度20_40°C (最适30°C )，ρΗ7.0-9.0 (最适7.5)，盐度0-3.5% (w / V，最适 2.0% )；
[0009](2)菌落形态:菌落呈圆形，表面光滑，边缘平整，微凸起，物色透明；
[0010](3)细胞形态:革兰氏阴性杆菌，在显微镜下呈现运动性，端生单鞭毛；
[0011](4)生理生化特性:好氧生长；触媒活性、氧化酶活性为阳性；对青霉素、万古霉素、链霉素、红霉素、氣霉素、卡那霉素、新霉素等多种抗生素敏感。
[0012](5)主要含有的脂肪酸为饱和脂肪酸iso-C15:Q，anteiso-C15:0, C16:(l。
[0013]利用通用引物对菌株CGMCC N0.8294的16S rRNA基因进行扩增和序列测定，得到长度为737bp的基因片段(Seq ID N0.1)，其序列具体见序列表。将其与细菌16S rRNA基因序列数据库进行比对，得到其与已知的嗜麦芽寡养单胞菌属的标准菌株S.maltophilia的相似性为99.32%，并且菌株CGMCC N0.8294的生长限制因子、细胞形态和主要脂肪酸都与其对应特征保持一致，因此，这两株菌为同种不同菌株。参照《Bergey’ s Manual ofSystematic Bacteriology))第二版的内容,根据菌株限制因子特点、形态特征和生理生化指标，结合16S rRNA基因序列相似性，鉴定菌株CGMCC N0.8294为嗜麦芽寡养单胞菌(S.maltophilia)。
[0014]本发明的另一目的是提供一种利用所述的菌株CGMCC N0.8294生产过氧化氢酶的方法。
[0015]采用S.maltophilia CGMCC N0.8294 生产过氧化氢酶，以 CGMCC N0.8294 菌株为出发菌种，经种子液培养和液体发酵得到过氧化氢酶，包括以下步骤:
[0016](I)将菌株CGMCC N0.8294接种至种子液培养基，培养之后的菌液作为种子液；
[0017](2)将种子液转接至发酵培养基中进行发酵培养，培养2天之后即得到具有过氧化氢酶活性的发酵液。
[0018]上述方法步骤(1)中，所述的天然海水培养基的配方为天然海水中加入0.1-0.5%的蛋白胨、0.01-0.1 %的酵母提取物以及0.1-0.5%的酪蛋白氨基酸，调节pH为
6.8-7.5。
[0019]一个优选的实施例中，天然海水液体培养基为天然海水中加入0.5%的蛋白胨，
0.1 %的酵母提取物，0.5%的酪蛋白氨基酸，调节pH为7.5。
[0020]步骤(1)中细菌培养时间为36-48小时，优选40_45小时；培养温度为20_40°C，优选 30-35 °C。
[0021]上述方法步骤(2)中的发酵培养基配方为天然海水中加入0.1-2%的葡萄糖和
0.5-5%的蛋白胨，pH为6.5-7.5。一个优选的实施例中，发酵培养基配方为天然海水中加入1-2%的葡萄糖和1-2%的蛋白胨，pH为7.0-7.5。培养时间为36-48小时，优选40-48小时；培养温度为20-40°C，优选30-35°C。
[0022]根据上述方法可获得过氧化氢酶活力和比酶活分别为10000-50000U / mL和100000-200000U / mg的发酵液，在一个优选的实施例中酶活力分别达53228U / mL和181987.22U / mg。
[0023]根据需要，可任选对具有酶活力的发酵液进行处理，从中分离纯化出过氧化氢酶的产物，优选的分离纯化条件如离子交换层析、反相层析、疏水层析、分子筛层析或其组合。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为嗜麦芽寡养单胞菌(S.maltophilia) CGMCC N0.8294的单碳源实验结果。
[0025]图2为嗜麦芽寡养单胞菌(S.maltophilia) CGMCC N0.8294的单氮源实验结果。
【具体实施方式】
[0026]实施例1嗜麦芽寡养单胞菌(S.maltophilia) CGMCC N0.8294的分离筛选和酶活力的测定。
[0027]采集含有过氧化氢的废水样品，先采用海生菌肉汤2216液体培养基培养得到对数期菌液。海生菌肉汤2216液体培养基的配方为IL去离子水中加入硫酸镁6.64g，氯化钠19.45g，氯化镁12.6g，氯化钾0.55g，氯化钙1.8g，氟化钠2.4mg,硅酸钠9.3mg,硝酸铵
2.4mg,磷酸氢二钠8mg,磷酸二氢钾0.4g,碳酸氢钠0.16g,溴化钾0.08mg,硼酸22mg,氯化锶57mg，柠檬酸铁0.lg，酵母抽提物(Difco) lg，蛋白胨5g，调节pH为7.5。再将对数期菌液接入含有过氧化氢的液体培养基中进行培养，观察其生长状况。假若生长良好，则接种至较高过氧化氢浓度的液体培养基中进行培养；假若生长不好，则接种至较低过氧化氢浓度的液体培养基中，接着再观察其生长状况，以确定接下来接种的培养基其过氧化氢浓度是降低还是升高。如此循环往复，直至培养基的过氧化氢含量到达20-200mM。再经平板稀释涂布分离，挑取单克隆进行保存。
[0028]将保存下来的菌体分别接入含海生菌肉汤2216液体培养基的摇瓶中，30°C培养40小时。将培养得到的菌液12000rpm离心5分钟收集得到菌体，以pH7.0，50mM磷酸盐缓冲液重悬菌体并在冰浴中超声破碎。破碎后的液体以6500g离心20分钟，取上清液为粗酶液，对其进行过氧化氢酶活力测定，得到此粗酶液的酶活力大小(U / mL)。
[0029]过氧化氢酶活力采用分光光度法测量，利用了过氧化氢在240nm下的吸光值与其浓度的线性关系。具体操作为将细胞液进行破胞处理得到粗酶液，利用粗酶液与过氧化氢反应时，吸光值的下降率作为依据计算粗酶液的酶活大小，具体公式:Aod24ciXioooX稀释倍数X反应体系体积/ ( Λ t X 43.6 X酶液体积)，43.6M—1 ^cnT1为H2O2在240nm下的摩尔消光系数。
[0030]蛋白质浓度定量:(1)标准曲线的制作:取6支5mL离心管，分别加入0、5、10、20、30、40、50 μ L和定量的考马斯亮蓝G-250试剂。放置6分钟后在595nm波长下比色测定。利用Excel表格软件，以蛋白含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线，并得到标准曲线的公式。(2)蛋白质含量测定:取I支5mL离心管，准确加入50yL粗酶液样品，再加入定量的考马斯亮蓝G-250试剂，放置2分钟后比色，记录吸光度，根据标准曲线公式计算得到粗酶液样品的蛋白含量。(3)酶活力计算:将得到的酶活(U / mL)除以蛋白含量(μ g / mL) X 1000,即得到此粗酶液的比酶活大小(U / mg)。
[0031]通过以上方法，得到一株高产过氧化氢酶的菌株，其粗酶活力和比酶活最高分别能达到53228U / mL和181987.22U / mg。其菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为=CGMCC N0.8294。
[0032]实施例2寡养单胞属菌株(S.maltophilia) CGMCC N0.8294的形态鉴定及生物学特性
[0033]寡养单胞属菌株(S.maltophilia) CGMCC N0.8294接种于天然海水液体培养基中，若制备固体培养基可再加入20g / L的琼脂。培养30小时后，进行鉴定，该菌具有以下特征:(1)菌落形态:菌落呈圆形，表面光滑，边缘平整，微凸起，无色透明；(2)细胞形态:革兰氏阴性菌，细胞显微镜下(Olympus，BX40)呈现运动性，形态为杆状；(3)生理生化特征:好氧生长；氧化酶阳性；能利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖等多种简单有机物以及牛肉膏、蛋白胨、干酪素和鱼粉等复合有机物；对青霉素、万古霉素、链霉素、红霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素等多种抗生素敏感。
[0034]实施例3寡养单胞属菌株(S.maltophilia) CGMCC N0.8294的16S rRNA基因的PCR扩增与序列测定
[0035]寡养单胞属菌株(S.maltophilia) CGMCC N0.8294接种于天然海水固体培养基中，从斜面中直接挑取菌体，加入200 μ L无菌水并充分悬浮菌体，沸水浴30分钟，立即冰浴30分钟，然后12000rpm离心2分钟，上清液作为模板进行PCR。扩增16S rRNA基因的一对通用引物如下:
[0036]正向引物:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ；
[0037]反向引物:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’ ；
[0038]上述引物分别对应大肠杆菌的16S rRNA基因的第8-27和1510-1492位碱基。PCR反应体系(50 μ L)为:10Xbuffer5y L，IOmM dNTPsl μ L，4 μ M 引物各 I μ L，Taq 酶 0.5 μ L，DNA模板0.5 μ L，无菌纯水42 μ L。PCR反应条件为:94°C预变性10分钟；94°C变性45秒，55°C退火45秒；72°C延伸90秒，35个循环；72°C后延伸10分钟。PCR产物纯化与序列测定由上海英骏生物技术有限公司完成。完成测定的16S rRNA基因部分片断长度为737bp，与菌株 S.maltophilia 41^013637^^163 rRNA 基因序列相似性最高。菌株 S.maltophiliaCGMCC N0.8294的16S rRNA序列具体可见序列表Seq ID N0.1。
[0039]因此，参照《Bergey’sManual ofSystematic Bacteriology》第二版内容，根据菌株的限制因子、形态特征和生理生化指标特点，结合16S rRNA基因序列相似性，鉴定CGMCCN0.8294为嗜麦芽寡养单胞菌(S.maltophilia)。
[0040]实施例4发酵培养基优化
[0041]嗜麦芽寡养单胞菌(S.maltophilia) CGMCC N0.8294接种至天然海水液体培养基，30°C培养30小时达到对数生长末期得到种子液。以I %的转接量转接至装有50mL只含有单碳源或单氮源的基础培养基进行培养。培养温度30°C，摇床转速200rpm，培养24小时之后，用分光光度计进行测量，利用菌液在600nm波长下的吸光值与细胞浓度的线性关系，以吸光值的大小反映菌株的生长状况。基础培养基的配方为去离子水中加入0.01%的酵母提取物。进行测试的碳源有葡萄糖、蔗糖、麦芽浸膏、淀粉和麦芽糖；氮源有酵母浸膏、牛肉膏、干酪素、蛋白胨、尿素和鱼粉。具体结果见图1、2。结果显示，嗜麦芽寡养单胞菌CGMCCN0.8294以葡萄糖、麦芽糖和·蔗糖为碳源，菌株的生长状况最为良好。加上原料的价格因素进行综合考虑，决定选用蔗糖为菌株发酵培养基的唯一碳源。在氮源的利用方面，菌株CGMCC N0.8294利用有机氮源的能力远强于无机氮源，以鱼粉和蛋白胨作为氮源物质时生长得最好，这可能是因为有机氮源中除含有丰富的蛋白质、多肽和游离的氨基酸外，往往还含有少量的糖类、脂肪、无机盐、维生素及某些生长因子，因而相对于无机氮源更有利于菌体生长。由于鱼粉成分的不稳定性，综合考虑决定采用蛋白胨作为菌株发酵培养基的唯一氮源。
【权利要求】
1.一株寡养单胞属菌株(S.maltophilia)及其突变体，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为=CGMCC N0.8294。
2.根据权利要求1所述的过氧化氢酶高产菌，其特征在于: (1)菌落形态:菌落生长成形后呈圆形，表面光滑，边缘平整，微凸起，无色透明； (2)细胞形态:革兰氏阴性菌，细胞形态为杆状，在显微镜下呈现运动性； (3)生理生化特征:好氧生长；在20-40°C、pH7.0-9.0、盐度0-3.5% (w / v)范围内均能生长，最佳生长条件在30°C、pH7.5、盐度2.0%左右；氧化酶阳性；能利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖等多种简单有机物以及牛肉膏、蛋白胨、干酪素和鱼粉等复合有机物。
3.根据权利要求1所述的过氧化氢酶高产菌，其特征在于:所述菌株的16s核糖体亚基基因(16s rRNA)序列包含如Seq ID N0.1所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于:所述突变体为对菌株CGMCCN0.8294原代进行诱变、驯化、基因重组等操作或者经自然突变而获得的突变体。
5.一种利用权利要求1所述的过氧化氢酶高产菌生产过氧化氢酶的方法，包括以下步骤: (1)将菌株CGMCC.N0.8294接种至种子液培养基，培养之后的菌液作为种子液； (2)将种子液转接至发酵培养基中进行发酵培养，得到具有过氧化氢酶活性的发酵液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述方法步骤(1)中的种子液培养基的配方为天然海水中加入0.1-0.5%的蛋白胨、0.01-0.05%的酵母提取物以及0.1-0.5%的酪蛋白氨基酸，调节PH为6.8-7.5。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述方法步骤(2)中的发酵培养基配方为天然海水中加入0.1-1%的葡萄糖和0.5-5%的蛋白胨，pH为6.5-7.5。
8.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于:所述方法步骤(2)最后获得发酵液中的过氧化氢酶活力和比酶活分别为10000-50000U / mL和100000-200000U / mg。
9.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于:根据需要，可任意选取方法对具有酶活力的发酵液进行后续处理，从中分离纯化出过氧化氢酶产物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于:所述处理方法的分离纯化条件为离子交换层析、反相层析、疏水层析、分子筛层析或其以上组合。
【文档编号】C12N9/08GK103789225SQ201310565472
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2013年11月8日 优先权日:2013年11月8日
【发明者】潘杰, 吴敏, 许学伟, 霍颖异, 张文武 申请人:浙江大学