一种基于羟基选择性固定法制备的纳米酶反应器及其制备方法和应用
【专利说明】-种基于超基选择性固定法制备的纳米酶反应器及其制备方 法和应用 【技术领域】
[0001] 本发明属于有机污水的生物酶处理技术领域，具体设及一种基于径基选择性固定 法制备的纳米酶反应器及其制备方法和应用。 【【背景技术】】
[0002] 氯过氧化物酶(CP0)是从海洋真菌化Idariomyces fumago中分离出来的一种血红 素过氧化物酶(4化Da)XP0具有极为广泛的氧化活性，目前被认为是过氧化物酶家族中应 用最广泛的酶，但CP0在高溫、强酸、强碱、有机溶剂等极端反应环境中的稳定性较差，且不 易从反应环境中分离出来进行重复使用，为解决运一问题，常将酶固定化于载体的表面和 微孔中，保留其催化活性，并可回收及重复使用。传统的固定化方法一般W氨基酸残基上- N也或-C00H为固定化位点，但是运种方法容易使酶蛋白表面氨基酸的构象改变，对CP0的活 性造成一定程度的损失。
[0003] Ξ苯甲烧类染料是一种多苯环化合物，主要用于纺织品、皮革、染色剂等。运种染 料及其中间降解产物具有高毒素、高残留和致癌、致崎、致突变等副作用，进入环境，易造成 环境污染。由于此类染料结构复杂，目前对于处理方法主要为光降解和微生物降解法，但运 两种方法都存在处理浓度低(<50mg/L)，或反应时间长(从数十分钟到数十小时）的缺点，传 统的染料工业处理过程处理环节多，操作不便，时间长，成本高，吸附脱色具有只吸附染料， 但不破坏其结构的特点。高级氧化法脱色被认为是一种很有前途的方法，但其价格昂贵，并 且会带来二次污染。 【
【发明内容】
】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，提供一种基于径基选择性固定法 制备的纳米酶反应器及其制备方法和应用，本发明通过非催化活性基团将CP0固定于固相 载体中，最大程度保留酶的活性构象，使所制备的酶反应器具有非常高效的催化有机染料 降解能力。
[000引为了达到上述目的，本发明制备方法采用如下技术方案：
[0006] 包括W下步骤：
[0007] (1)取醋化的氧化石墨締分散在刀豆球蛋白溶液中，室溫下溫育1~1.化后经过分 离和清洗，得到氧化石墨締-刀豆球蛋白；其中醋化的氧化石墨締和刀豆球蛋白的质量比为 (4 ~5):(6 ~7);
[0008] (2)将氧化石墨締 -刀豆球蛋白分散到氯过氧化物酶溶液中，得到反应体系，调节 反应体系的pH值为2~6;其中氧化石墨締-刀豆球蛋白和氯过氧化物酶的质量比为(3~5): 1;将反应体系振荡直至氯过氧化物酶固定到氧化石墨締-刀豆球蛋白上，经过分离和清洗， 得到纳米酶反应器。
[0009] 进一步地，醋化的氧化石墨締是通过W下步骤制得的：
[0010] (a)首先向2-吗嘟乙横酸缓冲液中加入摩尔比为5:1的1-乙基-(3-二甲基氨基丙 基)碳二亚胺盐酸盐和N-径基班巧酷亚胺横酸钢盐，再加入氧化石墨締溶液，得到混合液， 其中，N-径基班巧酷亚胺横酸钢盐和氧化石墨締的质量比为(80~100): (40~50);
[0011] (b)将混合液揽拌均匀后进行离屯、处理，得到悬浮液，最后去除悬浮液中多余的N- 径基班巧酷亚胺横酸钢盐和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，得到醋化的氧 化石墨締。
[001引进一步地，步骤(a)中2-吗嘟乙横酸缓冲液的抑值为6.0,摩尔浓度为0.1臟01丄-1， 且每100~13化L的2-吗嘟乙横酸缓冲液中加入80~lOOug的N-径基班巧酷亚胺横酸钢盐； 氧化石墨締溶液的质量浓度为Img/mL步骤(b)中混合液在室溫下揽拌30~40min。
[0013] 进一步地，步骤（1)和步骤(2)中的分离均是在4°C，W1300化/min离屯、分离20~ 30min〇
[0014] 进一步地，步骤(2)中用憐酸缓冲液调节反应体系的pH值。
[0015] 进一步地，步骤(2)中的振荡是在0~35°C下振荡10~ISOmin。
[0016] 如上所述基于径基选择性固定法制备的纳米酶反应器。
[0017] 本发明纳米酶反应器催化降解有机染料的技术方案是:在憐酸缓冲溶液中依次加 入有机染料溶液、纳米酶反应器溶液和双氧水，其中，有机染料、纳米酶反应器和双氧水的 摩尔比为200mmol: (1~2)皿〇1: (250~300)mmol，反应20~90min，完成催化降解有机染料。
[0018] 进一步地，有机染料为Ξ苯甲烧类染料;在憐酸缓冲溶液中加入的有机染料溶液 的浓度为1mmol · [1，纳米酶反应器溶液中氯过氧化物酶的浓度为0.1皿01 · 1/1，双氧水的 浓度为2.5~3mmol · [1。
[0019] 进一步地，憐酸缓冲溶液的pH值为2~6，反应溫度在15~60°C。
[0020] 与现有技术相比，本发明具有W下有益的技术效果：
[0021] 本发明的制备方法是一种通过酶分子表面特定基团选择性固定制备高活性纳米 酶反应器的方法，选用表面易于功能化的醋化的氧化石墨締(GO)为固相载体，根据CP0表 面-OH为固定化位点;本发明使用的刀豆球蛋白作为凝集素，基于其对径基的特异性识别将 CP0固载在醋化的GO表面，与传统的W氨基酸残基上-N出或-C00H为固定化位点不同，选择- 0H为固定化位点，避免酶蛋白表面氨基酸构象改变而导致的纳米酶反应器的活性损失，审U 备了活性高的纳米酶反应器。
[0022] 本发明基于径基选择性固定法制备的纳米酶反应器，氧化石墨締是一种性能优异 的新型碳材料，具有大比表面积，表面易于功能化，水溶性好及良好的生物相容性等性能， 是固定酶的理想载体。CP0表面高度糖基化，含有大量的-OH，根据运一特点，选择-OH为固定 化位点，基于凝集素对径基的特异性识别完成CP0在醋化的GO表面的固载，避免因酶蛋白表 面氨基酸构象改变造成的酶活性的损失，且热稳定性强，更耐酸碱性，重复利用率高。
[0023] 本发明利用酶分子对染料进行降解，避免了化学法带来二次污染物的问题，W孔 雀石绿染料为模板进行脱色降解，稱色效果明显，酶用量小绿色环保，并且通过径基选择化 固定在很大程度上减少了固定化对酶活性的损失，使得反应器的催化效果非常好。本发明 的酶反应器应用在降解中可W大大的简化工业处理步骤、缩短降解时间、提高了效率，对 CP0应用于Ξ苯甲烧类染料的绿色无公害处理具有重要的意义，在工业上具有可观经济效 益和广阔的应用前景。目前基于径基选择性固定法制备纳米酶反应器W及用于降解Ξ氯甲 烧类染料的方法还未见报道。该方法不但克服了固定化过程对氯过氧化物酶造成的活性损 失，而且使反应器具有较大的比表面积，处理效率高、操作稳定性好，使用方便，环境友好， 特别适用于Ξ苯甲烧类染料的工业降解处理。 【【附图说明】】
[0024] 图1 GO-ConA-Cro纳米酶反应器红外光谱图；
[002引图2 GO-ConA-CPO纳米酶反应器巧光显微镜图；
[0026] 图3不同抑条件下CP0的固载率；
[0027] 图4不同溫度条件下cro的固载率；
[0028] 图5不同时间条件下cro的固载率；
[0029] 图6孔雀石绿降解前后的紫外可见吸收光谱；
[0030] 图7溫度对游离酶、GO-ConA-Cro催化活性的影响；
[0031 ] 图8 pH对游离酶、GO-ConA-Cro催化活性的影响；
[0032] 图9 GO-ConA-CPO的重复使用次数。 【【具体实施方式】】
[0033] 本发明纳米酶反应器的制备及应用所采用的方案是由下述步骤组成：
[0034] -、Hummers法制备氧化石墨締(GO)<